CN109988728B - 植物内生放线菌cr22及其应用 - Google Patents

植物内生放线菌cr22及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物内生放线菌CR22及其应用，其分类命名为Streptomyces brunneus CR22，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No M2018897，保藏日期为2018年12月17日。本发明植物内生放线菌CR22具有抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、霉菌(包括黑曲霉、青霉等)的效果，其抑制效果明显；该链霉菌培养成本低，培养方法简单，繁殖快。

Description

植物内生放线菌CR22及其应用
技术领域
本发明涉及微生物，特别涉及一种植物内生放线菌CR22及其应用。
背景技术
植物内生放线菌是指那些在其生活史的一定或全部阶段生活于健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的放线菌。近年来，抗生素的滥用导致了细菌耐药性的不断增强，要想缓解这种现象的持续恶化，一是要禁止滥用抗生素类药物，二是急需发现新型的抗生素。放线菌一直是抗生素、酶及酶抑制剂等有用生理活性物质的主要产生菌。以往报道的抗生素产生菌大都来自于陆生土壤环境，但随着从陆生土壤放线菌中筛选到新型化合物几率的不断下降，人们已经将注意力开始转向了一些生活在特殊生境的放线菌，如盐碱地、海洋和植物内生等环境。已有研究表明，内生放线菌几乎存在于所有研究过的药用植物中，而且链霉菌属仍为药用植物内生放线菌中最大的类群，因此研究药用植物内生菌对于发现具有抑菌能力的内生放线菌具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够抑制细菌和霉菌的链霉菌新物种即植物内生放线菌CR22 及其应用。
本发明的植物内生放线菌，分类命名为Streptomyces brunneus CR22，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNo M2018897，保藏日期为2018年12月17日。
上述的植物内生放线菌CR22从湖南湘潭市境内采样，经分离培养获得，其培养条件为：
(1)培养基：采用改良的HVG培养基
具体配方为：腐殖酸0.5g，氯化钙(CaCl2)0.5g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)0.5g，硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.5g，氯化钾(KCl)1.7g，硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4；
(2)培养温度：28℃。
本发明Streptomyces brunneus CR22的分子分类地位的确定。
该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示：
ATTCACGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCAC TCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACCACTTCCACTCGCATGGGTGGGGGTTG AAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAG GCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTC CTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGA GGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCA GAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAA TTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCG GGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGA GCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAG GTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGG CCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTC GACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGGCCAGAGATGGTCGCCCCC TTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCC GCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGA CCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCT GCACACGTGCTACAATGGCAGGTACAATGAGCTGCGAAACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAG CCTGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGAT CAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTA ACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACCAGCGATTGGG ACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTA(SEQ ID N0.1)。
测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，从数据库获得相关种属的 16S rRNA序列，构建系统发育树。
基于16S rDNA序列的同源搜索表明，菌株CR22属于链霉菌属的成员，且与S.cyaneus NRRL B-2296T 、 S.shaanxiensis CCNWHQ 0031T 、 S.pseudovenezuelae DSM40212T 、 S.caeruleatus NRRL B-24802T 、 S.curacoi DSM 40107T 、 S.canus DSM40017T 、 S.griseoruber NRRL B-1818T 、 S.rishiriensis NBRC 13407T 、S.resistomycificus NRRL ISP-5133T 和 S. phaeoluteigriseus DSM 41896T 的 16SrRNA 序列同源性分别为 99.5 ％、 99.1 ％、 99.0 ％、 99.0 ％、 98.8 ％、 98.8 ％、98.8 ％、 98.8 ％、 98.7 ％和 98.7 ％。形态、生理生化特征比较表明，菌株 CR22 与上述密切相关的十株典型菌株存在明显的差异，其相关生物学特性比较如表 1 所示。系统发育分析表明，菌株 CR22 的系统发育邻居是 S.cyaneus NRRL B-2296T 和S.griseoruber NRRL B-1818T( 如图 2 所示 ) 。然而， 菌株CR22与它们(包括其它16SrDNA序列同源性≥98.7％的菌株)的基因组DNA的ANI(平均核苷酸一致性)值和dDDH(数字DNA杂交)或DDH值，分别远远低于种的分界线95～96％和70％(表2所示)。
基于以上分析，本发明的植物内生放线菌CR22是一种新的链霉菌，命名为Streptomyces brunneus CR22。
表1菌株CR22与其同源性最高的链霉菌菌株微生物学特性比较
Figure GDA0003181441590000031
注：+阳性；-阴性；W弱阳性
1.菌株CR22； 2.S.cyaneus NRRL B-2296T ； 3.S.shaanxiensis CCNWHQ 0031T ；4.S.pseudovenezuelae DSM 40212T ； 5.S.caeruleatus NRRL B-24802T ； 6,S.curacoiDSM 40107T ； 7.S.canus DSM 40017T ； 8.S.griseoruber NRRL B-1818T ；9.S.rishiriensis NBRC 13407T ； 10.S.resistomycificus NRRL ISP-5133T ； 11.S.phaeoluteigriseus DSM 41896T 。
表2 ANI值和dDDH值
Figure GDA0003181441590000032
Figure GDA0003181441590000041
上述的植物内生放线菌CR22，其微生物学特征总结如下：
A.形态特征
光学显微镜下，该菌株形成孢子直链；原子力显微镜下，该菌株孢子多，孢子直链，孢子短柱形，表面有刺(如图1所示)。
B.生理生化特征
CR22需氧，革兰氏阳性，接触酶阳性，ISP6液体培养基产类黑色素，产H2S，明胶液化，能水解淀粉，能还原硝酸盐；能利用D-核糖，D-果糖，D-棉子糖，D-海藻糖，D-木糖等。
C.其他特征
CR22细胞壁含有LL-二氨基庚二酸，属细胞壁I型；细胞水解物中含有葡萄糖。
上述的植物内生放线菌CR22能够产生天然抑菌物质，应用于抑菌中，效果很好。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的植物内生放线菌CR22的发酵产物具有天然抑菌能力，其抑菌效果好，发酵产物可能含有新的天然物质，具有抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、霉菌(包括黑曲霉、青霉等)的效果，其抑制效果明显。
(2)本发明的植物内生放线菌CR22培养成本低，培养方法简单，增殖快，满足了发酵产物的大量需求。
附图说明
图1是本发明的CR22光学显微镜照片(a)和原子力显微镜照片(b)。
图2是本发明的CR22与密切相关典型菌株依据16S rDNA序列构建的系统发育树。
图3为本发明的CR22对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，青霉，黑曲霉的抑菌结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来详细说明本发明。
实施例1：本发明植物内生放线菌CR22的分离
从湖南省湘潭市采集植物苍耳整株，取根、茎、叶分别洗净，表面消毒，留下最后一次清洗的无菌水涂布，检验表面消毒是否完全，材料烘干，剪碎，均匀洒在分离培养基板上，不用翻转平板，置于28℃培养箱中培养7-14天，即可获得本发明所述的内生菌Streptomyces brunneus CR22 CCTCC No M2018897。
分离培养基：
腐殖酸0.5g，氯化钙(CaCl2)0.5g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)0.5g，硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.5g，氯化钾(KCl)1.7g，硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4；
本发明的植物内生放线菌CR22具有下述微生物学特征：
A.形态特征
光学显微镜下，该菌株形成孢子直链；原子力显微镜下，该菌株孢子多，孢子直链，孢子长柱形，表面粗糙，有刺状突起。
B.培养学上的特征
在酵母精麦芽精琼脂(ISP2)、燕麦粉琼脂(ISP3)，无机盐淀粉琼脂培养基(ISP4)，甘油-天门冬酰胺琼脂培养基(ISP5)，蛋白胨-酵母提取物琼脂(ISP6)，酪氨酸琼脂培养基(ISP7)和高氏一号琼脂培养基上的培养特征如表3所示。
表3本发明菌株在不同培养基上的培养特征
Figure GDA0003181441590000051
C.生理生化特征
该菌株好氧，革兰氏阳性，接触酶阳性，产H2S，牛奶胨化，明胶液化，能水解淀粉，能还原硝酸盐，该菌株最适生长温度为28℃；pH 5.0-12.0下能生长，质量百分浓度8％以上NaCl浓度不能生长；碳源和氮源利用如表4所示。
表4本发明菌株对碳源和氮源的利用情况
Figure GDA0003181441590000052
注：+,利用，-,不利用
D.其他性质
细胞壁含有LL-二氨庚二酸，属细胞壁I型；细胞水解物中含有葡萄糖，棉子糖。细胞壁脂肪酸种类和含量如表5所示：
表5细胞壁脂肪酸种类和含量
Figure GDA0003181441590000061
实施例2：本发明菌株CR22菌株的16S rDNA的序列测定
具体按照下述操作进行：
1.所用试剂
(1)2×CTAB
(2)TE缓冲液
(3)50×TAE缓冲液
(4)75％乙醇(体积分数)
2.DNA提取方法
①挑取已纯化的菌落接种于生长好的液体培养基中，置于30℃、150rmp/min的培养箱中培养5d；
②静置后，倒去上清液，收集菌体沉淀；
③取出冷冻48h的研钵，加适量菌体以及2×CTAB提取液和已灭菌的细砂，在研钵中迅速研磨，10s内完成；
④研磨后迅速移入1.5mL的EP管中，于65℃水浴40min，每隔10min轻轻颠倒一次；
⑤取出离心管、加等体积的氯仿：异戊醇混合液(24∶1，V/V)充分混匀，4℃、11000r/min 离心12min；
⑥吸取上清液移至另一新的1.5mL EP管中；
用TOYOBO公司生产的凝胶回收试剂盒纯化，检测后保存。
3.扩增方法
利用通用引物：正向引物27f(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1492r(5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，扩增采用通用引物由上海生工合成，扩增所用试剂盒购于上海生工。
PCR扩增体系如下表6所示：
表6 PCR反应体系
Figure GDA0003181441590000071
16S rDNA扩增反应程序
94℃预变性3min，然后94℃预变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1.5min，共30个循环，在72℃延伸10min。
16S rDNA的序列测定委托上海生物工程有限公司进行。
实施例3：本发明植物内生放线菌CR22的抑菌情况测定
将本发明菌株CR22接种于高氏合成一号固体培养基中培养14天，采用打孔法、滤纸片法和菌柄法，观察抑菌圈，结果如图3所示。
抑菌结果表明，菌株CR22抑制大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，青霉，黑曲霉，均有明显的抑菌圈，说明抑菌效果显著。
序列表
<110> 湖南科技大学
<120> 植物内生放线菌CR22及其应用
<130> 20190123
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1530
<212> DNA
<213> Streptomyces brunneus CR22
<400> 1
attcacggag agtttgatcc tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca 60
agtcgaacga tgaaccactt cggtggggat tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggc 120
aatctgccct tcactctggg acaagccctg gaaacggggt ctaataccgg ataccacttc 180
cactcgcatg ggtgggggtt gaaagctccg gcggtgaagg atgagcccgc ggcctatcag 240
cttgttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgacgggt agccggcctg agagggcgac 300
cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat 360
tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcga cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt 420
gtaaacctct ttcagcaggg aagaagcgaa agtgacggta cctgcagaag aagcgccggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcaa gcgttgtccg gaattattgg 540
gcgtaaagag ctcgtaggcg gcttgtcacg tcgggtgtga aagcccgggg cttaaccccg 600
ggtctgcatt cgatacgggc tagctagagt gtggtagggg agatcggaat tcctggtgta 660
gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac accggtggcg aaggcggatc tctgggccat 720
tactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgccgtaaac ggtgggaact aggtgttggc gacattccac gtcgtcggtg ccgcagctaa 840
cgcattaagt tccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa ggaattgacg 900
ggggcccgca caagcagcgg agcatgtggc ttaattcgac gcaacgcgaa gaaccttacc 960
aaggcttgac atacaccgga aacggccaga gatggtcgcc cccttgtggt cggtgtacag 1020
gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080
gcaacccttg tcctgtgttg ccagcatgcc cttcggggtg atggggactc acaggagacc 1140
gccggggtca actcggagga aggtggggac gacgtcaagt catcatgccc cttatgtctt 1200
gggctgcaca cgtgctacaa tggcaggtac aatgagctgc gaaaccgtga ggtggagcga 1260
atctcaaaaa gcctgtctca gttcggattg gggtctgcaa ctcgacccca tgaagtcgga 1320
gttgctagta atcgcagatc agcattgctg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca 1380
ccgcccgtca cgtcacgaaa gtcggtaaca cccgaagccg gtggcccaac cccttgtggg 1440
agggagctgt cgaaggtggg accagcgatt gggacgaagt cgtaacaagg tagccgtacc 1500
ggaaggtgcg gctggatcac ctcctttcta 1530

Claims (4)

1.一种植物内生放线菌CR22，其特征在于：其分类命名为Streptomyces brunneusCR22，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No M2018897，保藏日期为2018年12月17日。
2.根据权利要求1所述的植物内生放线菌CR22，其特征在于，其16S rDNA序列为：ATTCACGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACCACTTCCACTCGCATGGGTGGGGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGGCCAGAGATGGTCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCAGGTACAATGAGCTGCGAAACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCTGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACCAGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTA。
3.根据权利要求1或2所述的植物内生放线菌CR22，其特征在于：具有如下微生物学特征：
A.形态特征
光学显微镜下，该菌株形成孢子直链；原子力显微镜下，该菌株孢子多，孢子直链，孢子短柱形，表面有刺；
B.生理生化特征
CR22需氧，革兰氏阳性，接触酶阳性，ISP6液体培养基产类黑色素，产H2S，明胶液化，能水解淀粉，能还原硝酸盐；能利用D-核糖，D-果糖，D-棉子糖，D-海藻糖，D-木糖；
C.其他特征
CR22细胞壁含有LL-二氨基庚二酸，属细胞壁I型；细胞水解物中含有葡萄糖。
4.根据权利要求1或2所述的植物内生放线菌CR22，其特征在于，植物内生放线菌CR22,从湖南湘潭市境内采样，经分离培养获得，其培养条件为：
(1)培养基：采用改良的HVG培养基
具体配方为：腐殖酸0.5g，氯化钙0.5g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钾1.7g，硫酸亚铁0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4；
(2)培养温度：28℃。
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