CN111548940B - 一种筛选产生物表面活性剂兼性厌氧菌的方法 - Google Patents

一种筛选产生物表面活性剂兼性厌氧菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种筛选产生物表面活性剂兼性厌氧菌的方法，包括如下步骤：(1)采集油污染环境样品，并于4℃环境中保存；(2)取少量样品，加入到富集培养基中培养，所得培养液再接入新配置的富集培养基中培养，如此连续转接培养3次；(3)取第三次转接的富集培养液，涂布于LB平板培养，获得单菌落；(4)将单菌落接种到发酵培养基中培养，测定培养液表面张力，选取培养液表面张力低于30mN/m菌株；(5)将选取的菌株接种于原油平板上，培养，呈现明显排油圈的菌株即为产生物表面活性剂厌氧菌株。与现有技术相比，本发明的优点是能够快速、高效地筛选获得兼性厌氧产生物表面活性剂菌株。

Description

一种筛选产生物表面活性剂兼性厌氧菌的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种筛选产生物表面活性剂兼性厌氧菌的方法。
背景技术
表面活性剂是一类重要的化工原料，具有乳化、分散、洗涤等功能，在石油、化妆品、洗化用品等行业获得了广泛应用。近年来，随着人们环境意识的增强，化学表面活性剂引起的环境污染和人体伤害等问题越来越受到关注，化学表面活性剂大量使用的局限性也日益突出。人们对环境友好、对人体危害小的生物表面活性剂寄予厚望。
生物表面活性剂是由微生物在一定培养条件下产生的具有表面活性的代谢产物，主要包括磷脂、糖脂、脂肽、脂肪酸、结合多糖蛋白质以及颗粒等类型。现阶段生物表面活性剂产生菌主要是好氧的细菌、真菌、酵母菌，厌氧或兼性厌氧产生物表面活性剂菌种的研究还非常有限。厌氧产表面活性剂菌种不足，导致其在厌氧环境下的菌种的作用难以发挥(如：石油开采、深层油污土壤生物修复等)。筛选在兼性厌氧条件下产生物表面活性剂的菌株具有十分重要的意义。
目前已报道的筛选兼性厌氧产表面活性剂菌种的方法有：(1)分别在好氧培养条件和厌氧培养条件下筛选出产生物表面活性剂菌种，结合分子生物学鉴定，识别出其中的兼性厌氧菌；(2)在好氧条件下富集培养，分离培养出的细菌再在严格厌氧条件下培养；在严格厌氧条件下富集培养，再在好氧条件下培养，筛选出两者均能够生长的菌即为兼性厌氧菌。
这些筛选方法要么需要分子生物学鉴定技术，进而需要配置专门的技术装备和专业技术人员，要么需要严格厌氧的培养条件，操作复杂；同时，还可能存在做的菌种不纯，为严格厌氧菌(或严格好氧菌)与兼性厌氧菌混杂一起等缺陷。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种筛选产生物表面活性剂兼性厌氧菌的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种筛选产生物表面活性剂兼性厌氧菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采集油污染环境样品，并于4℃环境(如冰箱)中保存；
(2)取少量样品，加入到富集培养基中培养，所得培养液再接入新配置的富集培养基中培养，如此连续转接培养3次；
(3)取第三次转接的富集培养液，涂布于LB平板培养，获得单菌落；
(4)将单菌落接种到发酵培养基中培养，测定培养液表面张力，选取培养液表面张力低于30mN/m菌株；
(5)将选取的菌株接种于原油平板上，培养，呈现明显排油圈的菌株即为产生物表面活性剂厌氧菌株。
步骤(1)中油污染环境样品是指被原油或食用油污染过的土样，如油井附近土壤，或油井产出液。
步骤(2)加入到富集培养基中的样品的接种量为5％。
步骤(2)中富集培养基的成分是：NaCl 5g、(NH4)2SO4 2.5g、KH2PO4 10.0g、Na2HPO44.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、蒸馏水1000mL，原油5g，培养基pH 7.2。
步骤(2)中富集培养基放置在摇床上，每次培养的温度为30～50℃，培养的时间为5～7d，摇床转速为150～200rpm。
步骤(3)所述LB平板制备及使用方法：将LB固体培养基在121℃高温灭菌，然后冷却至40～60℃时倒入培养皿中，待培养基冷却凝固后接种微生物培养。LB平板培养温度为30～50℃，培养时间为1～3d。
步骤(4)中发酵培养基的成分是：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 2.5g、KH2PO4 10.0g、Na2HPO4 4.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、酵母浸粉5.0g，蒸馏水1000mL，培养基pH 7.2。
步骤(4)中培养温度与获得单菌落时培养温度相对应，培养时间0.5～2d，摇床转速150～200rpm。
步骤(5)中培养温度与获得单菌落时培养温度相对应，培养时间2～5d。
步骤(5)中原油平板通过以下方法制得：将LB固体培养基在121℃下高温灭菌，培养基冷却至40～60℃时倒入培养皿中，待培养基冷却凝固后加入5mL灭菌原油，使其均匀覆盖在固体培养基表面，制备成原油平板。
所述的LB固体培养基成分为NaCl 10.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、琼脂粉15g，蒸馏水1000mL。
步骤(5)中原油平板置于恒温箱中培养，培养的温度为30～60℃，培养的时间为1～3d。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.能够快速、高效地筛选获得兼性厌氧产生物表面活性剂菌株。本申请由于首先采用富集培养基将环境样品富集，可以将某些含量较少的兼性厌氧菌富集起来，有效避免了菌种遗漏，明显提高了工作效率。
2.操作简单。本申请通过制作原油平板，建立了适宜的培养环境，实现了严格好氧菌和严格厌氧菌的自动剔除，可直接而便利地获得兼性厌氧菌。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
采集长期被原油污染的土样，按照5％的接种量添加至富集培养基(组成：NaCl5g、(NH4)2SO4 2.5g、KH2PO4 10.0g、Na2HPO4 4.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、蒸馏水1000mL，原油5g，培养基pH 7.2)，摇瓶在150rpm、温度30℃的摇床中培养5d，摇瓶中的原油出现明显的乳化现象。取培养液10mL加入到灭菌的富集培养基中相同条件下培养，如此连续转接富集培养3次，富集结束。取1mL第三次富集的培养液，逐级稀释至10-8涂布于LB固体培养基平板上，将平板放于恒温30℃培养箱中培养1d，挑取不同菌落接到发酵培养基(组成：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 2.5g、KH2PO4 10.0g、Na2HPO4 4.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、酵母浸粉5g，蒸馏水1000mL，培养基pH 7.2)，在150rpm的恒温30℃摇床培养箱培养1d，测定培养液表面张力，得到9个表面张力低于30mN/m的培养液，分别接种于原油平板上(用接种针分别蘸取得到的9个表面张力低于30mN/m的菌株培养液，接种于原油平板上)，恒温30℃培养2d，其中2个培养后出现明显排油圈，得到2个产表面活性剂的兼性厌氧菌。
实施例2：
该上述原油污染的土样，按照5％的接种量添加至富集培养基(组成：NaCl 5g、(NH4)2SO4 2.5g、KH2PO4 10.0g、Na2HPO4 4.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、蒸馏水1000mL，原油5g，培养基pH 7.2)，摇瓶在200rpm、温50℃的摇床中培养7d，摇瓶中的原油出现明显的乳化现象。取培养液10mL加入到灭菌的富集培养基中相同条件下培养，如此连续转接富集培养3次，富集结束。取1mL第三次富集的培养液，稀释后涂布于LB固体培养基平板上，将平板倒放于恒温50℃培养箱中培养2d，挑取不同菌落，转接到发酵培养基(组成：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO42.5g、KH2PO4 10.0g、Na2HPO4 4.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、酵母浸粉5g，蒸馏水1000mL，培养基pH 7.2)，在200rpm的恒温50℃摇床培养箱培养2d，测定培养液表面张力，获得12个表面张力低于30mN/m的菌株，分别接种于原油平板上(用接种针分别蘸取得到的12个表面张力低于30mN/m的菌株培养液，接种于原油平板上)，恒温50℃培养5d，5个菌株培养后出现明显排油圈，得到5株产表面活性剂的兼性厌氧菌。
实施例3：
采集华北油田油井产出液样品，按照5％的接种量添加至富集培养基(组成：NaCl5g、(NH4)2SO4 2.5g、KH2PO4 10.0g、Na2HPO4 4.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、蒸馏水1000mL，原油5g，培养基pH 7.2)，150rpm、恒温37℃摇床中培养5d，摇瓶原油出现明显的乳化现象。取培养液10mL加入到灭菌的富集培养基中，相同条件下培养，如此连续转接富集培养3次，富集结束。取1mL富集培养液，稀释后涂布于LB固体培养基平板上，将平板倒放于恒温37℃培养箱中培养1.5d，挑取不同菌落，转接到发酵培养基(组成：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 2.5g、KH2PO4 10.0g、Na2HPO4 4.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、酵母浸粉5g，蒸馏水1000mL，培养基pH7.2)，在150rpm、恒温37℃摇床培养箱培养0.5d，测定培养液表面张力，将表面张力低于30mN/m的17个菌株接种于原油平板上(用接种针分别蘸取得到的17个表面张力低于30mN/m的菌株培养液，接种于原油平板上)，恒温37℃培养3d，3株菌出现明显排油圈，得到3个产表面活性剂的兼性厌氧菌。
实施例4：
采集加油站附近油污染土样，按照5％的接种量添加至富集培养基(组成：NaCl5g、(NH4)2SO4 2.5g、KH2PO4 10.0g、Na2HPO4 4.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、蒸馏水1000mL，原油5g，培养基pH 7.2)，180rpm、恒温37℃摇床中培养5d，摇瓶原油出现明显的乳化现象。取培养液10mL加入到灭菌的富集培养基中，相同条件下培养，如此连续转接富集培养3次，富集结束。取1mL富集培养液，稀释后涂布于LB固体培养基平板上，将平板倒放于恒温37℃培养箱中培养1d，挑取不同菌落，转接到发酵培养基(组成：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 2.5g、KH2PO410.0g、Na2HPO4 4.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、酵母浸粉5g，蒸馏水1000mL，培养基pH 7.2)，在180rpm、恒温37℃摇床培养箱培养1d，测定培养液表面张力，将表面张力低于30mN/m的10个菌株接种于原油平板上(用接种针分别蘸取得到的10个表面张力低于30mN/m的菌株培养液，接种于原油平板上)，恒温37℃培养4d，4株菌出现明显排油圈，得到4个产表面活性剂的兼性厌氧菌。
实施例5：
采集某小吃街附近的食用油污染土样，按照5％的接种量添加至富集培养基(组成：NaCl 5g、(NH4)2SO4 2.5g、KH2PO4 10.0g、Na2HPO4 4.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、蒸馏水1000mL，原油5g，培养基pH 7.2)，200rpm、恒温30℃摇床中培养3d，摇瓶原油出现明显的乳化现象。取培养液10mL加入到灭菌的富集培养基中，相同条件下培养，如此连续转接富集培养3次，富集结束。取1mL富集培养液，稀释后涂布于LB固体培养基平板上，将平板倒放于恒温30℃培养箱中培养1d，挑取不同菌落，转接到发酵培养基(组成：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO42.5g、KH2PO4 10.0g、Na2HPO4 4.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、酵母浸粉5g，蒸馏水1000mL，培养基pH 7.2)，在200rpm、恒温30℃摇床培养箱培养1d，测定培养液表面张力，将表面张力低于30mN/m的8个菌株接种于原油平板上(用接种针分别蘸取得到的8个表面张力低于30mN/m的菌株培养液，接种于原油平板上)，恒温30℃培养3d，1株菌出现明显排油圈，得到1个产表面活性剂的兼性厌氧菌。
实施例6
选取上述筛选的产生物表面活性剂兼性厌氧菌中的其中一株，经鉴定该菌株与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)EnB-bsys4的相似性达99％，在NCBI上的登录号为KM596522.1，将其命名为Bacillus licheniformis X-1。实验评价了菌株X-1在不同含氧条件下产生物表面活性剂的能力。实验结果表明：在好氧、限氧、厌氧条件下进行发酵培养时，表面张力分别为27.56mN/m、33.18mN/m和35.69mN/m，表面活性剂产量分别为1.05g/L、0.65g/L和0.41g/L。

Claims (7)

1.一种筛选产生物表面活性剂兼性厌氧菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采集油污染环境样品，并于4℃环境中保存；
(2)取少量样品，加入到富集培养基中培养，所得培养液再接入新配制 的富集培养基中培养，如此连续转接培养3次；
富集培养基的成分是：NaCl 5.0g、(NH4)2SO4 2.5g、KH2PO4 10.0g、Na2HPO4 4.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、蒸馏水1000mL，原油5g，培养基pH 7.2；
(3)取第三次转接的富集培养液，涂布于LB平板培养，获得单菌落；
(4)将单菌落接种到发酵培养基中培养，测定培养液表面张力，选取培养液表面张力低于30mN/m菌株；
发酵培养基的成分是：葡萄糖10.0g、(NH4)2SO4 2.5g、KH2PO4 10.0g、Na2HPO4 4.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、酵母浸粉5.0g，蒸馏水1000mL，培养基pH 7.2；
(5)将选取的菌株接种于原油平板上，培养，呈现明显排油圈的菌株即为产生物表面活性剂厌氧菌株；
原油平板通过以下方法制得：将LB固体培养基在121℃下高温灭菌，培养基冷却至40～60℃时倒入培养皿中，待培养基冷却凝固后加入5mL灭菌原油，使 原油均匀覆盖固体培养基表面，制备成原油平板。
2.根据权利要求1所述的筛选产生物表面活性剂兼性厌氧菌的方法，其特征在于，步骤(2)加入到富集培养基中的样品的接种量为5％。
3.根据权利要求1所述的筛选产生物表面活性剂兼性厌氧菌的方法，其特征在于，步骤(2)中富集培养基放置在摇床上，每次培养的温度为30～50℃，培养的时间为5～7d，摇床转速为150～200rpm。
4.根据权利要求1所述的筛选产生物表面活性剂兼性厌氧菌的方法，其特征在于，步骤(4)中培养温度与获得单菌落时培养温度相对应，培养时间0.5～2d，摇床转速150～200rpm。
5.根据权利要求1所述的筛选产生物表面活性剂兼性厌氧菌的方法，其特征在于，步骤(5)中培养温度与获得单菌落时培养温度相对应，培养时间2～5d。
6.根据权利要求1所述的筛选产生物表面活性剂兼性厌氧菌的方法，其特征在于，所述的LB固体培养基成分为NaCl 10.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL，培养基pH 7.2。
7.根据权利要求1所述的筛选产生物表面活性剂兼性厌氧菌的方法，其特征在于，步骤(5)中原油平板置于恒温箱中培养，培养的温度为30～50℃，培养的时间为2～5d。
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