CN104928214A

CN104928214A - 一种溶杆菌属菌株及其液体发酵培养方法

Info

Publication number: CN104928214A
Application number: CN201510320919.3A
Authority: CN
Inventors: 崔浪军; 张史玲; 年美玉; 孙建军; 付瑞娟; 张鑫; 王维
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2015-06-11
Filing date: 2015-06-11
Publication date: 2015-09-23

Abstract

本发明公开一种溶杆菌属菌株及其液体发酵培养方法，所用的菌株经鉴定为Lysobacter属菌株，经过发酵工艺优化条件控制，确定了稳定的发酵方法。将保存的溶杆菌菌株先活化培养，然后转接于LB培养液中，在30℃，180rpm培养48h,再按1％比例接种到发酵培养液中。该菌株具有活性高、抗菌谱广和对环境安全等特性，在化学农药污染严重的今天，该溶杆菌属菌株在生物防治领域具有极好的应用前景。优化后的该菌株液体发酵方法操作简单、环境友好，能够实现该菌株的工业化发酵生产。

Description

一种溶杆菌属菌株及其液体发酵培养方法

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，提供一种溶杆菌属菌株及其液体发酵培养方法。

背景技术

高效、低毒、低残留的微生物农药已取得显著的生态和社会效益,在农业生产中具有巨大的经济价值。已有研究报道，众多生防细菌在其生长发育过程中会产生许多拮抗性或者竞争性的代谢产物(包括多种抗生素类、酶类、挥发类成分)，具有阻碍或者杀死病原菌的效果，生防效果极佳。因此，从生防细菌中寻找农用活性的抗菌物质有着极为广阔的应用前景。

溶杆菌属细菌首次于1973年报道，1978年命名，广泛存在于土壤、水体和深海海绵，有较好的定殖活性，对许多植物病原真菌、病原细菌、水藻以及线虫等都有很强的拮抗作用，是一类具有极大生防潜力的生防菌。

从1978确立Lysobacter属以来，已报道的大多数Lysobacter属菌株具有很强的拮抗病原真菌、病原细菌、线虫和绿藻的能力。部分Lysobacter属菌株如Lysobacter enzymogens C3已经用于生物防治。因此，挖掘具有重大生防前景的Lysobacter属菌株资源具有重要的理论与实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种溶杆菌属菌株及其液体发酵培养方法，本发明针对生产实践中的问题和需求，筛选出一株活性高、抗菌谱广，对环境安全的新型生防细菌菌株。同时，本发明提供了该菌株的液体发酵培养方法，该菌株的液体发酵方法操作简单、环境友好，能够实现该菌株的工业化发酵生产，减少化学农药对环境的污染，更好的防治农业植物病害。

为实现本发明的目的采用的技术方案是：

一种溶杆菌属菌株，该溶杆菌属菌株命名为Lysobacteryananisis sp.SNNU 513，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2013年10月21日，菌种保藏号为CGMCC No.8375。

该溶杆菌菌株为革兰氏染色阴性的溶杆菌属Lysobacter菌株。

一种溶杆菌菌株的液体发酵培养方法，包括以下步骤：

1)将保藏号为CGMCC No.8375的菌株接种于LB液体培养基中，在30℃，180r/min条件下振荡培养48h至对数期，得到种子液；

2)按100mL接种1mL的比例，将种子液接种至液体发酵培养基中，在温度30℃，转速180r/min条件下摇床培养72h，得到溶杆菌SNNU 513的发酵液。

步骤1)所述的种子液中的含有的溶杆菌SNNU 513的菌落数为1×10⁸CFU/mL。

步骤2)所述的发酵结束后菌体数量达到2.1×10⁹CFU/mL。

每升LB液体培养基中含有：蔗糖32.46g、酵母提取物4g、胰蛋白胨4.30g、(NH₄)₂SO₄ 8.65g、CO(NH₂)₂ 3g、K₂HPO₄ 9g、MgSO₄·7H₂O 2.4g、ZnSO₄·7H₂O 0.2g、FeSO₄·H₂O 0.02g、CuSO₄·5H₂O 0.005g、CaCl₂·H₂O 0.12g、NaCl 2.4g、泛酸钙6mg、肌醇15mg、核黄素3mg、维生素B₆ 0.05mg，其余为蒸馏水；LB液体培养基的初始pH值为7.0

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开了一种溶杆菌属菌株，命名为Lysobacter sp.SNNU 513，试验证明，菌株SNNU313产生的包括可溶性溶胞壁质转糖基酶(soluble lytic murein transglycosylase)、裂解转糖基酶(lytic transglycosylase)、α-水解蛋白酶(α-Lytic protease)和β-水解蛋白酶(β-lytic protease)等多种胞外蛋白水解酶，能有效抑制很多病原真菌和病原细菌的生长，具有很好的生防应用前景。

本发明还提供了该生防菌株SNNU513的液体发酵培养方法，以LB培养基为基础，经优化后的发酵培养基及其培养方法培养该细菌，优化后的细菌生物量显著增高，摇瓶培养至生长对数期减少24h，同时，发酵优化后的胞外蛋白含量明显高于用LB培养基所产的蛋白含量，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，发酵优化后胞外蛋白电泳条带比LB培养基得到的胞外蛋白电泳条带相对较多。同体积的菌液及其上清液中的蛋白质抑菌效果均有增强。能够证明该液体发酵培养基及其培养方法成本低、效果佳，菌株本身及发酵培养基成分无污染、环境安全，易于大规模生产与推广。

附图说明

图1溶杆菌Lysobacter sp.SNNU 513的扫描电镜照片；

图2溶杆菌Lysobacter sp.SNNU 513拮抗苹果干腐病原真菌的光学显微镜与扫描电镜照片；

图3溶杆菌与已鉴定Lysobacter属细菌16S rDNA序列构建的系统发育树；

图4不同培养温度对SNNU 513菌株生长影响曲线图；

图5不同培养转速对SNNU 513菌株生长影响柱状图；

图6响应面立体分析图和相应等高图；其中，(a)蔗糖和(NH4)₂SO₄对菌体数产量交互影响的三维曲面图；(b)蔗糖和(NH4)₂SO₄对菌体数产量交互影响的等高线图；(c)蔗糖和胰蛋白胨对菌体数产量交互影响的三维曲面图；(d)蔗糖和胰蛋白胨对菌体数产量交互影响的等高线图；(e)(NH₄)₂SO₄和胰蛋白胨对菌体数产量交互影响的三维曲面图；(f)(NH₄)₂SO₄和胰蛋白胨对菌体数产量交互影响的等高线图；

图7培养基及其发酵方法优化前后SNNU 513生长曲线图(F-发酵优化后的细菌生长曲线，L-LB培养基培养的细菌生长曲线)；

图8培养基及其发酵方法优化前后菌株SNNU513抑菌活性图谱(A、B 为优化发酵培养基得到的菌液抑菌图，a、b为LB培养基培养得到的菌液抑菌)；

图9培养基及其发酵方法优化前后SNNU 513胞外蛋白质含量对比图

图10培养基及其发酵方法优化前后SNNU 513胞外蛋白SDS-凝胶电泳结果图(F为发酵优化后培养基得到的胞外分泌蛋白电泳图谱，L为LB培养基培养得到的的胞外蛋白电泳图谱)；

图11培养基及其发酵方法优化前后SNNU 513胞外分泌蛋白抑菌活性图，A为发酵优化后培养基得到的蛋白抑菌图，B为LB培养基培养得到的蛋白抑菌图。

具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体的附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

1、菌株Lysobacter sp.SNNU513

本发明是从药用植物远志(Polygala tenuifolia Willd)根部分离、纯化、筛选获得一株具有广谱抗菌活性的细菌，经鉴定为溶杆菌属细菌，命名为Lysobacter sp.SNNU513(NCBI JF445288.1)。16SrDNA基因序列同源比对分析和系统的进化分析表明，该菌株与Lysobacter enzymogenes DSM2043T(99％)的同源性最高，属于Lysobacter属。根据Srinivasan等人(Int J Syst Evol Microbiol.2010,60:1543-1547)的方法对该菌株的关键生理生化特征进行全面测定，结果表明该菌株主要生物学特性为：革兰氏染色阴性、杆状、氧化酶阳性、过氧化氢酶阴性。菌体主要脂肪酸为iso-C15:0、iso-C16:0、iso-C17:1ω9c和iso-C11:03-OH。主要磷脂类为：PE(磷脂酰乙醇胺)、PG(磷脂酰甘油)和PME(磷脂酰甲基乙醇胺)。泛醌类化合物主要成分为Q-8。基因组DNA G+C含量为66.5％。这些特性完全符合Lysobacter属细菌的特征。鉴定后的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，菌种保藏号：CGMCC No.8375)和美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)(菌种保藏号：ATCC BAA-2621^TM)。

2、一种溶杆菌属菌株的液体发酵工艺优化方法

1)将保藏号为CGMCC No.8375的菌株接种于LB培养基中，在30℃，180r/min下振荡培养摇床培养48h至对数期，得到种子液；

2)按100mL接种1mL的比例，将上述培养好的种子液接种至液体发酵培养基中，发酵培养基配方为：蔗糖32.46g、酵母提取物4g、胰蛋白胨4.30g、(NH₄)₂SO₄ 8.65g、CO(NH₂)₂ 2g、K₂HPO₄ 9g、MgSO₄·7H₂O 2.4g、ZnSO₄·7H₂O 0.2g、FeSO₄·H₂O 0.02g、CuSO₄·5H₂O 0.005g、CaCl₂·H₂O 0.12g、NaCl 2.4g、泛酸钙6mg、肌醇15mg、核黄素3mg、维生素B₆ 0.05mg，其余为蒸馏水，初始pH值为7.0。

3)在发酵培养过程中，振荡速度为180r/min，发酵温度为30℃，培养时间为72h，发酵结束后菌体数量达到2.1×10⁹CFU/mL。

实施例1

Lysobacter sp.SNNU 513^T菌株的分离、纯化与鉴定

(1)菌株分离：

药用植物远志采集于海拔1000m左右的陕西省延安市，本实验室严格按照内生菌的分离方法，在无菌条件下，将消毒后的根部切取0.5×0.5cm的小块，置于含有链霉素的PDA培养基中，在26～30℃下，培养2～3天，分离得到溶杆菌属SNNU 513的菌落，以无菌水为对照，漂洗液检验法验证。

(2)菌株纯化：

根据初分菌落的形态特征，用接种针挑取SNNU 513的菌落，通过平板划线法及四分法，反复划线，得到表面光滑、边缘整齐，大小为0.1～0.3cm，颜色为乳白色的单一形态特征的菌株，即SNNU 513^T。得到单一形态特征的菌株，用20％的甘油保存于-80℃超低温冰箱备用，除了实验室自己保存菌株以外，还将菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心和美国典型微生物保藏中心。

(3)菌株鉴定：

参照Srinivasan等人(Int J Syst Evol Microbiol.2010,60:1543-1547)的方法对分离纯化后的菌株进行形态学分析(杆状，参见图1扫描电镜)、关键生理生化试验(革兰氏染色阴性、氧化酶阳性、过氧化氢酶阴性、基因组DNA G+C含量66.5％、菌体主要的脂肪酸为iso-C15:0,iso-C16:0,iso-C17:1ω9c和iso-C11:03-OH。菌体主要的磷脂类为磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和磷脂酰甲基乙醇胺，泛醌类化合物主要成分为Q-8)、16S rDNA序列分析与Lysobacter enzymogenes DSM2043DNA杂交等进行系统分析，该菌株被鉴定为溶杆菌属(Lysobacter)菌株，表现出一些特殊的生物学特性，命名为Lysobacter sp.SNNU513。平板对峙试验表明，SNNU513菌株对稻瘟病菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯菌、番茄早疫霉菌、苹果干腐菌、灰霉菌、小麦全蚀菌、链格胞菌和水稻纹枯病菌等植物病原菌有很强的拮抗作用，是一种新型的生防细菌。图2为SNNU 513拮抗苹果干腐病菌过程中菌丝的变化过程，图中，A、B、C、D为光学显微镜下观察菌株SNNU513对苹果干腐病菌(Botryosphaeria berengeriana)菌丝形态影响(400×)；a、b、c、d为扫描电镜下观察菌株SNNU513对苹果干腐病原菌菌丝形态影响。a:正常菌丝圆滑、饱满(2000×)；b:示SNNU513拮抗苹果干腐病菌12h后，菌丝分支增多，局部出现褶皱(4000×)；c:示SNNU513拮抗苹果干腐病菌24h后，菌丝局部出现凹陷，呈念珠状，菌丝末端膨大(为3000×、4000×)；d:示SNNU513拮抗苹果干腐病菌36h后，有部分细胞间隔消逝，细胞破裂，内含物溶出(3000×)。

菌株的分子生物学分类鉴定：16S rDNA序列分析

(1)细菌培养至饱和状态，每管1.5mL离心2min，弃上清。

(2)567μL TE buffer重悬，30μL 10％SDS，3μL 20mg/mL蛋白酶K水浴1h。

(3)加入100μL、5mol/L NaCl，混匀，80μL CTAB/NaCl，65℃，水浴10min。

(4)等体积氯仿/异戊醇，混匀，离心，转移上清。

(5)酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，离心，转移上清。

(6)加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤。

(7)离心5min，干燥，加入100μL TE。

(8)PCR引物采用细菌16S rDNA通用引物，引物序列如下：

5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

(9)建立系统发育树

①16S rDNA的测序：16S rDNA的测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，将所得长度1412kb的序列在GenBank注册。

②系统发育树的构建：所得序列通过BLAST程序与GenBank中的16S rDNA基因序列进行同源性比较，用MEGA 4.0软件包中的Kimura-2-parameter法计算遗传距离，用Neighbor-Joining法构建系统发育树，重复抽样1000次分析系统树各分枝的置信度。菌株16S rDNA序列已提交到GeneBank，登录号为JF445288.1。序列如SEQ.ID.NO.1所示，序列比对分析结果为：提交序列的覆盖度在98％以上。与Lysobacter属其他种的同源相似度在97％以上，其中同源相似度最高的为Lysobacter enzymogenes，达到99％。如图3所示，菌株与Lysobacter enzymogenes处于同一分支，同源比对结果显示其同源度达到99％，确定该菌株为溶杆菌属菌株。

实施例2

菌株的发酵培养基优化方法及其液体发酵步骤

(1)菌株的发酵培养基优化方法：

1)发酵条件的优化采用单因素溶杆菌SNNU513液体发酵的主要影响因子温度和转速进行优化，参见图4、图5，确定了最佳培养条件为：温度为30℃、转速为180rpm/min；

2)通过利用正交实验和响应面实验以LB为基础培养基对液体发酵培养基中的碳氮源、磷源、金属离子、生长因子进行优化，利用Design-Expert软件对回归模型进行响应面分析,得到各响应面立体分析(参见图6)，对回归方程求解,得模型极值点,即蔗糖、(NH₄)₂SO₄和Tryptone的最佳浓度分别为32.46g/L、8.65g/L和4.30g/L时,响应值Y达到最大值,即发酵液的生物产量最高为2.1×10⁹CFU/mL。优化后的每升液体发酵培养基中含有：蔗糖32.46g、酵母提取物4g、胰蛋白胨4.30g、(NH₄)₂SO₄ 8.65g、CO(NH₂)₂ 2g、K₂HPO₄ 9g、MgSO₄·7H₂O 2.4g、ZnSO₄·7H₂O 0.2g、FeSO₄·H₂O 0.02g、CuSO₄·5H₂O 0.005g、CaCl₂·H₂O 0.12g、NaCl 2.4g、泛酸钙6mg、肌醇15mg、核黄素3mg、维生素B₆ 0.05mg，其余为蒸馏水，初始pH值为7.0。

(2)菌株的液体发酵培养步骤：

溶杆菌属菌株(Lysobacter sp.SNNU 513)的液体发酵培养包括以下步骤：

1)将保存的菌株接种于LB培养基中，在30℃下，培养48h至对数期，得到种子液，摇床振荡速度为180r/min的条件下，用平板计数法得到种子液中的溶杆菌SNNU 513的菌落数为1×10⁸CFU/mL；

所述的培养基为LB液体培养基，成分为：牛肉蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，调节pH值至7.0。

2)按100mL接种1mL的比例，将种子液接种至液体发酵培养基中，在 30℃下，摇床振荡速度为180r/min的条件下培养，分别在0h、24h、48h、72h、96h时取样，得到溶杆菌SNNU513的发酵液，用平板计数法得到SNNU513的活菌数目。

实施例3：LB培养基和发酵优化培养基的结果比较

(1)发酵优化前后细菌生长曲线

接种相同浓度的SNNU513到相同条件的LB培养基和本发明经过筛选的发酵培养基中，分别在12h、24h、36h、48h、60h、72h取样，重复三次。参见图7，图中，F为发酵优化后培养基的细菌生长曲线，L为LB培养基的细菌生长曲线。从图中可以看出，SNNU513在相同培养时间、条件下显示出不同的吸光值，发酵优化后培养基得到的细菌的OD₆₀₀明显高于LB培养基得到的细菌的OD₆₀₀，这表明发酵优化后的培养基生产的细菌菌体数量明显高于LB培养基生产的细菌菌体数，在改良后的液体发酵培养基上培养，摇瓶至生长对数期减少24h。

(3)菌液抑菌试验

将处于稳定期的LB培养基培养得到的菌液和本发明经过筛选的发酵优化后培养基得到的菌液，每个孔中加入100ul，如图8所示，图中A、a为发酵优化后与LB培养基菌液拮抗曲霉属病原真菌(Aspergillus)图谱，B、b为发酵优化后与LB培养基菌液拮抗苹果干腐病菌(Botryosphaeria berengeriana)图谱。从图中可以看出发酵优化后的菌液抗菌能力较强与LB菌液。

(2)发酵优化前后蛋白含量变化

用GENEray公司的BCA法蛋白定量试剂盒对提取的样品(LB培养基得到的胞外蛋白、发酵优化后培养基得到的胞外蛋白)进行定量测定。当波长为595nm时，吸光度与标准品质量相关系数好，r为0.9915，经计算LB培养基得到的胞外蛋白和发酵优化培养基得到的胞外蛋白浓度分别为8.9888 mg/ml和22.7256mg/ml，见图9，发酵优化后的培养基所得的蛋白浓度明显高于由LB培养基所得的蛋白浓度。

将同体积的LB上清液和发酵优化后的上清液，加入1/10体积100％TCA沉淀过夜，11000rpm/min离心20min后弃上清，用丙酮彻底洗涤沉淀，重复上述离心及洗涤2-3次，得到的样品经过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，获得较好的凝胶图像，见图10，F为发酵优化后培养基的胞外分泌蛋白电泳图谱，L为LB培养基培养得到的胞外分泌蛋白电泳图谱。从实验结果看出，发酵优化后的菌液通过TCA沉淀得到的胞外蛋白电泳条带比LB发酵得到的胞外蛋白电泳条带相对较多，且分辨率更高，在35～45kD分子量范围内优化后发酵得到的胞外蛋白条带较清楚。

(4)发酵优化前后粗蛋白抑菌试验

将同体积的发酵培养基优化前后的菌液分别离心后，获得的上清通过丙酮沉淀得到的蛋白。在预培养3d的曲霉属病原真菌(Aspergillus)平板中间打孔，分别加入以上获得的50ul蛋白液，实验结果见图11，图中，A为发酵优化后培养基得到的蛋白抑菌图，B为LB培养基培养得到的蛋白抑菌图。从图中可以看出由LB培养基得到的粗蛋白与本发明优化发酵培养基得到的粗蛋白均有比较显著的抑菌作用，说明该菌分泌的蛋白类物质有比较显著的抑菌作用，而且本发明优化发酵培养基得到的蛋白液抗菌能力较强于由LB培养基得到的蛋白液。

综上所述，本发明所用的菌株经鉴定为Lysobacter属菌株，经过发酵工艺优化条件控制，确定了稳定的发酵方法。将保存的溶杆菌菌株先用斜面培养基活化培养，然后转接于LB培养液中，30℃，180rpm培养48h,再按1％比例接种到发酵培养液中。同样培养条件下，以LB培养基作为对照，通过生长曲线、蛋白含量、聚丙烯酰胺凝胶电泳，及其抗菌活性的比较，发酵优化后所生产的菌株数量、胞外蛋白含量及抑菌活性均有所提高，能够证明该液体发酵培养基培养效果好。该菌株具有活性高、抗菌谱广和对环境安全等特性，在农药污染严重的今天，溶杆菌将是一种很好的农药替代品，该菌株的液体发酵方法操作简单、环境友好，能够实现该菌株的工业化发酵生产。

Claims

1.一种溶杆菌属菌株，其特征在于，该溶杆菌属菌株命名为Lysobactersp.SNNU 513，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.8375。

2.如权利要求1所述的溶杆菌属菌株，其特征在于：该溶杆菌菌株为革兰氏染色阴性的溶杆菌属Lysobacter菌株。

3.一种溶杆菌菌株的液体发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的溶杆菌菌株的液体发酵培养方法，其特征在于，步骤1)所述的种子液中的含有的溶杆菌SNNU 513的菌落数为1×10⁸CFU/mL。

5.根据权利要求3所述的溶杆菌菌株的液体发酵培养方法，其特征在于，步骤2)所述的发酵结束后菌体数量达到2.1×10⁹CFU/mL。

6.根据权利要求3所述的溶杆菌菌株的液体发酵培养方法，其特征在于，每升LB液体培养基中含有：蔗糖32.46g、酵母提取物4g、胰蛋白胨4.30g、(NH₄)₂SO₄ 8.65g、CO(NH₂)₂ 3g、K₂HPO₄ 9g、MgSO₄·7H₂O 2.4g、ZnSO₄·7H₂O 0.2g、FeSO₄·H₂O 0.02g、CuSO₄·5H₂O 0.005g、CaCl₂·H₂O 0.12g、NaCl 2.4g、泛酸钙6mg、肌醇15mg、核黄素3mg、维生素B₆ 0.05mg，其余为蒸馏水；LB液体培养基的初始pH值为7.0。