CN109554313A - 含有亚种h.5-28菌种的细菌培养物的培养方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，本发明在原有分离出来的草螺菌的基础上，对其进行详细的鉴定分析，对其进行了更详细的分类，得到Herspirillum huttitense5‑28，简称亚种H.5‑28；同时，具体提供了亚种H.5‑28菌种的快速大量培养方法，包括菌种活化、种子液的制备、发酵培养的具体培养过程，其中，所述发酵培养的培养条件为：液体培养基，接种量3％，28‑37℃，180r/min，培养时间48h；还提供了以该菌种为主要活性物质制备出的生物菌肥和该生物菌肥的制备方法；以及利用该生物菌肥在抵抗玉米青枯病、小麦纹枯病、附子根腐病多种病原菌害中的应用。

Description

含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物的培养方法及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物的培养方法及其应用。

背景技术

植物生长促进菌(PGPB，Plant Growth Promoting Bacterium)可以促进宿主植物生长发育，减少胁迫，提高抗逆性，增强宿主植物适应能力。施用植物促生菌及相关生物菌肥，是当前生态农业的首选。已报道的植物促生菌主要为假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮螺菌属(Azospirilum)、克雷伯菌属(Klebsiella)、草螺菌属(Herbaspirillum)等菌株。

草螺菌(Herbaspirillum sp.)是一类嗜用有机酸、耐性强、微需氧、略呈弯曲的革兰氏阴性非发酵杆菌，可在高糖培养基上生长但不利用蔗糖的细菌类群。草螺菌(Herbapirillumsp.)隶属变形杆菌门(Proteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、伯克霍尔德氏目(Burkholderiale)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、草螺菌属(Herbaspirillum)，大多分布在植物的根部或者茎干。1982年首次报道了草螺菌属的第一个种H.seropedicae。截至2017年底，已报到该属十多种。这些Herbaspirillum属细菌功能各异。如H.aquaticum是人体致病菌，H.chlorophenolicum可以降解环境中的4-氯酚，而H.frisingense和H.seropedicae可以促进植物生长，其促生机制包括固氮、溶磷、和提高植物乙烯合成。H.rubrisubalbicans既可以降解环境中的污染物，也可引起水稻的病害。Herbapirillum属中，即使是同种菌，不同的菌株生物学特性也相差很大。如H.seropedicae菌株Os45能引起水稻根系病害，菌株RAM4能降低蚕豆根系干重，而菌株Z-152却能显著提高玉米的抗旱性。总体来说Herbaspirillum属的不同菌种特性各异，其中能够促进植物生长和降解环境污染物的菌种具有很好应用开发前景。

Herbaspirillum huttitense5-28(以下简称亚种H.5-28)(CCTCC NO：M 2017149)是在中药材附子体内分离得到的根系促生菌，研究表明其具有促进植物生长、提高植物抗病性的作用。LysobacteryanansisSNNU513(CGMCC No.8375，ATCCBAA-2621)(以下简称SNNU513)是在中药材远志根系分离获得的一株细菌，该细菌能定殖于植物体内，通过分泌抗菌蛋白质拮抗诸多病原菌。枯草芽孢杆菌是目前常用的一类生防菌。

发明内容

本发明的第一个目的是提供该亚种H.5-28菌种大量培养方法。

本发明的第二个目的是提供该亚种H.5-28菌种或以该菌种为主要活性成分所制备出来的生物菌肥在抗玉米青枯病、小麦纹枯病、附子根腐病中的新的应用。

本发明中的主要细菌为草螺菌属(Herbaspirillum)的亚种H.5-28，本发明中已经对其作了详细的分析并对其进行更详细的命名。该菌于2017年4月10日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为：中国武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M 2017149。其基因组包含大小两条染色体，无基因岛，无CRISPR系统，可转化硝酸盐，可固氮、溶磷，可分泌水杨酸和吲哚乙酸。所述本发明亚种H.5-28菌株的菌落特征为：NA琼脂平板生长菌落小，淡黄色，菌落质地粘液性、表面光滑、反光，菌落边缘整齐平滑，菌体为略弯曲的杆状，大小0.6-0.7μm×2-4μm，适宜生长温度28℃-37℃，为兼性厌氧型菌株。

亚种H.5-28菌种培养方法，以亚种H.5-28菌种为原料，包括下述步骤，

(1)菌种活化：将亚种H.5-28菌株接种到固体NA斜面培养基中，34℃活化培养48h；

(2)种子液的制备：从所述步骤(1)中的固体NA斜面培养基上挑取亚种H.5-28单菌落，接种到液体培养基中，在34℃、180r/min的条件下培养12-16h，得到种子液；

(3)发酵培养：将所述步骤(2)得到的种子液进行发酵培养，得到发酵液；

所述发酵培养的培养条件为：液体培养基，接种量3％，28-37℃，180r/min，培养时间48h。

作为本发明进一步的方案，所述步骤(1)中，所述固体NA斜面培养基的配方为，蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl 5g，氨苄青霉素75mg，琼脂15g，水1000ml，pH 6.8-7.2；连续转接3代，确保菌株纯度。

作为本发明进一步的方案，在所述步骤(2)和所述步骤(3)中，所述液体培养基的配方相同，均为，每升无菌水中，葡萄糖10g，蛋黄卵磷脂0.2g(75％的乙醇溶解)，CaCO₃ 5g，K₂HPO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.002g，MnSO₄·7H₂O 0.002g，NaCl 0.1g，KCl0.1g，氨苄青霉素75mg，pH 6.8-7.2。

本发明还提供了一种生物菌肥，该生物菌肥是由上述所述的亚种H.5-28菌种为主要活性成分制备出来的。

该生物菌肥的制备方法是，

(1)室温下配制包埋剂溶液(W/V)，包含：海藻酸钠3％、聚乙烯醇2.5％、SiO₂3.5％和CaCO₃0.3％；高温高压灭菌20min，冷却至室温，得包埋剂溶液A；

(2)平板划线培养Lysobacter yanansis SNNU513(CGMCC No.8375，ATCCBAA-2621)(简称SNNU513)和枯草芽孢杆菌菌株：分别挑取SNNU513和枯草芽孢杆菌菌株的单克隆菌落，并分别接种至250ml LB液体培养基中，在37℃，180r/min的培养条件下培养至对数期；

(3)将所培养好的含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物和步骤(2)活化好的SNNU513、枯草芽孢杆菌按体积比5:3:2接种于LB液体培养基，在37℃，180r/min的培养条件下培养18-20h，得到混合菌培养物B；

(4)将所述步骤(1)得到的包埋剂溶液A和所述步骤(3)得到的混合菌培养物B按质量比5:2混合，恒温搅拌混匀，然后匀速加入到交联剂溶液(2.5％CaCl₂)中，使滴入液形成2-3mm的小球，交联24h，滤出颗粒，用无菌水洗涤，得包埋颗粒C；

(5)将所述步骤(4)得到的包埋颗粒C转移到LB液体培养基中，接种量40％，在34℃、180r/min的条件下培养72h，得微生物菌剂D；

(6)将所述步骤(5)得到的微生物菌剂D恒温干燥至恒重，得到该生物菌肥。

进一步的，本发明还提供了该生物菌肥在抗玉米青枯病、小麦纹枯病、附子根腐病多种病害中的应用。

本发明早前在乌头不同部位分离出来内生菌Herbaspirillum sp.Aconite5-28，其能提高植物活力，促进植物生长，能定殖于植物的茎和叶中。基于此，本发明系统鉴定该菌株为亚种H.5-28(CCTCC NO：M 2017149)，本发明提供了一种亚种H.5-28菌株的培养方法，本发明还提供了一种以亚种H.5-28菌种为主要活性成分制备的生物菌肥。本发明还提供了该生物菌肥在抗玉米青枯病、小麦纹枯病、附子根腐病中的应用。

本发明方法具有如下优点：

本发明中的亚种H.5-28菌种属于植物根际促生菌，经系统研究后鉴定为Herbaspirillum huttitense 5-28，在促进植物生长和提高植物抗病性方面具有很好的应用效果。

(1)本发明提供了一种快速大量培养亚种H.5-28菌种的方法，有利于该菌及其发酵培养物的开发利用。其中，本发明提供的液体培养基是针对亚种H.5-28可以固氮溶磷的特性设计得到，添加蛋黄卵磷脂有助于发挥亚种H.5-28菌株溶解有机磷的特点，同时此培养基含少量的氮元素有助于发挥亚种H.5-28菌株可以固氮的特点。

(2)本发明揭示了亚种H.5-28菌种通过调节宿主植物体内水杨酸、茉莉酸、乙烯和脱落酸的含量进而提高植物的抗病能力；该机制的阐明有助于以亚种H.5-28为组分开发生物菌肥。

(3)以亚种H.5-28菌种为原料制备的生物菌肥具有促生、提高植物抗病性以及拮抗植物病原菌的特点，属于新型的多功能生物肥料；亚种H.5-28菌种通过影响固氮、溶磷以及合成乙烯等相关途径促进宿主植物生长发育，亚种H.5-28菌种可以定殖于宿主体内，通过调节宿主植物激素的方式提高宿主抗病能力；SNNU513菌能定殖进入植物体内分泌胞外蛋白拮抗病原菌，而枯草芽孢杆菌主要分布在土壤中。亚种H.5-28菌、SNNU513菌、枯草芽孢杆菌三者之间不存在空间和营养的竞争，可以良好地生长，无拮抗作用，达到促生与抗病的作用。

附图说明

图1a是亚种H.5-28菌株扫描电镜照片；

图1b是亚种H.5-28菌在不同温度的生长曲线；

图2是亚种H.5-28的抗生素敏感性对比分析图；

图3是亚种H.5-28染色体基因组视图，包括，染色体1和染色体2；

图4是基于所有的单拷贝基因系统发育树；

图5是ANI聚类图；

图6是亚种H.5-28在不同液体培养基的生长情况的对比图；

图7是亚种H.5-28固氮、溶磷和分泌嗜铁素的能力验证图，其中，图7A为亚种H.5-28在无氮培养基生长情况；图7B为亚种H.5-28在无机磷培养基生长情况；图7C为亚种H.5-28在有机磷培养基生长情况；图7D为亚种H.5-28在CAS培养基生长情况；

图8A是激光共聚焦下未用亚种H.5-28(YFP)处理的拟南芥根部图；图8B是激光共聚焦下亚种H.5-28(YFP)处理的拟南芥根部定殖图；

图9A是亚种H.5-28对PstDC3000生长的影响图(牛津杯法)，其中，图A：1-5表示亚种H.5-28浓度为OD₆₀₀＝1.0、0.8、0.6、0.4、0.2，Pst DC3000的浓度为OD₆₀₀＝0.6；图9B是亚种H.5-28对PstDC3000生长的影响图(平板对峙法)，其中，图B：平板左侧为亚种H.5-28，平板右侧为Pst DC3000；

图10是PstDC3000侵染拟南芥2d后的症状对比图；其中，A：无菌水处理拟南芥，叶片接种PstDC3000；B：亚种H.5-28浇菌处理拟南芥，叶片接种PstDC3000；C：空白对照，叶片接种10mM MgCl₂；

图11是不同处理的拟南芥病情指数图，其中，从左到右依次为亚种H.5-28未处理拟南芥后接种PstDC3000，亚种H.5-28处理拟南芥后接种PstDC3000，亚种H.5-28未处理拟南芥后未接种PstDC3000，亚种H.5-28处理拟南芥后未接种PstDC3000；

图12是不同处理的拟南芥叶片台盼蓝染色效果对比图，其中，从左到右依次为亚种H.5-28未处理拟南芥12h后未接种PstDC3000，亚种H.5-28处理拟南芥12h后未接种PstDC3000，亚种H.5-28处理拟南芥12h后接种PstDC3000，亚种H.5-28未处理拟南芥12h后接种PstDC3000；亚种H.5-28未处理拟南芥24h后未接种PstDC3000，亚种H.5-28处理拟南芥24h后未接种PstDC3000，亚种H.5-28处理拟南芥24h后接种PstDC3000，亚种H.5-28未处理拟南芥24h后接种PstDC3000；亚种H.5-28未处理拟南芥48h后未接种PstDC3000，亚种H.5-28处理拟南芥48h后未接种PstDC3000，亚种H.5-28处理拟南芥48h后接种PstDC3000，亚种H.5-28未处理拟南芥48h后接种PstDC3000；

图13是不同处理拟南芥的水杨酸调控途径基因表达量热图，其中，从左到右依次为亚种H.5-28处理拟南芥0h后接种Pst DC3000，亚种H.5-28未处理拟南芥0h后接种PstDC3000；亚种H.5-28处理拟南芥24h后接种PstDC3000，亚种H.5-28未处理拟南芥24h后接种PstDC3000；亚种H.5-28处理拟南芥48h后接种Pst DC3000，亚种H.5-28未处理拟南芥48h后接种PstDC3000；

图14是不同处理拟南芥的茉莉酸调控途径基因表达量热图，其中，拟南芥的处理方式同图13；

图15是不同处理拟南芥的乙烯调控途径基因表达量热图，其中，拟南芥的处理方式同图13；

图16是不同处理拟南芥的脱落酸调控途径基因表达量热图，其中，拟南芥的处理方式同图13；

图17是不同处理拟南芥的WRKY基因家族基因表达量热图，其中，拟南芥的处理方式同图13；

图18是不同处理拟南芥的相关基因相对表达量对比图，其中，拟南芥的处理方式同图13；

图19是不同处理拟南芥的水杨酸含量变化图，其中，从左到右依次为亚种H.5-28处理拟南芥后接种Pst DC3000，亚种H.5-28未处理拟南芥后接种PstDC3000；

图20是不同处理拟南芥的茉莉酸含量的变化图，其中，从左到右依次为亚种H.5-28处理拟南芥后接种Pst DC3000，亚种H.5-28未处理拟南芥后接种Pst DC3000；

图21是亚种H.5-28、溶杆菌SNNU513和枯草芽孢杆菌共生存图，其中，图中序号分别代表：1为枯草芽孢杆菌，2为亚种H.5-28，3为溶杆菌SNNU513；

图22是菌株亚种H.5-28在不同培养基生长情况。

具体实施方式

实例1：亚种H.5-28菌种的鉴定：

用常规方法测定亚种H.5-28的形态特征和生理生化特性测定。结果如下。

(1)形态特征：NA琼脂平板生长菌落小，淡黄色，菌落质地呈粘液型、表面光滑、反光、边缘整齐平滑，菌体为略弯曲的杆状，大小为(0.6-0.7)μm×(2-4)μm，适宜生长温度28℃-37℃，为兼性厌氧型菌株。所述的NA培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氨苄青霉素75mg，NaCl 5g，琼脂15g，水1000ml，pH为6.8-7.2；革兰氏染色呈阴性；如图1a和图1b所示。

(2)生理生化实验：亚种H.5-28进行的生理生化特性试验，如图2和表1所示；亚种H.5-28具有氨苄、氯霉素、链霉素抗性，对卡那霉素敏感。

表1亚种H.5-28的生化特征

注：+，阳性；-，阴性。Note：+，Positive；-，negative.

(3)亚种H.5-28全基因组分析

使用Pacbio测序平台对亚种H.5-28进行全基因组测序，并对数据进行生物信息学分析。

亚种H.5-28全基因序列注释结果如下表2所示，全基因组大小为5891544bp，有2条染色体，0个质粒。亚种H.5-28染色体1大小为4841380bp，编码基因为4371个，misc RNA16个，rRNA 3个，tRNA 51个，tmRNA 1个，GC含量为62.41％；亚种H.5-28染色体2大小为1050164bp，编码基因为958个，misc RNA 2个，rRNA 6个，tRNA 12个，tmRNA 0个，GC含量为62.57％。含有氨苄霉素抗性基因。与固氮相关的基因有：fdxN、fixA、fixB、fixC、fixU、fixQ、fixO、fixJ、NRI、NRII、NRPII、nirIIA；与溶磷的相关基因有Pyk、PykII、Msy、isy、pyc、Csy、hsy、shk。亚种H.5-28不具有莽草酸激酶功能相关的溶磷基因。

亚种H.5-28染色体基因组视图如图3所示，亚种H.5-28染色体1基因组大小为4841380bp；亚种H.5-28染色体2基因组大小为1050164bp。两图由外至内分别是：第一圈代表tRNA相关基因；第二圈代表正向基因的COG注释——以不同的颜色区分；第三圈代表正向基因的位置；第四圈代表rRNA基因；第五圈代表反向基因坐标；第六圈代表反向基因COG注释；第七圈代表GC含量，向外突出的表示高于均值，向内突出的表示低于均值；第八圈代表GC skew值，绿色表示大于0，紫色表示小于0。GC skew值为正值时，正链倾向于转录CDS；GCskew值为负值时，负链倾向于转录CDS。

表2序列注释结果统计表

(4)比较基因组分析

对亚种H.5-28同属的10个菌株和亚种H.5-28临近属的4个菌株，以及常用的促进植物生长的3个菌株的所有的单拷贝基因进行进化分析。如图4所示，亚种H.5-28与H.huttiense亲缘关系最近。除此之外，B.cepacia和亚种H.5-28亲缘关系较近，同属于伯克霍尔德氏目，而A.halopraeferens和R.mongolense与亚种H.5-28亲缘关系很远。

全基因组平均核酸序列一致性(ANI)被认为是一种非常可靠的鉴别菌种方法。如图5所示，亚种H.5-28与H.huttiense的ANI值为97.44％，亚种H.5-28与H.seropedicae的ANI值为88.6％。可以判定亚种H.5-28是属于H.huttiense的，命名为Herbaspirillumhuttiense 5-28。

本实例综合亚种H.5-28的形态特征、生理生化指标、全基因组分析和比较基因组分析，初步得到亚种H.5-28与H.huttiense亲缘关系最近，属于H.huttiense，鉴定亚种H.5-28为草螺菌属亚种。实例2：亚种H.5-28的制备方法

2.1菌种活化

将亚种H.5-28菌株接种到固体斜面培养基中，于34℃活化培养48h。所述固培养基配方为蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl 5g，琼脂15g，水1L，pH 6.8-7.2。连续转接3代，确保菌株纯度后，再接种到种子液中使用。

2.2种子液制备

从固体斜面培养基上挑取亚种H.5-28单菌落，接种到NA液体培养基中，于恒温振荡培养箱中振荡培养，34℃，180r/min，培养16h，即得种子液。

2.3发酵培养

将种子液接种到不同的液体培养基中进行发酵培养，所述不同液体培养基配方为见表3，接种量3％，28-37℃，180r/min培养时间48h，得到发酵液。

表3不同液体培养基配方

如图6所示，综合对比亚种H.5-28在六种培养基种的生长状况，得出亚种H.5-28在本发明提供的2号、NA和KB培养基上均能良好生长，其中本发明提供的2号培养基中亚种H.5-28生长更佳。综合考虑，本发明提供的2号培养基可以充分发挥亚种H.5-28固氮溶磷的特点，故选择本发明提供的2号培养基用来培养亚种H.5-28。

实例3：亚种H.5-28固氮、溶磷和分泌嗜铁素能力验证

3.1固氮能力检测

配制无氮培养基(甘露醇10g、磷酸二氢钾0.2g、七水硫酸镁0.2g、二水硫酸钙0.1g、氯化钠0.2g、碳酸钙5g、琼脂15g、水1L)；将生长至OD₆₂₀＝0.6的亚种H.5-28菌液5μL接入固体无氮培养基，34℃培养1-5d，观察生长情况。

3.2溶磷能力检测

配制PKO培养基(无机磷培养基)：葡萄糖10g，磷酸钙5.0g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.2g，氯化钾0.2g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.002g，硫酸亚铁0.002g，琼脂18g，pH＝6.8-7.2，将生长至OD₆₂₀＝0.6的亚种H.5-28菌液5μL接入固体PKO培养基，34℃培养1-7d，观察生长情况。

配制蒙金娜培养基(有机磷培养基)：葡萄糖10g，碳酸钙5.0g，蛋黄卵磷脂0.20g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.2g，氯化钾0.2g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.002g，硫酸亚铁0.002g，琼脂18g，pH＝6.8～7.2，将生长至OD₆₂₀＝0.6的亚种H.5-28菌液5μL接入固体蒙金娜培养基，34℃培养1-7d，观察生长情况。

3.3分泌嗜铁素能力检测

将生长至OD₆₂₀＝0.6的亚种H.5-28菌液5μL接入固体CAS培养基，34℃培养1、3、5d，观察是否产生是嗜铁圈。

从图7A可以得到：亚种H.5-28可以在无氮培养基上生长，说明其自身具有固氮能力。

从图7B、C可以得到：亚种H.5-28在无机磷培养基上生长但不形成溶磷圈，在有机磷培养基上生长并形成溶磷圈，说明其具有溶解有机磷的能力。亚种H.5-28溶解无机磷溶解量为9.64±0.60μg/ml,溶解有机磷溶磷量为32.17±1.13μg/ml，这说明亚种H.5-28具有溶解无机磷和有机磷的能力。在PKO固体培养基上没有形成溶磷圈是因为其溶解无机磷的能力非常弱。综上，亚种H.5-28溶解无机磷的能力非常弱，溶解有机磷的能力较强。

从图7D可以得到看出：亚种H.5-28可以生长但没有产生嗜铁圈，说明亚种H.5-28不具有产生嗜铁素的能力，这可能是由于基因的重排所导致。

本实例通过亚种H.5-28固氮、溶磷和分泌嗜铁素能力验证发现，亚种H.5-28可以在无氮培养基上生长，说明其自身具有固氮能力；亚种H.5-28溶解无机磷的能力非常弱，溶解有机磷的能力较强；亚种H.5-28不具有产生嗜铁素的能力。

实例4：亚种H.5-28分泌水杨酸和吲哚乙酸检测

4.1样品前处理

(1)样品制备：将亚种H.5-28菌株接种于NA培养基活化，3d后将活化好的菌株接种于50ml的NA培养基中，置于34℃、180r/min的摇床中培养16h后。取菌株发酵液在4℃、12000r/min的条件下离心10min之后，收集上清液。重复3次。

(2)SPE：a.活化，分别用6ml纯甲醇溶液和6ml 10％甲醇溶液活化C18SPE column；b.上样，将收集的上清液缓慢注入柱内，控制上样速度为1ml/min，弃去流出液；c.淋洗，待样品加完，用6ml10％甲醇溶液淋洗2次，弃去流出液；d.洗脱，最后用5ml80％甲醇溶液洗脱2次，收集洗脱液。

(3)样品浓缩：将收集的洗脱液在室温下氮气吹干至1ml左右，再用纯甲醇溶解定容在2ml的离心管中，保存于4℃冰箱内，待HPLC-MS分析。

4.2色谱条件：采用XB-C18色谱柱。液相条件：流动相为甲醇(A)和0.1％的甲酸水(B)，洗脱梯度(在0-2min内流动相A保持15％，在2-5min流动相A从15％升到50％，在5-6min流动相A从50％升到100％，在6-8min保持100％，然后在1min中内降到15％，保持3min)，流速为0.3ml/min，柱温35℃，进样量5μL。质谱条件：采用电喷雾电离源正电离子模式，喷雾电压0.5KV，鞘气压力11L/min，鞘气温度350℃，干燥气流量10L/min，毛细管电压3.5KV。采用多反应监测(MRM)扫描模式。监测离子：220.1→135.8。分段器为100V，碰撞能量15V。

4.3绘制吲哚乙酸标准曲线，得到其线性回归方程为y＝49.023x+109.070，相关系数R＝0.999，说明吲哚乙酸标准溶液的质量浓度与其吸光值之间呈线性正相关关系，计算得亚种H.5-28样品的吲哚乙酸含量为3.747±0.06ng/ml；绘制水杨酸标准曲线，得到其线性回归方程为y＝449.821x+249.217，相关系数R＝0.999，说明水杨酸标准溶液的质量浓度与其吸光值之间具有高度的线性正相关关系，计算得亚种H.5-28样品的水杨酸含量为0.31±0.03ng/ml。

植物激素一般是指植物细胞受到特定的信号诱导，在植物的某些组织内代谢合成能促进植物生长的微量有机化合物。一些细菌也可以微量的分泌这些激素，这些微量的激素可以与植物细胞特定的蛋白受体结合从而促进植物生长，提高植物的抗病性。本发明通过LC-MS检测得到亚种H.5-28样品吲哚乙酸含量为3.747±0.06ng/ml，水杨酸含量为0.31±0.03ng/ml。说明亚种H.5-28可以产生吲哚乙酸和水杨酸。

通过本实例在分子水平验证了亚种H.5-28对植物的促生途径，发现亚种H.5-28可以产生吲哚乙酸和水杨酸，从而促进植物生长，提高植物抗病性。

实例5：亚种H.5-28在拟南芥根部定殖

5.1拟南芥幼苗培育培养基

配制1/2MS培养基(配方：M519粉末2.215g，蔗糖10g，琼脂粉10g，水1L，pH 5.8左右)。将拟南芥幼苗的种子消毒后，置于1/2MS培养基上，22-23℃萌发7d。

5.2亚种H.5-28的培养

参照实例2的方法培养预先已带黄色荧光蛋白(YFP)标记的亚种H.5-28，培养至OD₆₀₀＝0.4-1.0时，6000rpm离心获得菌体，无菌水调整菌液浓度至OD₆₀₀＝1.0，备用。

5.3拟南芥的种植

将营养土、石英砂和蛭石等置于高压锅中灭菌121℃，60min。降到室温，按8:1:1的比例将营养土、石英砂和蛭石搅拌均匀，用75％的酒精给花盆和托盘消毒，向托盘中加入适量的无菌水，将土均匀分装到花盆，放入托盘，至黑土完全浸没，倒掉托盘内剩余的水，待用。将培育好的拟南芥幼苗种植于花盆。

5.4亚种H.5-28在拟南芥根部定殖

亚种H.5-28的YFP标记的质粒转化方法参照分子克隆手册(Sambrook&Russel，2001)，将成功转化带有YFP标记的亚种H.5-28接种到加有50μg/mL卡那抗生素的NA培养基，放入摇床培养至OD₆₀₀＝0.4左右，取出6000r/min离心，弃上清，加无菌水离心，弃上清；将亚种H.5-28菌液调至OD₆₀₀＝0.8，倒入无菌的培养皿；同时将灭菌的无菌水作为对照组；将拟南芥种子萌发生长一周的幼苗挑选长势均一的拟南芥幼苗20株，平均分成两组，一组放入加有亚种H.5-28的培养皿中，一组放到对照组的培养皿中，放置过夜；制备装片，提前超声处理载玻片的盖玻片。在激光共聚焦下对带有YFP标记的亚种H.5-28处理组和对照组拟南芥根部进行观察。

如图8所示，未经亚种H.5-28处理的拟南芥根部的细胞间隙未看到黄色荧光的分布(图8A)，而经亚种H.5-28处理组在拟南芥根部的细胞间隙可以看到明显的黄色荧光的分布。

本实例发现亚种H.5-28可以定殖在拟南芥根部，并进入拟南芥根部的细胞间隙。

实例6：亚种H.5-28诱导拟南芥对Pseudomonas syringaepv.TomatoDC3000(以下简称PstDC3000)的抗病性

6.1亚种H.5-28的培养(培养方法同实例5)

6.2PstDC3000的培养

从-80℃取出保存的PstDC3000解冻，用接菌环接种到KB培养基：配方同《常见细菌系统鉴定手册》，2d后挑取到KB液体培养基，28℃培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，6000rpm离心10min弃上清，加入无菌水重复上述操作，再使用10mM的MgCl₂溶液调整菌液溶度为OD₆₀₀＝0.01，备用。

6.3亚种H.5-28与PstDC3000的拮抗作用

本实验采用两种方法，牛津杯法和平板对峙法研究亚种H.5-28菌种对PstDC3000的抑菌活性，每个实验至少重复3次。

6.4拟南芥的准备(培养方法同实例5)

6.5亚种H.5-28诱导拟南芥对Pst DC3000产生抗病性的试验

选用OD₆₀₀＝1.0的亚种H.5-28，处理拟南芥3d后，拟南芥叶片接种OD₆₀₀＝0.01的PstDC3000对拟南芥进行处理，第3d统计病情指数。

6.6台盼蓝染色

对以上不同处理组的拟南芥叶片进行台盼蓝染色。

如图9所示，牛津杯法的结果表明，亚种H.5-28浓度为OD₆₀₀＝1.0、0.8、0.6、0.4、0.2，PstDC3000的浓度为OD₆₀₀＝0.6时，亚种H.5-28的生长状态良好，说明亚种H.5-28菌种对PstDC3000的生长无明显抑制作用(图9A)。平板对峙法的结果表明，亚种H.5-28与PstDC3000混合培养二者生长状态良好，无明显拮抗作用(图9B)。两组实验结果均表明，亚种H.5-28与PstDC3000相互无明显拮抗作用，可以共存生长。则后续的实例中证实亚种H.5-28处理后，接入PstDC3000的拟南芥病情指数降低是由于其他机制引起，而不是亚种H.5-28直接拮抗PstDC3000的结果。

如图10所示，接种病原菌Pst DC3000后，亚种H.5-28处理拟南芥组与未经亚种H.5-28处理拟南芥组相比，叶片发病症状较轻。亚种H.5-28处理后拟南芥叶片轻微变黄，而未经亚种H.5-28处理组拟南芥病症严重，叶片萎焉坏死并出现溃疡。

通过对拟南芥病情指数统计表明，如图11所示，亚种H.5-28处理组病情指数为52.9％，而亚种H.5-28未处理接PstDC3000组病情指数为76.3％，且两组具有显著性差异(p<0.05)；亚种H.5-28可以显著诱导拟南芥对Pst DC3000产生抗病性。

参见图12，结果表明，亚种H.5-28处理拟南芥后接PstDC3000组和未经亚种H.5-28处理接PstDC3000组的拟南芥叶片均出现蓝色沉淀。随着时间增长，蓝色沉淀加深。经亚种H.5-28处理接Pst DC3000组在24h和48h拟南芥叶片蓝色沉淀加深，在拟南芥叶片局部形成明显超敏斑。

目前在研究根际促生菌以及其他的一些有益菌提高植物抗病性中，很多研究者选用模式植物拟南芥作为供试植物，选用模式病原菌Pst DC3000作为病原菌供试菌株。PstDC3000接种拟南芥是目前全世界范围内研究植物病害通用的模型。同样，本研究也选用拟南芥为供试植物，PstDC3000作为病原菌。好处在于拟南芥的全基因组已经很早就测序完成，对于拟南芥抗病相关的一些基因和抗病机制研究也相对清楚，这对于后续分析亚种H.5-28提高拟南芥的抗病具体机制奠定了良好的基础。本实例发现，亚种H.5-28预处理拟南芥后，拟南芥叶片内死细胞的数量明显也减少，拟南芥发病症状也有所减轻，表明亚种H.5-28能够诱导拟南芥对Pst DC3000产生抗病性，能够有效抑制病原菌的增殖，从而提高植物的抗病性。

实例7：亚种H.5-28抗病性的基因分析及验证

拟南芥处理方法同实例6，亚种H.5-28处理拟南芥并接种Pst DC3000后，分别于0h、24h、48h时间段采集拟南芥材料。提取RNA，二代测序技术进行转录组测序，分析拟南芥抗病相关的差异基因，特别对参与水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)、脱落酸(ABA)途径以及WRKY基因家族相关基因表达量进行深入分析和qRT-PCR验证。主要结果如下：

其中水杨酸途径的基因进行基因表达量热图分析，如图13所示，在水杨酸途径抗病相关基因中，与对照组相比较，处理组PR1、PR5和TGA9基因表达量显著上调，BOP1和NPR1表达量显著下调。

对茉莉酸相关基因进行基因表达量热图分析，如图14所示，与对照组相比较，处理组LOX1、PDF1.2C和COI基因表达量显著上调，VSP1、VSP2、PDF1.2B、PDF1.2A和JAZ10基因表达量显著下调。

对乙烯途径相关基因基因表达量热图分析，如图15所示，与对照组相比较，处理组ERF054和ERF13基因表达量显著上调，ERF003、ERF010、ERF018、ERF020、ERF022、ERF061和ERF11基因表达量显著下调。

对脱落酸途径相关基因基因表达量热图分析，如图16所示，与对照组相比较，处理组AAO1基因显著上调，AAO4、PYL3和PYL7基因表达量显著下调。

对参与拟南芥对病原菌防卫反应的WRKY基因家族基因表达量热图分析，如图17所示，与对照组相比较，处理组WRKY38、WRKY64、WRKY65、WRKY63和WRKY67基因表达量显著上调，WRKY55、WRKY40和WRKY66基因表达量显著下调。

对亚种H.5-28处理拟南芥叶片接种Pst DC3000组和对照组的拟南芥叶片在0h、24h和48h采样，对不同时间的处理组和对照组的差异基因进行qRT-PCR检测。

如图18所示。qRT-PCR检测的相关基因的表达量变化状况与转录组测序结果一致。

本实例发现亚种H.5-28诱导拟南芥对PstDC3000产生抗病性，通过同时激活水杨酸以及茉莉酸/乙烯信号通路，激活拟南芥的防卫基因，从而进一步抵抗病原菌的入侵。

实例8：亚种H.5-28在植物抗病性相关途径验证

8.1亚种H.5-28的培养(具体方法参照实例5)

8.2Pst DC3000的培养(具体方法参照实例6)

8.3亚种H.5-28处理拟南芥(具体方法参照实例6)

8.4拟南芥叶片水杨酸和茉莉酸的提取

用OD₆₀₀＝1.0的亚种H.5-28处理拟南芥3d后，接种Pst DC3000(OD₆₀₀＝0.002)菌悬液。提取拟南芥叶片中水杨酸和茉莉酸激素，进行HPLC-MS测定。

参见图19，与对照组相比，亚种H.5-28处理组水杨酸含量升高了3.4倍，达到了极显著水平(p<0.001)。

参见图20，与对照组相比较，茉莉酸的含量显著升高了1.4倍左右，差异显著(p<0.05)。

本实例再次证明亚种H.5-28诱导拟南芥对Pst DC3000能产生抗病性，主要可能通过激活水杨酸和茉莉酸信号通路实现。该机制的阐明，为亚种H.5-28用作菌肥的开发奠定了理论基础。

实例9：三种细菌的相互拮抗作用验证

亚种H.5-28培养方法同实例2；SNNU513菌株和枯草芽孢杆菌菌株，在室温融化，经平板划线培养，挑取单克隆菌落接种至250ml LB液体培养基中，37℃，180r/min培养至对数期。

分别取亚种H.5-28、SNNU513和枯草芽孢杆菌菌液各2uL，涂布于一个LB平板上。34℃培养。观察相互拮抗效果。如图21所示。

本实施例结果表明，亚种H.5-28、SNNU513和枯草芽孢杆菌三者之间不存在空间和营养的竞争，生长状况良好，无拮抗作用。

实例10：一种以亚种H.5-28为活性原料制作的生物菌肥

10.1菌种接种比例选择

第一步：配制包埋剂溶液(W/V)：海藻酸钠3％、聚乙烯醇2.5％、SiO₂ 3.5％和CaCO₃0.3％，121℃灭菌20min，冷却至室温，得包埋剂溶液A。

第二步：将实例9中活化好的亚种H.5-28、SNNU513和枯草芽孢杆菌按不同比例(参照表4)接种于LB培养基，37℃摇床培养18-20h的培养液的混合菌培养物B。

第三步：将包埋剂溶液A和混合菌培养物B按5:2于恒温磁力搅拌器上震荡混匀，然后匀速加入到2.5％CaCl₂溶液中，使滴入液形成2-3mm的小球，交联24h，滤出颗粒，用无菌水洗涤，得包埋颗粒C。

第四步：将包埋剂颗粒按2:3转移到LB培养基中，以34℃，180r/min，增殖培养72h，得微生物菌剂D。称取微生物菌剂D1.0g，溶解于10ml 0.2mol/L的柠檬酸钠溶液中，充分振荡至颗粒完全溶解，使菌体释放完全，稀释平板法于34℃培养1d，菌落计数。

表4不同比例菌种接种菌肥总活菌数

由表4可知，亚种H.5-28、溶杆菌SNNU513和枯草芽孢杆菌三种菌不同比例组合，总活菌数不同，其中亚种H.5-28：溶杆菌SNNU513：枯草芽孢杆菌＝5:3:2时，总活菌数量最多，因此，后续的实验选用该比例。

10.2最优培养基选择

将实施例10.1中的LB培养基换成表5中的培养基，其他的步骤不变。菌落计数。

表5各培养基配方

由图22可知，不同的培养基中，活菌总数不同，其中经NA、KB和LB培养基培养后效果佳，但NA培养基和KB培养基原料价格昂贵，综合考虑，选择LB培养基。

10.3包埋主料浓度比选择

将实施例10.1中的包埋剂按表6制作不同包埋剂，其他的步骤不变。测定颗粒的机械强度、传质速率、活菌数、增殖倍数及包埋率和包埋颗粒活菌释放率。结果见表7。

表6不同包埋主料浓度比

表7不同包埋主料浓度比菌肥数据统计表

注：不同字母表示不同处理间差异达到5％显著水平。

由表7可知，包埋剂组分海藻酸钠、聚乙烯醇、SiO₂和CaCO₃比例不同，包埋后的颗粒机械强度、传质速率、活菌数、增殖倍数及包埋率和包埋颗粒活菌释放率等均有明显差异。总体来说，海藻酸钠3％、聚乙烯醇2.5％、SiO₂ 3.5％和CaCO₃ 0.3％制作包埋剂时，菌肥颗粒的机械强度、传质速率、活菌数、增殖倍数及包埋率和包埋颗粒活菌释放率最优。因此选择该比例制作菌肥。

10.4一种以亚种H.5-28为主要活性成分制备的生物菌肥

制备步骤如下：

第一步：配制包埋剂溶液(W/V)：海藻酸钠3％、聚乙烯醇2.5％、SiO₂ 3.5％和CaCO₃0.3％，121℃灭菌20min，冷却至室温，得包埋剂溶液A。

第二步：将实例9培养好的亚种H.5-28：溶杆菌SNNU513：枯草芽孢杆菌按体积比5:3:2接种于接种于LB培养基，37℃摇床培养18-20h的培养液的混合菌培养物B。

第三步：将包埋剂溶液A和混合菌培养物B按5:2于恒温磁力搅拌器上震荡混匀，然后匀速加入到交联剂溶液(2.5％CaCl₂)溶液中，使滴入液形成2-3mm的小球，交联24h，滤出颗粒，用无菌水洗涤，得包埋颗粒C。

第四步：将包埋颗粒C转移到LB培养基中，在34℃，180r/min的培养条件下，增殖培养72h，得微生物菌剂D。

第五步：将微生物菌剂D恒温干燥至恒重，即得该生物菌肥。

参照常规方法测定微生物菌剂D的有机质、水分、pH值、重金属As、Cd、Pb、Cr、Hg含量，参照10.2的方法细菌计数。

结果表明，本实例明得到的生物菌肥中有效活菌数(cfu)≥2.5亿/g，有机质(以干基计)≥50％(重量)，水分≤22％(重量)，pH值6.8，重金属As、Cd、Pb、Cr、Hg含量指标符合NY/T798-2004规定，理论上该生物菌肥可以用于农业生产实践。

实例11：生物菌肥与其他肥料的效果比较

选取三种肥料，包括普通化肥、市售菌肥、生物菌肥，进行效果对比，另做一组空白对照。生物菌肥按照本发明的方法制备。

将上述三种肥料使用于小麦、玉米和附子，植物培育过程中施肥3次，第一次作为基肥，第二、三次为追肥，每次施肥按照150kg/亩的标准施用。实验过程中仅施肥不一样，其他管理及育苗等一样。分别统计生长情况、发病指数等，结果见表8。

表8不同肥料使用效果统计表

注：不同字母表示不同处理间差异达到5％显著水平。

由表8的数据可知，本发明的生物菌肥比市场菌肥和普通化肥的效果都好。生物菌肥不仅对附子、小麦、玉米等具有明显的促生长作用，也对青枯病、根腐病、纹枯病等病害具有明显的防治或预防效果。同时，本发明的生物菌肥通过位点竞争、分泌植物促生物质和抗生素，抑制病原微生物的生长，提高植物抗青枯病、根腐病、纹枯病等多种病害的能力。

由上述多个实施例的实施以及验证，可知本发明的生物菌肥能够促进植物生长，增强植物的抗病能力。

以上仅是针对本发明的可行实施例的具体说明，但这些实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围。

Claims (7)

1.一种含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物。

2.权利要求书1所述的含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物的培养方法，其特征在于，包括下述步骤，

2.1菌种活化：将亚种H.5-28菌株接种到固体NA斜面培养基中，于34℃活化培养48h；

2.2种子液的制备：从所述步骤2.1中的固体NA斜面培养基上挑取亚种H.5-28单菌落，接种到液体培养基中，在34℃、180r/min的条件下培养12-16h，得到种子液；

2.3发酵培养：将所述步骤2.2得到的种子液进行发酵培养，得到发酵液；

所述发酵培养的培养条件为：液体培养基，接种量3％，28-37℃，180r/min，培养时间48h。

3.如权利要求2所述的含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物的培养方法，其特征在于，在所述步骤2.2和所述步骤2.3中，所述液体培养基的配方相同，均为：每升无菌水中，葡萄糖10g，蛋黄卵磷脂0.2g(75％的乙醇溶解)，CaCO₃5g，K₂HPO₄0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.002g，MnSO₄·7H₂O 0.002g，NaCl0.1g，KCl 0.1g，氨苄青霉素75mg，pH 6.8-7.2。

4.如权利要求1所述的含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物，其特征在于，所述细菌培养物中含有吲哚乙酸和水杨酸。

5.权利要求1所述的含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物在提高植物抗病性中的应用。

6.一种生物菌肥，其特征在于，所述生物菌肥是由权利要求1或权利要求2或权利要求3中所述的含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物为原料通过下述方法制备出来的：

6.1室温下配制包埋剂溶液(W/V)，包含：海藻酸钠3％、聚乙烯醇2.5％、SiO₂ 3.5％和CaCO₃ 0.3％；高温高压灭菌20min，冷却至室温，得包埋剂溶液A；

6.2平板划线培养Lysobacter yanansisSNNU513(CGMCC No.8375，ATCCBAA-2621)(简称SNNU513)和枯草芽孢杆菌菌株：分别挑取SNNU513和枯草芽孢杆菌菌株的单克隆菌落，并分别接种至250mlLB液体培养基中，在37℃，180r/min的条件下培养至对数期；

6.3将权利要求2或权利要求3所培养好的含有亚种H.5-28菌种的细菌培养物和所述步骤6.2活化好的SNNU513、枯草芽孢杆菌，按体积比5:3:2接种于LB液体培养基，在37℃，180r/min的培养条件下培养18-20h，得到混合菌培养物B；

6.4将所述步骤6.1得到的包埋剂溶液A和所述步骤6.3得到的混合菌培养物B按质量比5:2混合，恒温搅拌混匀，然后匀速加入到交联剂溶液(2.5％CaCl₂)中，使滴入液形成2-3mm的小球，交联24h，滤出颗粒，用无菌水洗涤，得包埋颗粒C；

6.5将所述步骤6.4得到的包埋颗粒C转移到LB液体培养基中，接种量40％，在34℃、180r/min的条件下培养72h，得微生物菌剂D；

6.6将所述步骤6.5得到的微生物菌剂D恒温干燥至恒重，得到该生物菌肥。

7.权利要求6所述的生物菌肥在抗玉米青枯病、小麦纹枯病、附子根腐病中的应用。