CN111893075B - 一株阿氏芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株阿氏芽孢杆菌及其应用,属于微生物防治技术领域。经研究发现,本发明筛选得到的阿氏芽孢杆菌具有高效抑制包括禾谷镰刀菌、产黑色素短梗霉、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌等多种植物真菌病原菌的能力,使用后不会产生化学农药残留等一系列问题,从而可以少用甚至不用化学药剂,有利于绿色有机作物产品打造,推动农业产业的健康发展及生态环境保护,因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一株阿氏芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物防治技术领域,具体涉及一株阿氏芽孢杆菌。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
土传病害是指发生在植物根部或茎部以土壤为传播媒介的侵染性病害,如:立枯、纹枯、青枯、枯萎、疫病、猝倒、根腐、软腐、根结线虫、胞囊线虫等。其危害巨大,造成农作物的品质下降,大幅减产甚至是绝收。近年来由于长期施用化肥导致土壤的有机质减少,土壤微生物生态遭受破坏,使得土传病害连年加重,严重影响农业生产。
土传病害以其危害的广泛性和严重度已引起国内外同行的关注。为了控制土传病害,对防治技术研究已成为过去几十年各国研究的最主要内容。目前主要是通过采用化学药剂对土传病害进行防控,而化学药剂的长期使用,会造成水源土壤污染、生态平衡被破坏、农药残留、次要病害猖獗和使病源微生物产生抗药性等一系列的严重后果。
随着农业生产的不断发展,人们环保意识的增强,对食品安全性的要求也日益严格,使得生物防控土传病害成为当前研究和开发的热点。许多微生物是植物病原菌的自然天敌,尤其在防治土传病害方面有先天的优势。芽孢杆菌(Bacillus sp.)是自然界中分布最广泛的革兰氏阳性细菌之一,广泛分布于水、土壤等环境中。因为芽孢杆菌的抗逆性强,而且很多菌株能够促进植物生长、抑制病原菌对植物的危害,而成为农业生产中应用最为广泛的一种生防菌。
发明内容
基于上述现有技术的不足,本发明提供一株阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)D1,其在植物病害的生物防治方面具有非常好的效果,经研究证实,其对禾谷镰刀菌、产黑色素短梗霉、尖刀镰孢菌和立枯丝核菌等具有显著的抑菌作用,从而为植物病害的生物防治提供了新的菌种资源,因此具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的,本发明涉及以下技术方案:
本发明的一个方面,提供一株阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)D1,该菌株已于2020年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号),其生物保藏号为CGMCC No.20006。
所述阿氏芽孢杆菌D1的代谢物也属于本发明的保护范围。
本发明的第二个方面,提供一种微生物菌剂,其含有所述阿氏芽孢杆菌D1和/或含阿氏芽孢杆菌D1的代谢物。
上述微生物菌剂具体可以是病原菌抑制剂或病害抑制剂。
上述病原菌抑制剂的活性成分可以是阿氏芽孢杆菌D1和/或阿氏芽孢杆菌D1的代谢物,上述病原菌抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分,上述病原菌抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病原菌的抑制效果确定。
上述病害抑制剂的活性成分可以是阿氏芽孢杆菌D1和/或阿氏芽孢杆菌D1的代谢物,上述病害抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分,上述病害抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病害的抑制效果确定。
本发明的第三个方面,上述阿氏芽孢杆菌D1和/或阿氏芽孢杆菌D1的代谢物在如下1)-4)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围:
1)在抑制病原菌中的应用;
2)在制备病原菌抑制剂中的应用;
3)在制备病害抑制剂中的应用;
4)在抑制病害中的应用。
上文中,所述病原菌可以为下述全部或部分病原菌:禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、产黑色素短梗霉(Aureobasidium pullulans)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。
上文中,所述病害可以为下述全部或部分病害:禾谷镰刀菌引起的病害,如禾谷镰刀菌病;产黑色素短梗霉引起的病害,如煤污病;尖刀镰孢菌引起的病害,如枯萎病;立枯丝核菌引起的病害,如立枯病。
所述病害可以是作物病害,所述作物具体可以是粮食、水果或蔬菜,例如小麦、大麦、玉米、花生、棉花、大豆、苹果、香蕉、葡萄、柑橘、草莓、西瓜、西红柿、油菜、茄子、萝卜、豇豆、白菜等。
本发明的第四个方面,提供一种微生物菌肥,所述微生物菌肥其活性成分包括上述阿氏芽孢杆菌D1、上述阿氏芽孢杆菌D1的代谢物和/或上述微生物菌剂;
优选的,所述微生物菌肥还含有有机质、全钾、全氮,用于提供养分。
本发明的第五个方面,提供一种防治植物病害的方法,所述方法包括向植物植株表面和/或周围土壤中施加上述阿氏芽孢杆菌D1、上述阿氏芽孢杆菌D1的代谢物、上述微生物菌剂和/或上述微生物菌肥。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果:
上述技术方案首次报道一株阿氏芽孢杆菌,其具有高效抑制包括禾谷镰刀菌、产黑色素短梗霉、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌等多种植物真菌病原菌的能力,使用后不会产生化学农药残留等一系列问题,从而可以少用甚至不用化学药剂,有利于绿色有机作物产品打造,推动农业产业的健康发展及生态环境保护,因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中阿氏芽孢杆菌D1平板和镜检图。
图2为本发明实施例中阿氏芽孢杆菌D1对禾谷镰刀菌的拮抗活性图。
图3为本发明实施例中阿氏芽孢杆菌D1对产黑色素短梗霉的拮抗活性图。
图4为本发明实施例中阿氏芽孢杆菌D1对尖孢镰刀菌的拮抗活性图。
图5为本发明实施例中阿氏芽孢杆菌D1对立枯丝核菌的拮抗活性图。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一个具体实施方式中,提供一株阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)D1,该菌株已于2020年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号),其生物保藏号为CGMCC No.20006。
本发明的又一具体实施方式中,所述阿氏芽孢杆菌D1的代谢物也属于本发明的保护范围。
本发明的又一具体实施方式中,所述阿氏芽孢杆菌D1的代谢物可以从阿氏芽孢杆菌D1的发酵液中获得。具体的,阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)D1的代谢产物具体可按照如下方法制备:将所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)D1接种于液体发酵培养基中进行发酵培养,除去液体培养物(发酵液)中的阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)D1即得到库德里阿兹威毕赤酵母F的代谢物。
其中,所述液体发酵培养基优选为LB培养基;
所述LB培养基(g/L):蛋白胨10,酵母提取物5,氯化钠10;121℃灭菌20min。
发酵培养条件具体为:在33~37℃(优选为35℃)培养20~30h(优选为24h),转速:150-190rpm(优选为170rpm)。
本发明的又一具体实施方式中,提供一种微生物菌剂,其含有所述阿氏芽孢杆菌D1和/或含阿氏芽孢杆菌D1的代谢物。
本发明的又一具体实施方式中,所述上述微生物菌剂具体可以是病原菌抑制剂或病害抑制剂。
上述病原菌抑制剂的活性成分可以是阿氏芽孢杆菌D1和/或阿氏芽孢杆菌D1的代谢物,上述病原菌抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分,上述病原菌抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病原菌的抑制效果确定。
上述病害抑制剂的活性成分可以是阿氏芽孢杆菌D1和/或阿氏芽孢杆菌D1的代谢物,上述病害抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分,上述病害抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病害的抑制效果确定。
本发明的又一具体实施方式中,上述阿氏芽孢杆菌D1和/或阿氏芽孢杆菌D1的代谢物在如下1)-4)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围:
1)在抑制病原菌中的应用;
2)在制备病原菌抑制剂中的应用;
3)在制备病害抑制剂中的应用;
4)在抑制病害中的应用。
上文中,所述病原菌可以为下述全部或部分病原菌:禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、产黑色素短梗霉(Aureobasidium pullulans)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。
上文中,所述病害可以为下述全部或部分病害:禾谷镰刀菌引起的病害,如禾谷镰刀菌病;产黑色素短梗霉引起的病害,如煤污病;尖刀镰孢菌引起的病害,如枯萎病;立枯丝核菌引起的病害,如立枯病。
所述病害可以是植物病害,所述植物具体可以是粮食、水果或蔬菜,例如小麦、大麦、玉米、花生、棉花、大豆、苹果、香蕉、葡萄、柑橘、草莓、西瓜、西红柿、油菜、茄子、萝卜、豇豆、白菜等。
本发明的又一具体实施方式中,提供一种微生物菌肥,所述微生物菌肥其活性成分包括上述阿氏芽孢杆菌D1、上述阿氏芽孢杆菌D1的代谢物和/或上述微生物菌剂。
本发明的又一具体实施方式中,所述微生物菌肥还含有有机质、全钾、全氮,用于提供养分。
本发明的又一具体实施方式中,提供一种防治植物病害的方法,所述方法包括向植物植株表面和/或周围土壤中施加上述阿氏芽孢杆菌D1、上述阿氏芽孢杆菌D1的代谢物、上述微生物菌剂和/或上述微生物菌肥。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明,但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中,LB培养基(g/L):蛋白胨10,酵母提取物5,氯化钠10,pH7.2;121℃灭菌20min;PDA培养基(g/L):马铃薯200,葡萄糖20,琼脂15~20,121℃灭菌20min。实施例中供试病原菌均由山东省食品发酵工业研究设计院分离保存所有。
实施例1阿氏芽孢杆菌的分离、鉴定
以尖孢镰刀菌作为指示菌,采用平板对峙法,在培养皿中心位置点接尖孢镰刀菌,在距离中心约2.5cm处接种待筛菌株,置于28℃恒温培养箱中培养,实时观察抑菌圈的有无和大小,最终从曲块中筛选出一株具有强拮抗效应的菌株,命名为菌株D1。经检测,其为革兰氏阳性菌,菌体短杆状,较粗,单个排列,不运动;在平板上,其菌落呈2-3mm,浅黄色,形状规则,边缘整齐,轻微无凸起,不透明,没有褶皱(见图1)。对菌株D1的16S rDNA序列进行测序,结合菌体形态特征和16S rDNA序列等,菌株D1鉴定为阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)。
菌株D1 16S rDNA序列:
TGCAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGAGCTAGCC(SEQ ID No.1)
生物保藏说明如下:
菌株D1,分类命名:阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai),于2020年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,生物保藏号为CGMCC No.20006。
实施例2阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)D1酶活测定
将上述阿氏芽孢杆菌D1使用LB培养基的摇瓶在35℃,170rpm的摇床中培养48h,测定发酵液中不同酶组分酶活,检测结果见下表1。
表1阿氏芽孢杆菌D1各酶活组分活性比较
Figure BDA0002633988270000091
Figure BDA0002633988270000101
由上表可知,所述阿氏芽孢杆菌D1具有产中性蛋白酶、β-淀粉酶、普鲁兰酶、纤维素酶和植酸酶等多种酶活性,从而有利于拓展其应用。
实施例3阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)D1抑菌能力测定
D1菌株采用对峙培养法测定其对烟草赤星病的抑菌活性,用灭菌打孔器打取已活化好的病原菌菌饼,先将病原菌菌饼接在新鲜的PDA平板中央,再将拮抗菌阿氏芽孢杆菌D1点接至菌饼旁,以仅接菌饼的平板为对照。放入28℃恒温培养箱倒置培养。3d后,测量处理和对照的菌落直径,并计算抑菌率。结果显示菌株D1对禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、产黑色素短梗霉(Aureobasidium pullulans)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)均具有非常显著的拮抗作用,结果见图2-5和表2。
表2阿氏芽孢杆菌D1对病原菌的抑菌效果
名称 抑菌圈直径(mm)
禾谷镰刀菌 25.12±2.10
产黑色素短梗霉 22.47±1.78
尖孢镰刀菌 23.56±2.42
立枯丝核菌 28.75±2.81
最后应该说明的是,以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述,但并非对本发明保护范围的限制,所属领域技术人员应该明白,在本发明的技术方案的基础上,本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省食品发酵工业研究设计院 齐鲁工业大学
<120> 一株阿氏芽孢杆菌及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1417
<212> DNA
<213> 阿氏芽孢杆菌D1 16S rDNA
<400> 1
tgcagtcgag cgaactgatt agaagcttgc ttctatgacg ttagcggcgg acgggtgagt 60
aacacgtggg caacctgcct gtaagactgg gataacttcg ggaaaccgaa gctaataccg 120
gataggatct tctccttcat gggagatgat tgaaagatgg tttcggctat cacttacaga 180
tgggcccgcg gtgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggca acgatgcata 240
gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300
aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 360
tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga agaacaagta cgagagtaac 420
tgctcgtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg 540
tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg agggtcattg gaaactgggg 600
aacttgagtg cagaagagaa aagcggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcggcttt ttggtctgta actgacgctg aggcgcgaaa 720
gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780
agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840
gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900
catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960
ctctagagat agagcgttcc ccttcggggg acagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt 1020
cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt 1080
tgccagcatt tagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140
gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggatgg 1200
tacaaagggc tgcaagaccg cgaggtcaag ccaatcccat aaaaccattc tcagttcgga 1260
ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1320
cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa 1380
cacccgaagt cggtggagta accgtaagga gctagcc 1417

Claims (13)

1.阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)D1,该菌株已于2020年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其生物保藏号为CGMCC No.20006。
2.含有权利要求1所述阿氏芽孢杆菌D1的微生物菌剂。
3.病原菌抑制剂,其特征在于:所述病原菌抑制剂含有权利要求1所述阿氏芽孢杆菌D1。
4.根据权利要求3所述的病原菌抑制剂,其特征在于:所述病原菌抑制剂对下述全部或部分病原菌具有抑制作用:禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、产黑色素短梗霉(Aureobasidium pullulans)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。
5.病害抑制剂,其特征在于:所述病害抑制剂含有权利要求1所述阿氏芽孢杆菌D1。
6.根据权利要求5所述的病害抑制剂,其特征在于:所述病害为下述全部或部分病害:禾谷镰刀菌引起的病害、产黑色素短梗霉引起的病害、尖刀镰孢菌引起的病害和立枯丝核菌引起的病害。
7.根据权利要求6所述的病害抑制剂,其特征在于:所述病害为下述全部或部分病害:禾谷镰刀菌病、煤污病、枯萎病和立枯病。
8.权利要求1所述阿氏芽孢杆菌D1的下述任一种应用:
1) 权利要求1所述阿氏芽孢杆菌D1在抑制病原菌中的应用;
2) 权利要求1所述阿氏芽孢杆菌D1在制备病原菌抑制剂中的应用;
3) 权利要求1所述阿氏芽孢杆菌D1在制备病害抑制剂中的应用;
4) 权利要求1所述阿氏芽孢杆菌D1在抑制病害中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于:所述病原菌为下述全部或部分病原菌:禾谷镰刀菌、产黑色素短梗霉、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌;
所述病害为下述全部或部分病害:禾谷镰刀菌引起的病害、产黑色素短梗霉引起的病害、尖刀镰孢菌引起的病害和立枯丝核菌引起的病害病;
所述病害是植物病害,所述植物为小麦、大麦、玉米、花生、棉花、大豆、苹果、香蕉、葡萄、柑橘、草莓、西瓜、西红柿、油菜、茄子、萝卜、豇豆和白菜。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述病害为下述全部或部分病害:禾谷镰刀菌病、煤污病、枯萎病和立枯病。
11.一种微生物菌肥,其特征在于,所述微生物菌肥其活性成分包括权利要求1所述阿氏芽孢杆菌D1和/或权利要求2所述微生物菌剂。
12.如权利要求11所述的微生物菌肥,其特征在于,所述微生物菌肥还含有有机质、全钾和全氮。
13.一种防治植物病害的方法,所述方法包括向植物植株表面和/或周围土壤中施加权利要求1所述阿氏芽孢杆菌D1、权利要求2所述微生物菌剂和/或权利要求11或12所述微生物菌肥。
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