CN110066659B

CN110066659B - 阿氏芽孢杆菌在制备酸性土壤改良剂中的应用

Info

Publication number: CN110066659B
Application number: CN201910375594.7A
Authority: CN
Inventors: 吴鹏宇; 陈振民; 艾洪超; 任浩然; 汪兆璞; 龚泽奇; 王巧梅; 梁运祥
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2039-05-07
Also published as: CN110066659A

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及阿氏芽孢杆菌在制备酸性土壤改良剂中的应用。本发明利用的细菌为阿氏芽孢杆菌（Bacillus asahii），保藏编号为CCTCC AB 207736。该菌株对有机难溶性磷源的溶解效果达到20%以上，该菌株对镰刀菌属的病原菌抑制效果较好，抑菌率高达80%以上，对香蕉枯萎病和马铃薯疮痂病的病原菌的抑制率也能达到60%以上，对灰葡萄孢菌和漆斑菌的抑制率能达到60%左右。该菌株对酸性土壤改良作用明显，处理前后土壤pH值从4.8回升到6.0左右。阿氏芽孢杆菌在生物防治、提高土壤肥效、环境生物修复等方面具有显著的优势，具有潜在应用价值。

Description

阿氏芽孢杆菌在制备酸性土壤改良剂中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及阿氏芽孢杆菌在制备酸性土壤改良剂中的应用。

背景技术

据研究报告显示，由于我国的化学肥料使用量的增长，对化学肥料的依赖性日益增强，造成了有机肥使用不足,土壤养分比例失调；土地板结，土壤质量下降；河流和地下水污染等一系列问题。而微生物肥料具有肥效高、本身无毒、不污染环境且成本低、可节约能源等特点，是化学肥料的最有效的替代品。合理开发和利用微生物肥料，是我国农业持续发展的重要途径。过去30年，我国农药产量和种类不断增多，确实提高了作物的产量，但是其带来的问题也是愈发突出。农药过量使用所产生的环境污染问题及病虫害的抗药性问题、农药残留带来的粮食安全问题等等亟待我们解决。此时微生物农药则是应运而生，因其具备绿色防控的优点，具备环境友好型、促进和谐生态、保障食品安全等突出特点而备受关注。

在微生物肥料和微生物农药开发中，由于无芽胞菌肥在生产中不耐受高温和干燥，制成的产品大多都不耐储存，所以选择抗逆性强和能长久储存的芽胞杆菌属是未来菌肥发展的一个重点方向。并且相对于细菌的营养体，芽胞具有更强的耐受性，所以其产品在生产加工、保藏运输、应用范围等方面更具优势，在开发微生物农药中的菌种选择上也更偏向于芽胞杆菌。由此在微生物农药和肥料研究中，抗逆性强和能长久储存的芽胞杆菌一直是被关注的重点。例如苏云金芽胞杆菌可制成杀虫剂，巨大芽胞杆菌可制备解磷菌肥。但研究核心仍然是对性能优异的菌种的筛选。

阿氏芽胞杆菌(Bacillus asahii)作为芽胞杆菌的新成员之一，主要分布在土壤和植物体内，在湖水和海水中也有发现，因其独特的功能特性而引起了研究者广泛的关注。

阿氏芽胞杆菌最早是在土壤中发现的，Isao Yumoto等作为首批发现阿氏芽胞杆菌的研究者，他们对阿氏芽胞杆菌做了详细的形态观察和生理生化分析。Zhan-Bin Sun等从健康的黄瓜叶子中分离并筛选出一株阿氏芽胞杆菌(Bacillus asahii)，此株植物内生菌在后续的抑菌活性研究中，对黄瓜霜霉病表现出较强的防治效果。Youzhi Feng等从施过有机肥的碱性土壤中分离出一种阿氏芽胞杆(Bacillus asahii)，并且发现在土壤中持续施加有机肥达10年的过程中此菌在整个土壤微生物菌群中逐渐成为优势菌种。这种耐碱性菌株对贫瘠的砂质土壤有较好的提高肥效的作用，从而提高作物的产量；最主要的他能长期保持土壤的肥力，具有可持续性。

与此同时，林先贵等对从施有机肥的田间获得的阿氏芽胞杆(Bacillus asahii)进行一系列的探究,发现此菌株的代谢活力较强，具有明显的降解脂类和溶磷的特性。并且该菌株不同于其他种类的芽胞杆菌利用糖可以产酸，它对大多数糖类的代谢是不产酸的。后续研究发现，此菌在土壤中可以显著提高多酚氧化酶和脂肪酶的活性，这两个酶可以加快有机肥中有机质的分解，从而明显提升土壤的肥力。这些独特的性质可能使它在高有机质输入的碱性土壤中成为优势微生物。

针对采矿工业尾矿的污染问题，潘响亮等发明了利用阿氏芽胞杆菌(Bacillusasahii)来治理此类污染的方法，主要是通过阿氏芽胞杆菌分解尿素产生的CO₂在碱性条件下生成CaCO₃晶格将尾矿中的重金属进行固定，从而达到控制重金属淋溶的效果，于是大大降低了采矿区的重金属对周边环境的污染。在日本，家畜和家禽产生的粪便所散发的恶臭逐渐成为一个很严重的环境问题，为了解决这一难题，研究者们从微生物入手试图找到解决办法。随后Isao Yumoto等从土壤中分离出一株阿氏芽胞杆菌(Bacillus asahii)很有效地解决了这一环境问题。科威特大学的Dhia Al-Bader等在烃类化合物的生物降解领域做出了许多研究，他们发现阿氏芽胞杆菌(Bacillus asahii)对菲类化合物和原油的降解效果比较明显。

发明内容

本发明的目的在于提供了阿氏芽孢杆菌在制备酸性土壤改良剂中的应用，所述的阿氏芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC AB 207736。

本发明的另一个目的在于提供了阿氏芽孢杆菌在制备同时具有生物防治和改良酸性土壤的功能的制剂中的应用。

本发明还有一个目的在于提供了阿氏芽孢杆菌在制备同时具有生物防治、改良酸性土壤和促进植物生长的功能的制剂中的应用

本发明的最后一个目的在于提供了一种适用于上述应用的阿氏芽孢杆菌的发酵方法，将该菌株与凝结芽孢杆菌混合培养，在一定的培养条件下能达到较为理想的生物量。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

阿氏芽孢杆菌在制备酸性土壤改良剂中的应用，所述的阿氏芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC AB 207736，包括以该芽孢杆菌为唯一有效成分或有效成分之一制备成酸性土壤改良剂。

以上所述的应用中，所述的改良剂还具备有抑菌、或促进植物生长的功能。

以上所述的应用中，所述的阿氏芽孢杆菌的可使用的发酵方法为：将该菌株与凝结芽孢杆菌混合培养。

以上所述的应用中，优选的，所述的凝结芽孢杆菌为凝结芽胞杆菌(Bacilluscoagulans)LA204。

以上所述的应用中，抑菌功能指得是具备抑制香蕉枯萎病病原菌、马铃薯疮痂病病原菌、轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、茄病镰刀菌(Fusariumsolani)、镰刀菌属菌(Fusarium)、枝孢菌属菌(Cladosporium)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)或漆斑菌属菌(Myrothecium)。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

本发明中的阿氏芽孢杆菌不仅耐碱特性和溶磷特性，还发现其具备耐酸性，还发现其具有改良酸性土壤的作用。

本发明中的阿氏芽孢杆菌对其他多种植物病原菌均有抑菌效果。

现有技术中报道阿氏芽孢杆菌有提高土壤肥效，改良碱性土壤的作用，但本发明还发现其具有改良酸性土壤的作用。

本发明提出了一种新的阿氏芽孢杆菌培养方案，克服了使得阿氏芽孢杆菌菌数达到一定的水平，使其更具有制备成菌剂的价值。

附图说明

图1为阿氏芽孢杆菌耐碱特性检测中发酵液pH的变化示意图。

图2为不同pH值对阿氏芽孢杆菌生长的影响示意图。

图3为阿氏芽孢杆菌对不同植物病原菌的抑制率示意图；

其中：1、香蕉枯萎病病原菌，2、马铃薯疮痂病病原菌，3、轮枝镰刀菌，4、尖孢镰刀菌(FS-151)，5、尖孢镰刀菌(FS-412)，6、茄病镰刀菌(FS-413)，7、茄病镰刀菌(FS-263)，8、镰刀菌属菌，9、枝孢菌属菌，10、灰葡萄孢菌，11、漆斑菌属菌。

图4为阿氏芽孢杆菌对不同镰刀菌的抑制效果示意图；

其中：a尖孢镰刀菌对照组，b尖孢镰刀菌实验组，c轮枝镰刀菌对照组，d轮枝镰刀菌实验组，e茄病镰刀菌对照组，f茄病镰刀菌实验组。

图5为混菌比例对阿氏芽孢杆菌生长的影响示意图；

其中：Ba、阿氏芽孢杆菌，Bc凝结芽孢杆菌。

图6为混菌比例对阿氏芽孢杆菌菌数的影响；

其中：Ba、阿氏芽孢杆菌，Bc凝结芽孢杆菌，纵轴指得是阿氏芽孢杆菌的菌数。

图7为不同温度对阿氏芽孢杆菌菌数的影响示意图。

图8为不同转速对阿氏芽孢杆菌菌数的影响示意图。

图9为不同培养基体积对阿氏芽孢杆菌菌数的影响示意图。

图10为不同接种量对阿氏芽孢杆菌菌数的影响示意图。

图11为阿氏芽孢杆菌改良酸性土壤栽培的结果示意图。

图12为为阿氏芽孢杆菌耐酸特性检测中发酵液pH的变化示意图。

图13为不同酸性pH对阿氏芽胞杆菌生长的影响示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明涉及到的阿氏芽孢杆菌购自中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为CCTCC AB 207736。

实施例1：

保藏编号为CCTCC AB 207736的阿氏芽孢杆菌的酸碱耐受：

耐碱性实验：

将阿氏芽孢杆菌种子液按照5％的接种量分别接种于初始pH不同的LB培养基中，在30℃、200r/min条件下培养，每隔一定时间取样测OD₆₀₀，直到稳定后期才结束测定。培养基的初始pH梯度设置为7、8、9、10。

LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

检测结果如图1和图2，pH9和pH10两组中的pH从开始到23h一直是下降的趋势，可能是阿氏芽孢杆菌产生某种酸性物质中和培养基中的碱以便使环境能达到适宜自生生长的情况。

在pH7和pH8两组中pH均是一直上升，说明这两组中菌体可正常生长。pH7和pH8的生长曲线差别并不大；pH9中迟缓期增长，达到稳定期的时间点也是有所推后，但是最后在稳定期的生物量与pH7和pH8两组之间的差别并不大，可以看出菌体对pH9的碱性环境具备一定的耐受能力；pH10则是将菌体的生长完全抑制。综合图10、图11可知，阿氏芽孢杆菌对碱的耐受上限为pH 10。

耐酸性试验：

将阿氏芽孢杆菌种子液按照5％的量分别接种于初始pH不同的LB培养基中，在30℃、200r/min条件下培养，每隔一定时间取样测OD₆₀₀，直到稳定后期才结束测定。培养基的初始pH梯度设置为3、4、5、6、7。

由图12可知，阿氏芽胞杆菌在初始pH为5、6、7的培养基中生长时，发酵液的pH是不断上升的，可能是随着菌体生长，菌数增多，从而对培养基的pH有所调节。在初始pH为3和4的培养基中，随着时间的延长，发酵液pH基本不变，说明菌体没有生长。

由图13可知：在液体培养基中阿氏芽胞杆菌对酸性环境有一定的耐受能力，菌体在pH6中生长比pH5中更好，但是菌体对pH3和pH4则表现出不耐受，在其环境中无法生长。综合图8、图9可知，阿氏芽胞杆菌对酸的耐受下限为pH 4。

实施例2：

保藏编号为CCTCC AB 207736的阿氏芽孢杆菌溶磷能力：

将种子液按照5％的接种量接种于液体解磷培养基中,30℃、200r/min培养，随后利用钼蓝比色法测定培养液中的有效磷(可溶磷)含量，从而判断溶磷能力的强弱。

解磷培养基(PKO培养基)：葡萄糖10.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·7H₂O 0.3g，难溶性磷源，水1000mL，pH 7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min；难溶性磷源及添加量：磷酸三钙0.5％，磷矿粉0.5％，蛋黄卵磷脂0.2％(磷酸三钙0.5％表明100mL的培养基中加入0.5g的磷酸三钙，其余同)。

结果如表1所示。

表1

由表1可知：阿氏芽孢杆菌对磷酸三钙、磷矿粉的作用效果仍然处于较低水平，但是对磷矿粉的溶解效果比磷酸三钙的更好，可达到5.5％，菌体对蛋黄卵磷脂的作用还比较明显，溶解率可以达到21.4％。

实施例3：

保藏编号为CCTCC AB 207736的阿氏芽孢杆菌对植物病原菌的抑制作用：

采用抑菌圈法测定阿氏芽孢杆菌对病原菌的抑制能力。将活化好的阿氏芽孢杆菌种子液适当稀释后涂布到PDA平板上，以涂布无菌水作为对照试验组。在长满病原真菌的PDA平板上进行打孔，挑取菌块倒置接种在凃有阿氏芽孢杆菌的PDA平板上，使长有真菌的一侧接触平板，将平板置于30℃培养7d。随后测量真菌菌落直径，计算抑菌率，从而分析抑菌的效果。

本实验选取的植物病原菌有香蕉枯萎病病原菌、马铃薯疮痂病病原菌、轮枝镰刀菌、尖孢镰刀菌(2株)、茄病镰刀菌(2株)、镰刀菌属、枝孢菌属、灰葡萄孢菌、漆斑菌属。

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1 000mL，pH为自然pH，115℃高压蒸汽灭菌30min。

注：D，对照平板菌落直径；d，实验平板菌落直径。

结果如图3，阿氏芽孢杆菌对常见的香蕉枯萎病和马铃薯疮痂病有一定的防治效果，对引起这两种植物病害的致病菌的抑制率均能达到60％以上；对灰葡萄孢菌和漆斑菌的抑制率也能达到60％左右，但是对枝孢菌的抑制作用不强；菌株对引起作物腐根病的镰刀菌也表现出较好的抑制效果，抑菌率均达到80％以上；特别是对轮枝镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄饼镰刀菌的抑制效果更是达到90％以上，对各菌的抑菌率如下表所示。

序号	病原菌	抑菌率(％)
			1	香蕉枯萎病病原菌	66.58
2	马铃薯疮痂病病原菌	67.84
			3	轮枝镰刀菌	91.32
4	尖孢镰刀菌(FS-151)	79.94
			5	尖孢镰刀菌(FS-412)	91.43
6	茄病镰刀菌(FS-413)	92.28
			7	茄病镰刀菌(FS-263)	95.11
8	镰刀菌属	89.83
			9	枝孢菌属	11.10
10	灰葡萄孢菌	64.08
			11	漆斑菌	64.81

图4结果显示，尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌、茄病镰刀菌在凃有阿氏芽孢杆菌的平板上均无法正常的生长，但是这三种菌在没有涂布阿氏芽孢杆菌的对照平板上长势良好。实验组中尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌、茄病镰刀菌的直径明显小于对照组，可见阿氏芽孢杆菌对这三种镰刀菌的抑制效果比较明显。

实施例4：

保藏编号为CCTCC AB 207736的阿氏芽孢杆菌与凝结芽胞杆菌(Bacilluscoagulans)LA204的混合培养：

将活化完成的阿氏芽孢杆菌与凝结芽胞杆菌按照不同的体积比例接种到50mlYPD培养基中，两种菌混合后，以只接种2.5ml的阿氏芽孢杆菌作为对照组，在200r/min，30℃条件下培养，48h发酵结束后测定菌液的pH，生物量及阿氏芽孢杆菌的菌数。

接种的阿氏芽孢杆菌的有效菌浓度为7×10⁷cfu/mL，凝结芽胞杆菌(Bacilluscoagulans)LA204的有效菌浓度为2×10⁸cfu/mL，以下实施例同。

Ba-阿氏芽孢杆菌，Bc-凝结芽孢杆菌

YPD培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，蒸馏水1000mL，pH7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。

结果如图5和图6，接入凝结芽胞杆菌后发酵液的pH有所下降，生物量也是有所上升；特别是混菌比例为2:1时，OD₆₀₀值最高，pH值最低。混菌体积比例为2:1、4:1、6:1、8:1三组的菌数均比CK组有所提高，说明凝结芽胞杆菌的加入对阿氏芽孢杆菌的生长有一定的促进作用，特别是在接菌比例为2:1时的效果最好，可使菌数达到4.06×10⁸cfu/mL，此时的pH也是最低为7.48。

实施例5：

不同培养条件对阿氏芽孢杆菌生长的影响：

a、温度的影响：转速180r/min、培养基(YPD培养基，以下同)体积30mL、接种量5％，发酵过程中的培养条件对菌体的生物量的影响比较大，合适的温度能使菌体代谢处于良好的状态，由此将培养过程中的温度进行优化，实验结果如图7。

如图7所示：温度的升高能促进菌数的上升，在37℃时菌数最高，可达1.34×108cfu/mL。但是过高的温度在加快菌体的代谢的同时也会导致菌体过早的衰亡，不利于芽胞的形成。

b、转速的影响：温度37℃、培养基体30mL、接种量5％，发酵过程中的培养条件对菌体的生物量的影响比较大，适宜的转速有利于使溶氧达到比较好的水平，由此将培养过程中的转速进行优化，实验结果如图8。

由图8可知：因为此菌为好氧菌，转速越大，培养基中溶氧越好，菌体代谢越活跃，生长速度也就越快，在180r/min时，菌数达到相对较高水平。

c、培养基体积的影响：转速180r/min、温度37℃、接种量5％，发酵过程中的培养条件对菌体的生物量的影响比较大，适合的培养基体积可以在不影响溶氧的情况下给菌体提供足够的营养物质，由此将培养过程中的培养基体积进行优化，实验结果如图9。

如图9所示：随着培养基体积的增大，菌数呈现下降的趋势，在10mL和40mL时，菌数处于性对较高的水平，但考虑到营养物质的提供量，40mL的培养基体积对菌体生长比较适宜。

d、接种量的影响：转速180r/min、温度37℃、培养基体积40mL，发酵过程中的培养条件对菌体的生物量的影响比较大，合适的接种量能够最大限度的利用发酵培养基中的营养物质，由此将培养过程中的接种量进行优化，实验结果如图10。

由图10可知：随着接种量的加大，菌数有所上升，可见扩大接种量可以促进菌体的生长，并且在7％时菌数最高为1.48×10⁸cfu/mL。但是接种量过大容易导致种子液中的代谢产物对培养基的性质产生，影响所以7％的接种量比较适合菌体的生长。

e、在37℃、180r/min、40mL的培养基体积、7％接种量的最佳条件下进行发酵培养，到达发酵终点时的菌数能达到1.1×10⁹cfu/mL。

实施例6：

最佳培养条件下阿氏芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌混合发酵培养：

(1)发酵条件为37℃、180r/min、40mL的培养基(YPD培养基)装液体积。

(2)阿氏芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌的接种量分别为7％和3.5％。

(3)以此发酵条件和接种比例，发酵48h后，菌数能达到1.5×10⁹cfu/mL。

实施例7：

阿氏芽孢杆菌对酸性土壤的改良作用：

a、将取自湖北通城地区的酸性土壤(pH4.8左右)捣碎至合适大小，装盆。

b、将娃娃快菜种子浸泡2h，撒入基质中，待其发芽后移栽入装有酸性土壤的盆中，一周后取样测定土壤初始pH值。

c、取培养至对数末期的阿氏芽孢杆菌100mL离心取菌体，用无菌水洗涤3遍后无菌水重悬，将菌悬液浇灌至栽培好娃娃快菜的盆内。每周浇灌菌液一次，一共浇灌4次，对照组浇灌无菌水。每次浇灌前取样测定土壤pH值。

e、土壤pH的测定按照中华人民共和国农业行业标准NY/T 1377-2007中土壤pH的测定的方法进行测定。

由图11可知：不浇灌阿氏芽孢杆菌菌液的盆栽实验中，一个月后土壤pH值基本维持不变。在浇灌阿氏芽孢杆菌菌液的盆栽实验中，一个月后土壤pH值出现明显上升，实验结束时pH值从4.8左右的酸性回升到6.0左右，基本回升到适宜作为生长的土壤环境，改良作用明显，同时娃娃菜加菌组的长势要好于对照组。

Claims

1.阿氏芽孢杆菌(Bacillus asahii)在制备同时具备有抑菌和酸性土壤改良的制剂中的应用；所述的抑菌指的是抑制香蕉枯萎病病原菌、马铃薯疮痂病病原菌、镰刀菌属菌(Fusarium)、枝孢菌属菌(Cladosporium)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)或漆斑菌属菌(Myrothecium)，所述的阿氏芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC AB 207736。

2.根据权利要求1所述的应用，所述的阿氏芽孢杆菌的发酵方法包括：将该菌株与凝结芽孢杆菌混合培养；所述的阿氏芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC AB 207736，所述的凝结芽孢杆菌为凝结芽胞杆菌(Bacillus coagulans)LA204。