CN113293112B

CN113293112B - 复合微生物土壤修复剂及其制备方法

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Publication number: CN113293112B
Application number: CN202110684532.1A
Authority: CN
Inventors: 陈捷; 刘鹏; 郝大志
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-06-21
Filing date: 2021-06-21
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2041-06-21
Also published as: CN113293112A

Abstract

本发明技术方案公开了一种复合微生物土壤修复剂及其制备方法，复合微生物土壤修复剂，包括棘孢木霉、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌，其中所述棘孢木霉、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数之比为(0.7～1.5):(4～6):(9～11)。本发明技术方案的复合微生物土壤修复剂能够兼顾土壤修复、促进作物生长、提高抗逆性的需求。

Description

复合微生物土壤修复剂及其制备方法

技术领域

本发明属于土壤修复技术领域，具体涉及一种复合微生物土壤修复剂及其制备方法。

背景技术

随着工农业生产的发展，农业污染特别是土壤环境污染问题已越来越突出。一些以化学农药和化学肥料为主的化学品大量地在土壤中使用，有可能导致土壤中产生不平衡的微生物体系，使土壤变得脆弱，或者土壤中的微生物被杀灭，使得土壤中有机物的分解被中断，导致很多土壤的地力严重下降，威胁到农产品的安全。

为了尽可能的降低土壤修复剂的使用对土壤造成污染，微生物修复剂被提出。相比化学土壤修复剂，微生物土壤修复剂在生态保护、提高作物产量和提高土壤修复剂利用率方面具有明显优势。但是，目前的微生物修复剂的功能较为单一，无法同时实现土壤修复、促进作物生长及提高抗逆性的目标。

发明内容

本发明技术方案要解决的技术问题提供一种复合微生物土壤修复剂，能够兼顾土壤修复、促进作物生长、提高抗逆性的需求。

为解决上述技术问题，本发明技术方案提供一种复合微生物土壤修复剂，包括棘孢木霉、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌，其中所述棘孢木霉、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数之比为(0.7～1.5):(4～6):(9～11)。

可选的，所述棘孢木霉为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)CTCCSJ-W-SBW10264保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCNo.22404；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)22，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18677；所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ACCC15006，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22176。

可选的，所述的复合微生物土壤修复剂还包括助剂和硅藻土，其中所述棘孢木霉、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的混合菌液、助剂及硅藻土的体积百分比分别为31％～33％，7％～9％及55％～65％。

可选的，所述助剂包括糊精和淀粉，其中所述糊精的体积占修复剂总体积的4％～6％，所述淀粉的体积占修复剂总体积的2％～4％。

本发明还提供一种复合微生物土壤修复剂的制备方法，包括：混合棘孢木霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液及贝莱斯芽孢杆菌发酵液，获得混合菌液，其中所述棘孢木霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液及贝莱斯芽孢杆菌发酵液中活孢子数之比为(0.7～1.5):(4～6):(9～11)；将所述混合菌液与助剂、硅藻土混合均匀。

可选的，所述混合菌液、助剂及硅藻土的体积百分比分别为31％～33％，7％～9％及55％～65％。

可选的，所述棘孢木霉发酵液的制备方法包括：进行棘孢木霉的活化与扩繁，获得棘孢木霉菌落；处理所述棘孢木霉菌落，得到棘孢木霉种子菌液；将所述棘孢木霉种子菌液置于棘孢木霉发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；对所述发酵液进行离心，得到棘孢木霉发酵液。

可选的，所述枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法包括：对芽孢杆菌进行活化，得到活化的芽孢杆菌活化菌种；处理所述活化的芽孢杆菌活化菌种，得到芽孢杆菌种子液；将所述芽孢杆菌种子液置于枯草芽孢杆菌发酵培养基中进行发酵，得到枯草芽孢杆菌发酵液。

可选的，所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法包括：对芽孢杆菌进行活化，得到活化的芽孢杆菌活化菌种；处理所述活化的芽孢杆菌活化菌种，得到芽孢杆菌种子液；将所述芽孢杆菌种子液置于贝莱斯芽孢杆菌发酵培养基中进行发酵，得到贝莱斯芽孢杆菌发酵液。

与现有技术相比，本发明技术方案的复合微生物土壤修复剂具有如下有益效果：棘孢木霉、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌之间不仅功能互补，菌株间具有较好的兼容性和协同增效性，可一体化实现土壤修复、促进作物生长、提高抗逆性的三重目标。

附图说明

图1为本申请实施例的棘孢木霉、枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌的亲和性检测结果；

图2为本申请实施例的棘孢木霉吸附盐离子的胞外分泌物情况；

图3和图4为本申请实施例的复合微生物土壤修复剂进行土壤修复试验的结果；

图5为本申请实施例的复合微生物土壤修复剂对土壤脲酶的影响；

图6为本申请实施例的复合微生物土壤修复剂对土壤微生物区系的影响。

具体实施方式

为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。

本申请实施例提供一种复合微生物土壤修复剂，包括棘孢木霉、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌。其中所述棘孢木霉是土壤和根际生态系统中普遍存在有益真菌，棘孢木霉定殖植物根际后可以减少设施栽培土壤的连作障碍，如，减少盐渍化离子和病原菌的积累、降解多种农药残留、吸附重金属；防治作物土传病害、诱导作物对病虫害的抗性和对非生物胁迫的耐受能力；提高作物对化肥和土壤营养的利用效率、刺激作物生长，提高产量。

所述枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌可以产生大量促作物生长的植物激素和抑制原菌的脂肽类抗生物质，芽孢杆菌的芽孢结构使其在抗逆性方面明显优于木霉菌，可提高产品应用的稳定性。其中所述枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，是一种广泛分布于自然界中的革兰氏阳性菌，对环境无残留危害，毒性极低，具有较强应用潜力。所述枯草芽孢杆菌能通过分泌刺激性代谢物较好地促进植物生长，并可通过产生抗生性次生代谢物来抑制土壤中植物病原菌生长。所述贝莱斯芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，是一类可产芽孢的革兰氏阳性细菌，除具有与枯草芽孢杆菌类似的拮抗原菌、分泌促进作物生长植物激素、降解有毒物质等功能外，还具有生物固氮功能，这些优良的特性在环境保护、农业生产方面均具有较大应用潜力。

在单独使用所述棘孢木霉时，对修复盐渍化土壤、减少农化物质残留、固化重金属、防治土传真菌病害和诱导抗虫性等方面具有优势，但在促进作物生长、对病原菌的抗生作用、对细菌病害防治方面优势不突出，而本申请实施例的枯草芽孢杆菌恰好可弥补棘孢木霉的不足，在促进作物生长和防治土传细菌性病害方面较为突出。本申请实施例的贝莱斯芽孢杆菌则在促进作物生长和生物固氮功能方面明显优于枯草芽孢杆菌。在菌株抗逆性方面，棘孢木霉抗逆性较弱，而两种芽孢杆菌抗逆性较强。因此，本申请实施例的复合微生物土壤修复剂能够发挥三种微生物互补优势，可一体化实现土壤修复、促进作物生长、提高抗逆性的三重目标。

除了所述棘孢木霉、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的功能互补之外，还需要菌株间具有较好的兼容性和协同增效性，是本申请实施例的复合微生物土壤修复剂发挥优势的至关重要的一点。当所述棘孢木霉为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)CTCCSJ-W-SBW10264，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)22，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ACCC15006时，具有优异的减少土壤盐渍化、吸附盐离子、诱导抗病虫性、作进作物生长等多种作用，其中棘孢木霉CTCCSJ-W-SBW10264能与枯草芽孢杆菌22、贝莱斯芽孢杆菌ACCC15006亲和性互作，三者平板生长无明显抑菌圈。所述棘孢木霉为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)CTCCSJ-W-SBW10264，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMC No.22404；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)22，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18677；所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ACCC15006，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22176。图1为棘孢木霉CTCCSJ-W-SBW10264、枯草芽孢杆菌22、贝莱斯芽孢杆菌ACCC15006的亲和性检测结果，图2为棘孢木霉CTCCSJ-W-SBW10264吸附盐离子的胞外分泌物，所述棘孢木霉菌CTCCSJ-W-SBW10264具有与对盐胁迫敏感菌株不同胞外分泌物结构，而该菌株与枯草粉芽孢杆菌22、贝莱斯芽孢杆菌ACCC15006与棘孢木霉CTCCSJ-W-SBW10264在平板生长无明显抑菌圈，说明三者之间无抑制作用。

所述棘孢木霉、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数之比对三元复合菌剂的修复土壤增益性具有很大影响。在本申请实施例中，所述棘孢木霉、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数之比为(0.7～1.5):(4～6):(9～11)。在该比例范围内，对土壤盐渍化修复的效果和黄瓜幼苗生长的促作用最好。

除了包括三种微生物之外，本申请实施例的复合土壤修复剂还包括助剂及硅藻土，且所述棘孢木霉、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的混合菌液、助剂及硅藻土的体积百分比分别为31％～33％，7％～9％及55％～65％。所述助剂包括糊精和淀粉，其中所述糊精的体积占修复剂总体积的4％～6％，所述淀粉的体积占修复剂总体积的2％～4％。

本申请实施例还提供一种复合微生物土壤修复剂的制备方法，包括：混合棘孢木霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液及贝莱斯芽孢杆菌发酵液，获得混合菌液，其中所述棘孢木霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液及贝莱斯芽孢杆菌发酵液中孢子数之比为(0.7～1.5):(4～6):(9～11)；将所述混合菌液与助剂、硅藻土混合均匀。

所述混合菌液的制备方法可以包括：菌株初筛、复筛纯化后，分别保存于玻璃试管斜面与甘油中。在配方优化后的培养基中，三菌株分别进行种子液体培养与液体发酵罐发酵，得到棘孢木霉发酵液与两种芽孢杆菌发酵液，分别将棘孢木霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液及贝莱斯芽孢杆菌发酵液按活孢子数配比为(0.7～1.5):(4～6):(9～11)混合。

所述棘孢木霉发酵液的制备方法包括：进行棘孢木霉活化与扩繁，获得棘孢木霉菌落；处理所述棘孢木霉菌落，得到棘孢木霉种子菌液；将所述棘孢木霉种子菌液置于棘孢木霉发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；对所述发酵液进行离心，得到木霉菌发酵液。

在一些实施例中，制备所述棘孢木霉发酵液包括如下步骤：

(1)棘孢木霉平板活化与扩繁：将棘孢木霉接种于PDA培养皿中进行培养，获得木霉菌落。所述PDA培养基的制备方法是，通过将马铃薯蒸煮后过滤的上层汁液、葡萄糖、琼脂粉及纯净水定容至1L，并进行灭菌。

(2)棘孢木霉种子菌的制备：将马铃薯、葡萄糖、纯净水进行分装并灭菌。从棘孢木霉菌落用无菌水洗下分生孢子，调整至特定浓度，接入液体培养基中进行培养，得到棘孢木霉菌种子菌液。

(3)发酵液制备：

发酵培养基配方：玉米粉、磷酸二氢钾、硝酸钠、硫酸铵、氯化钠、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌，加入水的体积是发酵培养基总体积的80％-90％，棘孢木霉种子菌液的接入量为发酵培养基总体积的0.3％-1％。

在一些实施例中，发酵培养基的具体配方为：50～60g/L玉米粉、3～4g/L磷酸二氢钾、1.2～1.5/L硝酸钠、1.0～1.2g/L硫酸铵、0.8～1.2g/L氯化钠、0.4～0.6g/L七水硫酸镁、0.0065～0.008g/L七水硫酸亚铁、0.002～0.003g/L硫酸锰、0.0015～0.0025g/L硫酸锌，种子液接入量为发酵培养基总体积的0.3％-1％。

发酵工艺：发酵开始，将溶氧量调节为1.0vvm～1.5vvm，温度为27℃～29℃，自然pH(一般在5左右)，转速为160rpm-180rpm，将灭菌好的培养基接入种子液，木霉菌开始生长，此时pH值下降，菌丝变粗，木霉菌发酵24h-35h。发酵液的pH值下降到最低点，此时加入氨水以调节pH值为3.2-3.5，为后期厚垣孢子大量产生做铺垫。溶氧量随着pH值的下降而降低，pH值下降到最低点溶氧量降至最低点。pH值和溶氧量达到最低点，发酵持续进行，待35h-50h孢子逐渐形成，菌丝逐渐变细并逐渐减少，孢子逐渐成型，缓慢降低溶氧量，保持在40％-50％。50h-90h菌丝成断线状，并逐渐消失，孢子逐渐成熟，并在发酵液中散落。发酵90h～96h，菌丝全部消失，孢子成型。镜检，孢子量达到90％以上时，下罐。

发酵浓缩液制备：使用立式离心机对发酵液进行离心(800r/min～1000r/min)，离心得到木霉菌孢子和菌丝体沉淀分别保存于4℃～10℃冷库。

所述棘孢木霉发酵液中产孢子数达到(3.0～7.0)×10⁸CFU/mL，其中厚垣孢子数约占总孢子数的30％～40％。

所述枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法包括：对芽孢杆菌进行活化，得到活化的芽孢杆菌活化菌种；处理所述活化的芽孢杆菌活化菌种，得到芽孢杆菌种子液；将所述芽孢杆菌种子液置于枯草芽孢杆菌发酵培养基中进行发酵，得到枯草芽孢杆菌发酵液。

所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法包括：对芽孢杆菌进行活化，得到活化的芽孢杆菌活化菌种；处理所述活化的芽孢杆菌活化菌种，得到芽孢杆菌种子液；将所述芽孢杆菌种子液置于贝莱斯芽孢杆菌发酵培养基中进行发酵，得到贝莱斯芽孢杆菌发酵液。

在一些实施例中，所述枯草芽孢杆菌发酵液及贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法包括：

(1)芽孢杆菌平板菌株的活化：

第一次活化：取体积百分数为20％或30％甘油冷冻管(-60℃保存)，常温解冻，划线接种于PDA平板。30℃静置培养48h，单个菌落直径约0.8cm-1.2cm。

第二次活化：挑取一次活化的单个菌落，划线接种于PDA平板，30℃静置培养约24h。

其中所述PDA培养基制备方法：190g～210g马铃薯蒸煮后过滤的上层汁液、19g～21g葡萄糖、19g～21g琼脂粉、纯净水定容至1L，120℃～121℃高压灭菌30min～40min。

(2)芽孢杆菌种子液的制备:

取第二次活化菌种接种于装有培养基液体中，在28℃～30℃，180rpm～200rpm的条件下，培养18h-19h。

(3)芽孢杆菌发酵培养基的制备：

枯草芽孢杆菌发酵培养基配方：酵母浸出粉、糖蜜、玉米蛋白粉、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、氯化钠、碳酸钙、消泡剂，芽孢杆菌种子液的接入量为发酵培养基总体积的0.3％-1％。

贝莱斯芽孢杆菌发酵培养基配方：酵母浸出粉、甘露醇、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钠、碳酸钙、消泡剂，种子液接入量为发酵培养基的0.3％-1％。

在一些实施例中，枯草芽孢杆菌发酵培养基的具体配方为：19g/L～20g/L酵母浸出粉、19g/L～20g/L糖蜜、9g/L～10g/L玉米蛋白粉、0.4g/L～0.5g/L磷酸二氢钾、0.4g/L～0.5g/L七水硫酸镁、0.25g/L～0.3g/L氯化钠、2.5g/L～3g/L碳酸钙、0.5g/L～0.6g/L消泡剂，种子液接入量为发酵培养基总体积的0.3-1％。

贝莱斯芽孢杆菌发酵培养基的具体配方为：1.8g/L～2g/L酵母浸出粉、9g/L～10g/L甘露醇、0.4g/L～0.5g/L磷酸氢二钾、0.35g/L～0.40/L七水硫酸镁、0.15g/L～0.16g/L氯化钠、0.9g/L～1g/L碳酸钙、0.5g/L～0.6g/L消泡剂，种子液接入量为发酵培养基总体积的0.3-1％。

(4)芽孢杆菌的发酵：

枯草芽孢杆菌的发酵工艺：灭菌前将pH调整为7.0±0.2，发酵补糖后使用氨水将pH值控制为7.0±0.2。发酵开始，将溶氧量调节为1vvm～1.5vvm，温度为28℃～30℃，调节pH在7.0±0.2左右，转速180rpm～200rpm，将灭菌好的培养基接入种子液，接种后设置溶氧为100％满点，使其自然下降，待溶氧反弹并达到80±10％(约发酵22h左右)，此时流加体积百分数为42％～45％的葡萄糖溶液，溶氧控制在30％～50％。芽孢开始生长，此时pH值下降，当发酵溶氧反弹至约80±10％(约22h)，以210g/h～220g/h流速流加体积百分数为42％～45％的葡萄糖溶液，总的补糖浓度约75g/L～80g/L。溶氧量随着pH值的下降而降低，pH值下降到最低点溶氧量降至最低点。pH值和溶氧量达到最低点，发酵持续进行，待35h-50h孢子逐渐形成，孢子逐渐成型，缓慢降低溶氧量，保持在40％-50％。72h左右镜检，孢子量达到90％以上时，发酵完成，下罐。

贝莱斯芽孢杆菌的发酵工艺：灭菌前将pH值调整为6.8±0.2。发酵开始，将溶氧量调节为0.8vvm～0.9vvm，温度为28℃～30℃，调节pH值在6.8±0.2左右，转速160rpm～170rpm，将灭菌好的培养基接入种子液，接种后设置溶氧为100％满点，使其自然发酵，溶氧控制在30％～50％。待芽孢开始生长时(36h)，以125g/h～130g/h流速流加体积百分数为28％～30％的葡萄糖溶液，此时pH值下降，当发酵溶氧反弹至约80±10％(约48h)，总的补糖浓度约50g/L。溶氧量随着pH值的下降而降低，pH值下降到最低点溶氧量降至最低点。pH值和溶氧量达到最低点，发酵持续进行，待45h-50h孢子逐渐形成，孢子逐渐成型，缓慢降低溶氧量，保持在40％-50％。72h左右镜检，孢子量达到90％以上时，发酵完成，下罐。

先将枯草芽孢杆菌发酵液和贝莱斯芽孢杆菌发酵液混合，再加入木霉菌发酵液，形成混合菌液。然后，在混合菌液中加入助剂、硅藻土，制备成复合微生物土壤修复剂。所述混合菌液、助剂及硅藻土的体积百分比分别为31％～33％，7％～9％及55％～65％，所述助剂可以包括糊精和淀粉，其中所述糊精的体积占修复剂总体积的4％～6％，所述淀粉的体积占修复剂总体积的2～4％。硅藻土、糊精和淀粉的加入量需保证三种微生物的活孢子量达到1亿cfu/g、5亿cfu/g、10亿cfu/g。

本申请实施例制备的复合微生物土壤修复剂能够减少土壤盐离子富集、促进作物生长、诱导植物抗病虫性。所述作物，例如为黄瓜、番茄、茄子、鲜食玉米、葡萄、青菜等。所述抗病性指的是抗蔬菜枯萎病、玉米顶腐病和螟害、茄子二十八星瓢虫等。所述复合土壤修复剂可采用拌土、穴施、土壤灌根方式中的一种或几种，使用方便，低毒，对环境相对安全。所述拌土具体为：按照所述复合土壤修复剂，每亩2kg-5kg拌土，10kg撒施在蔬菜大棚土壤表面，然后耙入土内，浇透水。所述穴施具体为：按照所述复合土壤修剂同，在蔬菜定殖或移栽时，每穴2g-5g。所述土壤灌根具体为：按照所述复合土壤修复剂兑水稀释200倍灌根。

实施例

1、棘孢木霉经过平板接种、活化培养、发酵、离心、制备成棘孢木霉菌浓缩发酵液。具体包括：

(1)棘孢木霉平板活化与扩繁：将棘孢木霉接种于PDA培养皿中，在28℃培养箱中倒置培养3d-4d。

PDA培养基：将200g马铃薯蒸煮后过滤的上层汁液、20g葡萄糖、20g琼脂粉、纯净水定容至1L，在121℃下高压灭菌30min。

(2)棘孢木霉种子菌的制备：将200g马铃薯、20g葡萄糖、纯净水1L分装至250mL三角瓶，在121℃下高压灭菌25min。从PDA木霉菌落用无菌水洗下分生孢子，调整至1.5×10⁶CFU/mL浓度，接入液体培养基中，置于180r/min、28℃摇床中摇瓶培养5天，得到棘孢木霉菌种子菌液。

(3)棘孢木霉中试规模(300L)发酵液制备

发酵培养基：55g/L玉米粉、3.82g/L磷酸二氢钾、1.42g/L硝酸钠、1.1g/L硫酸铵、1g/L氯化钠、0.5g/L七水硫酸镁、0.0075g/L七水硫酸亚铁、0.0025g/L硫酸锰、0.002g/L硫酸锌。种子液接入量为发酵液总体积的0.3％-1％。

发酵工艺：发酵开始，将溶氧量调节为1vvm，温度28℃，pH值为5左右，转速为160rpm-180rpm，将灭菌好的培养基接入种子液，木霉开始生长，此时pH值下降，菌丝变粗，木霉发酵24h～35h。发酵液pH值下降到最低点，此时加入氨水以自动调节pH值为3.2-3.5，为后期厚垣孢子大量产生做铺垫。溶氧量随着pH值的下降而降低，pH值下降到最低点溶氧量降至最低点。pH值和溶氧量达到最低点，发酵持续进行，待35h-50h孢子逐渐形成，菌丝逐渐变细并逐渐减少，孢子逐渐成型，缓慢降低溶氧量，保持在40％-50％。50h-90h菌丝成断线状，并逐渐消失，孢子逐渐成熟，并在发酵液中散落。发酵96h，菌丝全部消失，孢子成型。镜检，孢子量达到90％以上时，下罐。

发酵浓缩液制备：使用立式离心机对发酵液进行离心(800r/min)，离心得到棘孢木霉孢子和菌丝体沉淀分别保存于4℃冷库。

2、枯草芽孢杆菌22和贝莱斯芽孢杆菌经过平板接种、活化培养、发酵，制备成芽孢杆菌母液。具体包括：

(1)芽孢杆菌平板菌株的活化：

第一次活化：取体积百分数为20％或30％的甘油冷冻管(-60℃保存)，常温解冻，划线接种于PDA平板。30℃静置培养48h，单个菌落直径约0.8cm-1.2cm。

PDA培养基：将200g马铃薯蒸煮后过滤的上层汁液、20g葡萄糖、20g琼脂粉、纯净水定容至1L，121℃高压灭菌30min。

(2)芽孢杆菌种子液的制备

取第二次活化菌种接种2环于装有50mL培养基液体的带挡板三角瓶中(500mL)。30℃，200rpm培养18-19h。

枯草芽孢杆菌发酵培养基：20g/L酵母浸出粉、20g/L糖蜜、10g/L玉米蛋白粉、0.5g/L磷酸二氢钾、0.5g/L七水硫酸镁、0.3g/L氯化钠、3g/L碳酸钙、0.5g/L消泡剂，种子液接入量为发酵培养基总体积的0.3％-1％。

贝莱斯芽孢杆菌发酵培养基：2g/L酵母浸出粉、10g/L甘露醇、0.5g/L磷酸氢二钾、0.35g/L七水硫酸镁、0.15g/L氯化钠、1g/L碳酸钙、0.5g/L消泡剂，种子液接入量为发酵培养基总体积的0.3％-1％。

(3)芽孢杆菌发酵液的制备

枯草芽孢杆菌发酵工艺：灭菌前将pH值调整为7.0±0.2，发酵补糖后使用氨水将pH值控制为7.0±0.2。发酵开始，将溶氧量调节为1vvm，温度30℃，调节pH值(一般在7.0±0.2左右)，转速200rpm，将灭菌好的培养基接入种子液，接种后设置溶氧为100％满点，使其自然下降，待溶氧反弹并达到80±10％(约发酵22h左右)，此时流加45％葡萄糖溶液，溶氧控制在30～50％。芽孢开始生长，此时pH值下降，当发酵溶氧反弹至约80±10％(约22h)，以220g/h流速流加体积百分数为的45％葡萄糖溶液，总的补糖浓度约80g/L。溶氧量随着pH值的下降而降低，pH值下降到最低点溶氧量降至最低点。pH值和溶氧量达到最低点，发酵持续进行，待35h-50h孢子逐渐形成，孢子逐渐成型，缓慢降低溶氧量，保持在40％-50％。72h左右镜检，孢子量达到90％以上时，发酵完成，下罐。

贝莱斯芽孢杆菌发酵工艺：灭菌前将pH值调整为6.8±0.2。发酵开始，将溶氧量调节为0.8vvm，温度30℃，调节pH值(一般在6.8±0.2左右)，转速160rpm，将灭菌好的培养基接入种子液，接种后设置溶氧为100％满点，使其自然发酵，溶氧控制在30％～50％。待芽孢开始生长时(36h)，以130g/h流速流加30％葡萄糖溶液，此时pH值下降，当发酵溶氧反弹至约80±10％(约48h)，总的补糖浓度约50g/L。溶氧量随着pH值的下降而降低，pH值下降到最低点溶氧量降至最低点。pH值和溶氧量达到最低点，发酵持续进行，待45h-50h孢子逐渐形成，孢子逐渐成型，缓慢降低溶氧量，保持在40％-50％。72h左右镜检，孢子量达到90％以上时，发酵完成，下罐。

(4)棘孢木霉-芽孢杆菌混合液制备

棘孢木霉发酵液在常温，8000r/min下离心，收集沉淀菌物，孢子数达到30亿CFU/g；枯草芽孢杆菌发酵液，孢子数量为200cfu/ml；贝莱斯芽孢杆菌发酵液，孢子数量为100cfuU/ml；

将上述棘孢木霉沉淀菌物与枯草芽孢杆菌发酵液、贝莱斯芽孢杆菌发酵液按照1:5:10的孢子量比进行均匀混合，得到混合液。

(5)复合土壤修复剂制备

将上述木霉菌丝和孢子沉淀物、枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌发酵液进行活菌量检测，确定菌量之后利用木霉菌孢子沉淀物与枯草芽孢杆菌发酵液和贝莱斯芽孢杆菌发酵液，加入体积百分比为8％混合助剂，再加入适量硅藻土，在搅拌机中进行均匀混合，控制混合物湿度在30％-45％，在孢子干燥机上进行干燥，进行菌剂制作，确保菌量棘孢木霉数量:枯草芽孢杆菌数量：贝莱斯芽孢杆菌数量＝1亿:5亿:10亿(CFU/ml)。

3.土壤盐渍化修复试验

(1)NaCl胁迫土壤制备：将取自FX区非盐渍化露地田间土壤于121℃高压灭菌3次，将灭菌土加入土穴(5cm×5cm)，每穴40g。然后向每个土穴中加入10mL浓度为0.2mol/L的灭菌NaCl溶液，搅拌均匀制备成NaCl胁迫土壤。

(2)修复剂处理NaCl胁迫土壤：向土穴中加入200倍稀释的10mL修复剂，对照组中加入等量的无菌水，每个处理重复6个土穴，其中3个土穴移栽生长一周的黄瓜苗，另外3个土穴不种任何作物。然后于25℃恒温光照培养箱中培养，每天光照12h，并于处理后的10d采集土样,测定土壤电导率和盐渍化阳离子和阴离子含量。

4.黄瓜生长指标试验：将黄瓜种子浸种24小时，播种到混合有复合修复剂的常规园艺栽培基质穴盘中(5-10g/穴)，以不加入修复剂的处理无对照。每穴播种3粒种子，每个处理3次重复。4d后调查黄瓜出芽率、芽长、根长、鲜重等指标，结果如表1所示。

表1三元微生物土壤修复剂对黄瓜生长的影响

生长指标	复合修复剂浸种	对照组	增效(％)
				出芽率/％	100％	91.7％	8.3
平均芽长/cm	9.31±0.65	7.74±0.47	16.9
				平均根长/cm	8.41±1.27	7.31±0.52	13.1
10株鲜重/g	0.50±0.00	0.42±0.00	16.0

由表1可知，实施例1的复合微生物土壤修复剂可增加黄瓜种子出芽率，并且对黄瓜种子的芽、根的生长有促进作用。复合菌剂处理的土壤含盐量明显下降20％以上。

5、田间修复试验

在JS地区(金山)、FX地区(奉贤)、MH地区(闵行)、CM地区(崇明)、SJ地区(松江)的连作障碍大棚进行土壤修复试验，将菌剂随灌溉水施入土壤(稀释200倍)，结果如图3和图4。在图3和图4中，CK代表对照，对照为原始土壤，10代表处理1次10天，20代表处理2次20天。通过本申请实施例的复合微生物土壤修复剂处理10天和20天的连作障碍土壤，土壤电导率平均降低60-85％，重金属平均下降11％、硝态氮最高下降73.19％。K⁺、Mg²⁺和Cl^-、SO4^2-含量下降明显。

在JS地区、FX地区、MH地区、CM地区、SJ地区的连作障碍大棚进行土壤修复试验，将菌剂随灌溉水施入土壤(稀释200倍)，测定修复的土壤脲酶的变化，结果如图5所示。结果表明：通过本申请实施例的复合微生物土壤修复剂处理10天和20天的连作障碍土壤脲酶活力明显提高。与对照相比，施用菌剂最高可提高脲酶活力的2倍以上；施用2次菌剂的土壤脲酶含量高于1次施用处理。

如图6所示，以属作为分析单位，取前30位丰度较高的微生物作为分析对象。其中S1-S3为CK(对照)，S4-S6为棘孢木霉CTCCSJ-W-SBW10264，S7-S9为棘孢木霉与其他两种芽孢杆菌的混合菌。通过本申请实施例的复合微生物土壤修复剂施用之后20天，土壤中微生物丰度调节为稳定状态，尤其是丰度最高的Mortierella(小被孢霉)，其次还有可产生抗生素的真菌Acremonium等。施用之后，样品S7、S8、S9菌群趋于稳定且平衡状态。

本发明虽然已以较佳实施方式公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种复合微生物土壤修复剂，其特征在于，包括棘孢木霉、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌，其中所述棘孢木霉、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数之比为(0.7～1.5):(4～6):(9～11)；

所述棘孢木霉为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)CTCCSJ-W-SBW10264，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22404；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)22，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18677；所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ACCC15006，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22176。

2.如权利要求1所述的复合微生物土壤修复剂，其特征在于，还包括助剂和硅藻土，其中所述棘孢木霉、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的混合菌液、助剂及硅藻土的体积百分比分别为31％～33％、7％～9％及55％～65％。

3.如权利要求2所述的复合微生物土壤修复剂，其特征在于，所述助剂包括糊精和淀粉，其中所述糊精的体积占修复剂总体积的4％～6％，所述淀粉的体积占修复剂总体积的2％～4％。

4.一种复合微生物土壤修复剂的制备方法，其特征在于，包括：

混合棘孢木霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液及贝莱斯芽孢杆菌发酵液，获得混合菌液，其中所述棘孢木霉发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液及贝莱斯芽孢杆菌发酵液中活孢子数之比为(0.7～1.5):(4～6):(9～11)；

所述棘孢木霉为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)CTCCSJ-W-SBW10264，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22404；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)22，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18677；所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ACCC15006，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22176；

将所述混合菌液与助剂、硅藻土混合均匀。

5.根据权利要求4所述的复合微生物土壤修复剂的制备方法，其特征在于，所述混合菌液、助剂及硅藻土的体积百分比分别为31％～33％、7％～9％及55％～65％。

6.根据权利要求5所述的复合微生物土壤修复剂的制备方法，其特征在于，所述助剂包括糊精和淀粉，其中所述糊精的体积占修复剂总体积的4％～6％，所述淀粉的体积占修复剂总体积的2％～4％。

7.根据权利要求4所述的复合微生物土壤修复剂的制备方法，其特征在于，所述棘孢木霉发酵液的制备方法包括：

进行棘孢木霉(Trichoderma asperellum)CTCCSJ-W-SBW10264的活化与扩繁，获得棘孢木霉菌落；

处理所述棘孢木霉菌落，得到棘孢木霉种子菌液；

将所述棘孢木霉种子菌液置于棘孢木霉发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；

对所述发酵液进行离心，得到棘孢木霉发酵液，即沉淀菌物。

8.根据权利要求4所述的复合微生物土壤修复剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法包括：

对芽孢杆菌进行活化，得到活化的芽孢杆菌活化菌种；

处理所述活化的芽孢杆菌活化菌种，得到芽孢杆菌种子液；

将所述芽孢杆菌种子液置于枯草芽孢杆菌发酵培养基中进行发酵，得到枯草芽孢杆菌发酵液。

9.根据权利要求4所述的复合微生物土壤修复剂的制备方法，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液的制备方法包括：

对芽孢杆菌进行活化，得到活化的芽孢杆菌活化菌种；

处理所述活化的芽孢杆菌活化菌种，得到芽孢杆菌种子液；

将所述芽孢杆菌种子液置于贝莱斯芽孢杆菌发酵培养基中进行发酵，得到贝莱斯芽孢杆菌发酵液。