CN110938562A - 木霉菌和芽孢杆菌共培养方法及其共代谢产物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种木霉菌和芽孢杆菌共培养方法及其共代谢产物的用途；本发明以深绿木霉SG3403和枯草芽孢杆菌22菌株作为共培养对象，以共培养发酵液对小麦赤霉病菌的抑制率为响应值，通过响应面方法对培养温度，转速，pH，玉米粉含量，糖蜜含量，酵母粉含量和KCl含量等发酵条件进行优化，得到最佳的发酵条件为：28℃，214rpm，pH 6.8，酵母粉10g/L，糖蜜27.6g/L。本发明配方培养的共培养发酵液提高了对小麦赤霉病菌的抗性，并在共培养发酵液中发现了单一培养没有的物质，用其制备的种衣剂促进了小麦的生长，为生物农药和生物种衣剂的开发提供了新的选择。
Description
技术领域
本发明涉及一种木霉菌和芽孢杆菌共培养方法及其共代谢产物的用途；具体涉及一种针对防治小麦赤霉病、促进小麦生长的木霉菌和芽孢杆菌共培养技术的优化方法及其代谢产物对小麦赤霉病菌的拮抗作用和对小麦幼苗长的促生方面的应用。
背景技术
木霉菌和芽孢杆菌是一种重要的农业和工业微生物，特别是用作生防菌剂和植物生长促进剂。然而两种微生物单一使用均有一定的局限性。木霉菌主要通过竞争、重寄生和诱导抗性作用防治土传病害，而芽孢杆菌主要通过抗生作用防治叶部病害。从次生代谢谱上，两者也明显不同。木霉菌可产生100多种结构多样的次生代谢物，主要有聚酮类(Polyketides)、烷基吡喃酮类(Ajkylpyrones)、氨基酸衍生物、异腈类(Isonitries)、倍半萜烯类(Sesquiterpens)、类固醇类(Steroids)和抗菌肽类(Petaibols)等,多数是通过非核糖体肽合成酶(NRPs)、聚酮合酶(PKSs)以及氧化还原酶，酰基转移酶和糖基转移酶等代谢产物修饰酶负责代谢产物合成。例如：木霉菌素(trichodermin)、6-戊基-2H-吡喃-2-酮(6-Pentyl-2H-pyran-2-one)、胶霉素(gliotoxin)和绿胶霉素(viridin)等。芽孢杆菌则产生多种抗菌物质，如核糖体途径合成的肽类抗生素枯草菌素(subtilin)等,非核糖体途径合成的脂肽类抗生素表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、丰原素(fengycin)等。此外，这两种微生物都可以产生植物生长调节剂，包括IAA、IBA、GA等。因此如能将两类生防微生物有机结合，便能实现功能互补，拓展其生物防治靶标谱。然而目前国内外实现两类微生物组合的方式主要是将两种微生物分别发酵、制备菌剂，然后按比例组合或混合使用，尽管可提高防效及稳定性，但很难创制出新型微生物农药。
在正常的实验室培养条件下，微生物某些代谢产物相关生物合成基因簇处于沉默状态，通过若干微生物共培养模式，可能会激活这些沉默的生物合成基因簇的表达，从而合成在单一培养中未观察到的新的代谢产物。因此，微生物共培养可以作为提高代谢产物产量和多样性的手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种木霉菌和芽孢杆菌共培养方法，优化培养基配方以及应用效果；该木霉菌芽孢杆菌共培养发酵液可以抑制小麦赤霉病菌等多种病原真菌的生长以及促进小麦生长。本发明通过芽孢杆菌与木霉菌的共培养技术构建与优化，提高代谢产物的多样性和含量，提高了对小麦赤霉病菌的拮抗作用、防病效果和对小麦生长的促进作用，同时为创制新型微生物农药奠定技术基础；为生物农药和生物种衣剂的开发提供技术支撑。
本发明所采用的生防菌为深绿木霉菌(Trichoderma atroviride)SG3403和枯草芽孢杆菌22(Bacillus subtilis 22)，经纯化后转移至平板内作母菌剂，芽孢杆菌在三角瓶内振荡培养为液体菌种，木霉菌用无菌水制成孢子悬浮液。再将两种菌液接入发酵培养基共培养，以拮抗赤霉病菌(Fusarium graminearum)等的效价为响应值，利用响应面技术对共培养条件进行优化。利用优化的配方进行共培养，用其产物做抑菌谱试验发现，优化后配方的共培养产物对多种病原真菌具有明显的抑制作用；用其产物制备的生物种衣剂能明显提高对小麦赤霉病的防效，并对小麦生长具有促进作用。
具体而言，本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
第一方面，本发明涉及一种木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵方法，所述方法包括如下步骤：
S1、将深绿木霉Trichoderma atroviride SG3403接种于PDA培养基平皿中，25～28℃倒置培养2～3天；用无菌水将平皿上的木霉菌孢子刮下，制成浓度为1～2 x 108孢子/毫升的木霉分生孢子悬浮液；
S2、将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 22接种于LB培养基平皿中，30～36℃倒置培养1～2天，得LB平板菌种；在LB液体培养基中接入所述LB平板菌种，28～30℃、180转/分、培养1～2天；将所得培养液的芽孢浓度稀释至3～4 x 108cfu/毫升，得枯草芽孢杆菌菌液；
S3、将所述木霉分生孢子悬浮液、枯草芽孢杆菌菌液加入到共培养发酵培养基中，28～30℃，180～215转/分，培养3～5天，获得共培养发酵液。
作为本发明的一个实施方案，所述共培养发酵培养基含：10～20克/升玉米粉，10～20克/升酵母粉，10～28克/升糖蜜。在本发明的一个实施例中，称取20克玉米粉，20克酵母粉，20克糖蜜，蒸馏水定容至1升，分装在50毫升三角瓶中30毫升，在121℃下灭菌30分钟制备共培养发酵初始培养基。
作为本发明的一个实施方案，所述PDA培养基为：称取200克土豆切成1cm2的小块，小火煮30分钟，4层纱布过滤，保留汁液，加入20克葡萄糖，20克琼脂粉，蒸馏水定容至1升，121℃高压蒸汽灭菌30分钟制备而得。
作为本发明的一个实施方案，所述LB培养基为：称取10克蛋白胨，8克酵母粉，10克NaCl，20克琼脂粉，蒸馏水定容至1升，121℃高压蒸汽灭菌30分钟制备而得。
作为本发明的一个实施方案，所述LB液体培养基含：10克/升蛋白胨，8克/升酵母粉，10克/升NaCl。在本发明的一个实施例中，称取10克蛋白胨，8克酵母粉，10克NaCl，蒸馏水定容至1升，分装在50毫升三角瓶中30毫升，在121℃下灭菌30分钟制备LB液体培养基。
作为本发明的一个实施方案，所述木霉分生孢子悬浮液、枯草芽孢杆菌菌液、共培养发酵培养基的体积用量比为1:1:30，在此比例下，共培养发酵液的抑菌效果最佳。
作为本发明的一个实施方案，所述步骤S3还包括：以共培养发酵液对小麦赤霉病菌的抑制率作为响应值，基于响应面法优化共培养发酵条件的步骤。
所述共培养发酵液对小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)的抑制率是指：将共培养发酵液的无菌滤液(即，共培养代谢产物)，以200微升/10毫升培养基的量加入到PDA培养基中，通过菌丝的生长速率来判断共培养发酵代谢产物的拮抗赤霉病菌活性。
所述共培养发酵液的无菌滤液是通过将共培养发酵液用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌而得。
所述共培养发酵条件包括温度、转速、初始pH值、玉米粉含量、糖蜜含量、酵母粉含量和KCl含量。通过优化温度、转速、pH、玉米粉含量、糖蜜含量、酵母粉含量和KCl含量等发酵参数，提高共培养代谢产物的拮抗赤霉病菌活性真菌效价。
优化后的共培养发酵条件为：共培养发酵培养基中含酵母粉10g/L，糖蜜27.6g/L；共培养发酵的温度为28℃，转速为214转/分，pH 6.8。
第二方面，本发明涉及一种前述的木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵方法获得的共培养代谢产物。
所述共培养代谢产物为所述共培养发酵液的无菌滤液。更优选是采用优化共培养发酵条件共培养发酵而得的共培养发酵液的无菌滤液。对共培养代谢产物进行分析鉴定，该共培养代谢产物形成了单一培养缺少的拮抗病原真菌和促进植物生长的代谢物质。更优选是拮抗赤霉病菌和促进小麦生长的代谢物质。
第三方面，本发明涉及一种前述的共培养代谢产物在制备防治病原真菌和/或促进植物生长的生物制剂中的用途。
作为本发明的一个实施方案，所述病原真菌包括赤霉病菌、灰霉病菌，立枯丝核菌等。
作为本发明的一个实施方案，所述共培养代谢产物用于防治小麦赤霉病、和/或促进小麦生长。
作为本发明的一个实施方案，所述共培养代谢产物用于防治小麦赤霉病时，是将共培养代谢产物稀释10～100倍，喷施在小麦叶片上。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)22，已经于2019年10月14日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18677。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明通过选择特定的培养条件和特定的菌株，将两者直接共同培养，通过两者的直接互作带来不同于单一培养的产物；
2)本发明的木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵液产生了单一培养没有的抗真菌物质和促生长物质；
3)本发明的木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵液对小麦赤霉病菌的拮抗活性优于单一的木霉菌发酵液或单一的芽孢杆菌发酵液，可用于防治小麦赤霉病的防治的生物农药创制；
4)本发明的木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵液对小麦生长的促进作用优于单一的木霉菌发酵液或单一的芽孢杆菌发酵液，可用于小麦生物种衣剂的开发；
5)本发明的木霉菌和芽孢杆菌共培养发酵液对多种病原真菌具有抑制作用，具有广谱抗性，可用于多种植物病害的防治。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的深绿木霉菌SG3403和枯草芽孢杆菌22共培养发酵液与深绿木霉菌SG3403发酵液、枯草芽孢杆菌22发酵液对小麦赤霉病菌抑制的结果对比图；
图2为本发明的响应曲面图和等值线图；其中，(a)糖蜜浓度和初始pH的响应曲面图，(b)糖蜜浓度和初始pH的等值线图，(c)糖蜜浓度和转速的响应曲面图，(d)糖蜜浓度和转速的等值线图，(e)转速和初始pH的响应曲面图，(f)转速和初始pH的等值线图；
图3为本发明的深绿木霉菌SG3403和枯草芽孢杆菌22共培养发酵液对不同病原真菌的抑制结果；其中，(A)带毒培养基+立枯丝核菌，(a)空白培养基+立枯丝核菌；(B)带毒培养基+灰霉病菌，(b)空白培养基+灰霉病菌；(C)带毒培养基+小麦赤霉病菌，(c)空白培养基+小麦赤霉病菌；
图4为本发明的深绿木霉菌SG3403和枯草芽孢杆菌22共培养发酵液与深绿木霉菌SG3403发酵液、枯草芽孢杆菌22发酵液的干粉种衣剂对小麦生长的促进结果对比示意图；其中，(BT)木霉菌和芽孢杆菌共培养；(T)单一木霉菌；(B)单一芽孢杆菌；(CK)对照；
图5为本发明的深绿木霉菌SG3403和枯草芽孢杆菌22共培养发酵液对小麦赤霉病菌的防治结果；其中，(BT)木霉菌和芽孢杆菌共培养；(CK)空白对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
试验材料：深绿木霉(Trichoderma atroviride)是木霉菌属(Trichoderma)的一个种,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属(Bacillus)的一个种。它们都是对多种病原菌具有拮抗作用的生防菌，分布非常广泛。本实施例涉及的深绿木霉菌为Trichoderma atroviride SG3403(该菌株已公开发表在国际杂志Biological control ofsouthern corn leaf blight by Trichoderma atroviride SG3403.Biocontrol Scienceand Technology,2015,25,1133-1146)，该菌株保存于上海交通大学农业与生物学院农业部都市农业(南方)重点开放实验。本实施例涉及的枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis22，于上海交通大学农场(七宝)农田土壤中分离获得，该菌株保存于上海交通大学农业与生物学院农业部都市农业(南方)重点开放实验和中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.18677。
实施例1、木霉菌和芽孢杆菌的共培养方法
(1)平板菌种的制备：
称取200克土豆切成1cm2的小块，小火煮30分钟，4层纱布过滤，保留汁液，加入20克葡萄糖，20克琼脂粉，蒸馏水定容至1升，121℃高压蒸汽灭菌30分钟制备PDA培养基。将深绿木霉菌SG2403接种于PDA培养基平皿中，28℃培养箱中，倒置培养2-3天。
称取10克蛋白胨，8克酵母粉，10克NaCl，20克琼脂粉，蒸馏水定容至1升，121℃高压蒸汽灭菌30分钟制备LB固体培养基，将枯草芽孢杆菌22接种于LB培养基平皿中，30℃培养箱中，倒置培养1-2天。
(2)液体菌种的制备：
用无菌水将木霉菌孢子从PDA平板上刮下，制成浓度为2 x 108孢子/毫升的分生孢子悬浮液。
称取10克蛋白胨，8克酵母粉，10克NaCl，蒸馏水定容至1升，分装在50毫升三角锥形瓶中，每瓶30毫升，在121℃下灭菌30分钟制备LB液体培养基。将LB平板菌种接入锥形瓶，28℃，180转/分，培养1天，得到大量枯草芽孢杆菌菌液，将该菌液芽孢浓度稀释至4 x108cfu/毫升。
(3)共培养发酵培养基及发酵液的制备：
称取20克玉米粉，20克酵母粉，20克糖蜜，蒸馏水定容至1升，分装30毫升在50毫升三角瓶中，121℃下灭菌30分钟制备共培养发酵培养基。
将1毫升的木霉菌分生孢子悬浮液和1毫升的芽孢杆菌菌液加入到该共培养发酵培养基中，28℃，180转/分，培养5天，得到大量共培养发酵液，即木霉菌芽孢杆菌共培养发酵液。
实施例2、共培养发酵液拮抗小麦赤霉病菌的活性测定
将木霉菌芽孢杆菌共培养发酵液以及单一的木霉菌发酵液、芽孢杆菌发酵液(指的是：将1毫升的木霉菌分生孢子悬浮液加入到前述共培养发酵培养基中，28℃，180转/分，培养5天，得到单一的木霉菌发酵液；将1毫升的芽孢杆菌菌液加入到前述共培养发酵培养基中，28℃，180转/分，培养5天，得到单一的芽孢杆菌发酵液。)用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，以200微升/10毫升的量加入到PDA培养基(该培养基的配方即前面平板菌种制备中提及的PDA培养基配方)中，以空白PDA为对照，平板中央接小麦赤霉病菌，28℃，培养5天。通过发酵液对小麦赤霉病菌菌丝的抑制效果来判断共培养发酵液的抗真菌活性。
抑菌率＝[(对照病原菌面积-处理病原菌面积)/对照病原菌面积]×100％
不同处理对小麦赤霉病菌的抑制效果如图1所示；由图1可知，木霉菌和芽孢杆菌共培养发酵液对小麦赤霉病菌的抑制效果要优于木霉菌芽孢杆菌单一培养的。
实施例3、共培养配方的响应面优化
(1)Plackett-Burman设计(PBD)：在初始发酵培养基(20克玉米粉/升，20克酵母粉/升，20克糖蜜/升)的基础之上使用Plackett-Burman设计来确定影响发酵液抑菌率的主要因素。总共12实验运行7个实际变量(X1,X2,X3,X6,X7，X8和X11)和4个虚拟变量(X4,X5X9和X10)(表1)。在这项研究中,实际变量都设置了两个水平，分别是转速(rpm)(X1)(180，200)、温度(℃)(X2)(28，30)、初始pH值(X3)(6.5,7.5)、玉米粉浓度(克/升)(X6)(10，20)、糖蜜浓度(克/升)(X7)(10，20)、酵母粉浓度(克/升)(X8)(10，20)和KCl浓度(克/升)(X11)(0,1)(表1)。以发酵液对小麦赤霉病菌的抑制率作为响应值。
表1 Plackett-Burman设计及抑菌率测定结果
| 运行序 | X1 | X2 | X3 | (X4) | (X5) | X6 | X7 | X8 | (X9) | (X10) | X11 | 抑菌率(％) |
| 1 | 180 | 28 | 6.5 | -1 | -1 | 10 | 10 | 10 | -1 | -1 | 0 | 27 |
| 2 | 180 | 28 | 6.5 | 1 | 1 | 20 | 10 | 20 | 1 | -1 | 1 | 9 |
| 3 | 180 | 30 | 6.5 | -1 | -1 | 20 | 20 | 20 | -1 | 1 | 1 | 22 |
| 4 | 180 | 30 | 7.5 | 1 | -1 | 20 | 20 | 10 | 1 | -1 | 0 | 44 |
| 5 | 180 | 30 | 7.5 | -1 | 1 | 10 | 10 | 10 | 1 | 1 | 1 | 17 |
| 6 | 200 | 28 | 6.5 | -1 | 1 | 20 | 20 | 10 | 1 | 1 | 0 | 48 |
| 7 | 200 | 28 | 7.5 | 1 | -1 | 20 | 10 | 10 | -1 | 1 | 1 | 45 |
| 8 | 180 | 28 | 7.5 | 1 | 1 | 10 | 20 | 20 | -1 | 1 | 0 | 45 |
| 9 | 200 | 30 | 6.5 | 1 | 1 | 10 | 20 | 10 | -1 | -1 | 1 | 37 |
| 10 | 200 | 30 | 6.5 | 1 | -1 | 10 | 10 | 20 | 1 | 1 | 0 | 18 |
| 11 | 200 | 30 | 7.5 | -1 | 1 | 20 | 10 | 20 | -1 | -1 | 0 | 33 |
| 12 | 200 | 28 | 7.5 | -1 | -1 | 10 | 20 | 20 | 1 | -1 | 1 | 51 |
表2和图2的结果显示转速(X1)、温度(X2)、初始pH(X3)、糖蜜浓度(X7)的p值均<0.05。因此，这些因素被确定为影响发酵液抑菌率的重要变量。但由于两种温度水平(X2)的差异不是特别显著。因此，中心组合设计试验只对转速(X1)、初始pH(X3)和糖蜜浓度(X7)进行优化，以获得对小麦赤霉病菌的最大抑制率。
表2试验因子的重要性分析
| 变量 | 主效应 | 估计系数 | t-值 | p-值 |
| 常量 | - | 0.3293 | 26.26 | 0.000 |
| X1 | 0.1132 | 0.0566 | 4.51 | 0.011 |
| X2 | -0.0856 | -0.0428 | -3.41 | 0.027 |
| X3 | 0.1215 | 0.0607 | 4.84 | 0.008 |
| X6 | 0.0105 | 0.0052 | 0.42 | 0.698 |
| X7 | 0.1645 | 0.0822 | 6.56 | 0.003 |
| X8 | -0.0686 | -0.0343 | -2.74 | 0.052 |
| X11 | -0.0567 | -0.0283 | -2.26 | 0.087 |
(2)中心组合设计：采用MINITAB 18.1进行中心组合设计确定每个重要变量的最佳值。根据PBD的结果选择糖蜜浓度，转速和初始pH进行进一步优化。每个变量设置5个水平：糖蜜浓度(克/升)(X7)(16.6,20,25,30,33.4)，转速(rpm)(X1)(146,160,180,200,214)和初始pH(X3)(4.8,5.5,6.5,7.5,8.2)，一共进行20次实验。表3给出了实验设计以及实验和预测结果。表4采用t检验和f检验分析转速(X1)、初始pH(X3)、糖蜜浓度(X7)等变量之间的响应相互作用。除X12外，大多数模型的线性和平方项都是显着的(p<0.05)(表4)。变量X1和X3，X3和X7之间的相互作用是显着的(p<0.05)，而X1和X7不显着(p>0.05)。本研究失拟值(p>0.05)不显著，说明二次模型是有效的，R2、调整R2、预测R2，分别为0.977、0.957、0.852均大于0.8，说明二次模型对优化是有效的。得到抑制率(％)的二阶多项式方程的响应如下:
抑制率(％)＝0.50234+0.01532X1+0.02504X3+0.00682X7-0.00087X1 2-0.03516X3 2-0.01048X7 2-0.00763X1X3+0.00022X1X7+0.01422X3X7
再结合图2中的响应曲面图和等高线图，发酵液对小麦赤霉病菌的抑制率在214rpm，初始pH6.8和27.6克/升的糖蜜浓度下达到最大值。
表3中心组合设计及抑菌率测定结果
表4中心组合试验结果的回归分析
| 来源 | 自由度 | Adj.SS | Adj.MS | F值 | P值 |
| 模型 | 9 | 0.033571 | 0.00373 | 46.57 | 0 |
| X<sub>7</sub> | 1 | 0.000705 | 0.000705 | 8.8 | 0.014 |
| X<sub>3</sub> | 1 | 0.008814 | 0.008814 | 110.04 | 0 |
| X<sub>1</sub> | 1 | 0.003358 | 0.003358 | 41.93 | 0 |
| X<sub>7</sub>*X<sub>7</sub> | 1 | 0.001542 | 0.001542 | 19.25 | 0.001 |
| X<sub>3</sub>*X<sub>3</sub> | 1 | 0.01768 | 0.01768 | 220.74 | 0 |
| X<sub>1</sub>*X<sub>1</sub> | 1 | 0.000008 | 0.000008 | 0.1 | 0.761 |
| X<sub>7</sub>*X<sub>3</sub> | 1 | 0.001764 | 0.001764 | 22.02 | 0.001 |
| X<sub>7</sub>*X<sub>1</sub> | 1 | 0.000006 | 0.000006 | 0.07 | 0.796 |
| X<sub>3</sub>*X<sub>1</sub> | 1 | 0.000392 | 0.000392 | 4.9 | 0.051 |
| 误差 | 10 | 0.000801 | 0.00008 | ||
| 失拟 | 5 | 0.000657 | 0.000131 | 4.55 | 0.061 |
| 纯误差 | 5 | 0.000144 | 0.000029 | ||
| 合计 | 19 | 0.034372 |
所以，共培养的最佳发酵条件为：28℃，214rpm，pH 6.8，酵母粉10g/L，糖蜜27.6g/L。同时，对预测的响应优化结果进行了验证，在最佳条件下重复试验了三次。实际的抑制率为(54.22％)与预测结果密切相关(52.93％)，该发明结果是合适的。
实施例4、优化配方的代谢产物分析鉴定
将木霉菌和芽孢杆菌用响应面优化后的配方(28℃，214rpm，pH 6.8，酵母粉10g/L，糖蜜27.6g/L)分别共培养和单一培养5天，将产物用甲醇、乙腈1:1:1等体积混匀，-20℃静置1小时，在4℃下12,000rpm离心10分钟，将上清液送至上海交通大学分析测试中心进行LC-MS分析鉴定。结果显示共培养显著提高了2种物质含量(Trichoacorenol，Harzianum-A)并产生了8种单一培养没有的物质(Bisvertinol，Koninginin A，Mevastatin，IBA，NAA，11-desacetoxywortmannin，Spirolactones，Fleephilone)(表5)。其中，Koninginin A和Mevastatin具有抗真菌作用；IBA和NAA具有促进植物生长作用，为生物农药和种衣剂的开发奠定了基础。
表5共培养特异产生的代谢产物
实施例5、共培养优化配方的抑菌谱试验
将木霉菌和芽孢杆菌用响应面优化后的配方(28℃，214rpm，pH 6.8，酵母粉10g/L，糖蜜27.6g/L)培养5天，将发酵液用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌，与PDA培养基混合(200微升/10毫升)制成带毒培养基，空白PDA为对照，在平板中央分别接上立枯丝核菌，灰霉病菌和小麦赤霉病菌菌饼(该菌株保存于上海交通大学农业与生物学院农业部都市农业(南方)重点开放实验；且这三种病原菌已公开发表在国际杂志Biological control ofco-culture of Trichoderma atroviride SG3403 and Bacillus subtilis 22 improvesthe production of antifungal secondary metabolites,2020,140)，28℃培养5天。共培养发酵液对不同病原菌的抗真菌活性结果如图3。对立枯丝核菌，灰霉病菌和小麦赤霉病菌的抑制率分别达到71.4％，57.1％，54.2％。结果表明，木霉和芽孢杆菌共培养发酵液对不同病原真菌具有广谱抑制作用，为开发生物农药提供了新思路。
实施例6、共培养优化配方的促进小麦生长试验
将木霉菌和芽孢杆菌用响应面优化后的配方(28℃，214rpm，pH 6.8，酵母粉10g/L，糖蜜27.6g/L)分别共培养和单一培养5天，将培养液稀释100倍以200微升/克的量与滑石粉混匀干燥制成干粉种衣剂，以不加菌液的纯滑石粉为对照，将小麦种子用不同处理的干粉种衣剂拌种(100克种子/1克干粉)。播种于直径为15厘米的花盆中，每盆10粒，每处理三重复，25℃光照交替(日14小时/夜10小时)培养7天后，测量小麦叶片的长度。发酵液干粉种衣剂对小麦的促生结果如图4。木霉菌芽孢杆菌共培养(BT)，单一木霉菌(T)，单一芽孢杆菌(B)和对照的小麦叶长分别达到14.3厘米,12厘米,13厘米和12.6厘米。结果表明，木霉和芽孢杆菌共培养发酵液的干粉种衣剂显著促进了小麦的生长并且由于单一的木霉菌和芽孢杆菌种衣剂，为生物种衣剂的开发提供了新思路。
实例7、共培养代谢制备的生防制剂防治小麦赤霉病试验
将木霉菌和芽孢杆菌用响应面优化后的配方(28℃，214rpm，pH 6.8，酵母粉10g/L，糖蜜27.6g/L)共培养5天，将培养液稀释50倍喷施在扬花期的小麦叶片上，以等量的清水作为空白对照。3天后接种小麦赤霉病菌，一个月后调查病情指数和防效。发酵液对小麦赤霉病的防病效果如图5。结果表明，木霉和芽孢杆菌共培养发酵液稀释50倍后对小麦赤霉病的防效达到83％，显著抑制了小麦赤霉病的发生，为生防制剂的开发提供了新思路。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、将深绿木霉Trichoderma atroviride SG3403接种于PDA培养基平皿中，25～28℃倒置培养2～3天；用无菌水将平皿上的木霉菌孢子刮下，制成浓度为1～2×108孢子/毫升的木霉分生孢子悬浮液；
S2、将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 22接种于LB培养基平皿中，30～36℃倒置培养1～2天，得LB平板菌种；在LB液体培养基中接入所述LB平板菌种，28～30℃、180转/分、培养1～2天；将所得培养液的芽孢浓度稀释至3～4×108cfu/毫升，得枯草芽孢杆菌菌液；
S3、将所述木霉分生孢子悬浮液、枯草芽孢杆菌菌液加入到共培养发酵培养基中，28～30℃，180～215转/分，培养3～5天，获得共培养发酵液。
2.根据权利要求1所述的木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵方法，其特征在于，所述共培养发酵培养基含：10～20克/升玉米粉，10～20克/升酵母粉，10～28克/升糖蜜。
3.根据权利要求1所述的木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵方法，其特征在于，所述木霉分生孢子悬浮液、枯草芽孢杆菌菌液、共培养发酵培养基的体积用量比为1:1:30。
4.根据权利要求1所述的木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵方法，其特征在于，所述步骤S3还包括：以共培养发酵液对小麦赤霉病菌的抑制率作为响应值，通过响应面法优化共培养发酵条件的步骤。
5.根据权利要求4所述的木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵方法，其特征在于，所述共培养发酵条件包括温度、转速、初始pH值、玉米粉含量、糖蜜含量、酵母粉含量和KCl含量。
6.根据权利要求4所述的木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵方法，其特征在于，优化后的共培养发酵条件为：共培养发酵培养基中含酵母粉10g/L，糖蜜27.6g/L；共培养发酵的温度为28℃，转速为214转/分，pH 6.8。
7.一种根据权利要求1～6中任一项所述的木霉菌和芽孢杆菌的共培养发酵方法获得的共培养代谢产物。
8.一种根据权利要求7所述的共培养代谢产物在制备防治病原真菌和/或促进植物生长的生物制剂中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述病原真菌包括赤霉病菌、灰霉病菌，立枯丝核菌。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述共培养代谢产物用于防治小麦赤霉病、和/或促进小麦生长。
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