CN111500644A - 一种防治植物疫霉病的复合菌发酵产物的制备方法、复合菌发酵产物及其应用 - Google Patents

一种防治植物疫霉病的复合菌发酵产物的制备方法、复合菌发酵产物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种防治植物疫霉病的复合菌发酵产物的制备方法、复合菌发酵产物及其应用。所述制备方法包括：(1)将海洋木霉进行孢子培养，将得到的孢子接种到震荡培养基中进行震荡培养，得到海洋木霉震荡培养物；(2)将枯草芽孢杆菌进行种子培养，得到的种子培养物接种到震荡培养基中进行震荡培养，得到枯草芽孢杆菌震荡培养物，将所述枯草芽孢杆菌震荡培养物与步骤(1)得到的海洋木霉震荡培养物混合后进行共发酵，得到共发酵物，将所述共发酵物离心、过滤，得到复合菌发酵产物。本发明制备的复合菌发酵产物显著降低植物疫霉的生长，相对于单个菌种的防治效果，对植物真菌病害具有较好的防治效果。

Description

一种防治植物疫霉病的复合菌发酵产物的制备方法、复合菌 发酵产物及其应用
技术领域
本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种防治植物疫霉病的复合菌发酵产物的制备方法、复合菌发酵产物及其应用。
背景技术
疫霉属卵菌是重要的植物病原菌，几乎侵染所有双子叶植物和部分禾本科植物，据统计，每年导致全球经济损失接近500亿美元。由于寄主范围广、传播途径多，加上病原菌能形成卵孢子等休眠体在土壤中长期存活，迄今，疫霉病害防治仍是世界性难题。目前生产上防治药剂主要为特异性地抑制RNA聚合酶Ⅰ的甲霜灵为主，药剂使用年限长、品种相对单一，极易造成农药残留、环境污染及病原抗药性产生，亟需寻找替代药剂。
我国在微生物生防资源利用与生物农药研发部分已居国际先进水平，但相比欧美等发达国家研发力度与产业化水平还有差距。菌株来源单一、防效差、制剂加工落后等是制约微生物农药发展的主要瓶颈问题。目前微生物农药选用菌株多以单一菌株或少数菌株复配为主，防病机制单一、防治效果偏低且不稳定，选用不同来源和作用机制菌株搭配使用成为微生物农药重要发展方向。在微生物发酵方面，多以菌株单独发酵或复配为主，近年兴起的共培养技术在生防领域尚未见报道。
发明内容
本发明提供了一种防治植物疫霉病的复合菌发酵产物的制备方法、复合菌发酵产物及其应用，经该方法制备的发酵产物能够显著降低植物疫霉的活性，对植物真菌病害具有较好的防治效果。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供一种防治植物疫霉病的复合菌发酵产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将海洋木霉进行孢子培养，将得到的孢子接种到震荡培养基中进行震荡培养，得到海洋木霉震荡培养物；
(2)将枯草芽孢杆菌进行种子培养，得到的种子培养物接种到震荡培养基中进行震荡培养，得到枯草芽孢杆菌震荡培养物，将所述枯草芽孢杆菌震荡培养物与步骤(1)得到的海洋木霉震荡培养物混合后进行共发酵，得到共发酵物，将所述共发酵物离心过滤，得到复合菌发酵产物。
优选的，所述海洋木霉包括海洋棘孢木霉或海洋里氏木霉。
优选的，所述海洋棘孢木霉包括海洋棘孢木霉HG1，所述海洋棘孢木霉 HG1的保藏编号为CGMCC NO.19276。
优选的，所述海洋里氏木霉包括海洋里氏木霉HT6或海洋里氏木霉 HT7，所述海洋里氏木霉HT6的保藏编号为CGMCC NO.19274，所述海洋里氏木霉HT7的保藏编号为CGMCCNO.19275。
优选的，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌Tpb55，所述枯草芽孢杆菌Tpb55的保藏编号为CGMCC NO.2843。
优选的，所述步骤(1)震荡培养的条件包括：所述震荡培养的温度为 25～33℃，所述震荡培养的转速为160～200rpm，所述震荡培养的时间为 48～72h；所述孢子培养物中海洋木霉的孢子浓度在1×105cfu/ml以上。
优选的，所述步骤(2)震荡培养的条件包括：所述震荡培养的温度为 25～33℃，所述震荡培养的转速为160～200rpm，所述震荡培养的时间为 12～24h；所述种子培养物中枯草芽孢杆菌的活菌浓度在1×105cfu/ml以上。
优选的，所述步骤(2)共发酵的条件包括：所述共发酵的温度为25～33℃，所述共发酵的时间为6～8d，所述共发酵的转速为160～200rpm。
本发明还提供了基于上述技术方案所述的制备方法制备得到的复合菌发酵产物。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合菌发酵产物在防治植物疫霉病上的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所述一种防治植物疫霉病的复合菌发酵产物的制备方法，所述复合菌包括海洋木霉和枯草芽孢杆菌，其中筛选获得3株海洋木霉和1株枯草芽孢杆菌作为目标菌株，海洋木霉包括海洋棘孢木霉HG1、海洋里氏木霉 HT6、海洋里氏木霉HT7，枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌Tpb55，构建其种间互作体系，制备得到共发酵产物，将该复合菌发酵产物进行体外抑菌和作物盆栽实验，相对于单独菌种发酵产物，该共发酵产物达到显著抑制烟草黑胫病菌(P.parasitica var.nicotianae)的作用，同时对感染烟草黑胫病菌的烟草苗具有很好的防治效果。
本发明首次利用了海洋木霉与枯草芽孢杆菌的种间互作效应进行植物疫霉病的防治，有助于解决制约当前微生物农药发展的瓶颈问题，为农业绿色发展和农药产业转型升级提供产品和技术支撑，因此具有重要的社会和经济意义。
附图说明
图1为琼脂糖扩散法测海洋木霉抗烟草黑胫病菌筛选效果图；
图2为菌丝生长速率法测海洋木霉抗烟草黑胫病菌筛选效果图；
图3为HG1和Tpb55纯培养及共培养产物抗烟草黑胫病菌效果图；
图4为HT6和Tpb55纯培养及共培养产物抗烟草黑胫病菌效果图；
图5为HT7和Tpb55纯培养及共培养产物抗烟草黑胫病菌效果图；
图6为HG1与Tpb55共培养产物抗烟草黑胫病菌盆栽图，从左到右依次为空白对照、Tpb55、HG1、共培养发酵产物。
生物保藏说明
海洋棘孢木霉菌株HG1，拉丁文为Trichoderma asperellum，于2020年 3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC NO.19276。
海洋里氏木霉菌株HT6，拉丁文为Trichoderma reesei，其于2020年3 月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC NO.19274。
海洋里氏木霉菌株HT7，拉丁文为Trichoderma reesei，其于2020年3 月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC NO.19275。
枯草芽孢杆菌菌株Tpb55，拉丁文为Bacillus subtilis，来源于专利号为CN102154186B中记载的枯草芽孢杆菌菌株Tpb55，记载的保藏信息为于 2008年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC NO.2843。
具体实施方式
本发明提供了一种防治植物疫霉病的复合菌发酵产物的制备方法，包括以下步骤：(1)将海洋木霉进行孢子培养，将得到的孢子接种到震荡培养基中进行震荡培养，得到海洋木霉震荡培养物；(2)将枯草芽孢杆菌进行种子培养，得到种子培养物接种到震荡培养基中进行震荡培养，得到枯草芽孢杆菌震荡培养物，将所述枯草芽孢杆菌震荡培养物与步骤(1)得到的海洋木霉震荡培养物混合后进行共发酵，得到共发酵物，将所述共发酵物离心过滤，得到复合菌发酵产物。
在本发明中，所述海洋木霉优选包括海洋棘孢木霉或海洋里氏木霉，所述海洋棘孢木霉优选包括海洋棘孢木霉HG1，保藏编号为CGMCC NO.19276，来源于海南红树植物海漆(Excoecaria agallocha Linn.)的根。所述海洋里氏木霉优选包括海洋里氏木霉HT6或海洋里氏木霉HT7，所述海洋里氏木霉HT6的保藏编号为CGMCC NO.19274，所述海洋里氏木霉HT7 的保藏编号为CGMCC NO.19275，所述海洋里氏木霉HT6和海洋里氏木霉 HT7均来源于海南红树植物海漆(Excoecaria agallocha Linn.)的根际土。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌优选包括枯草芽孢杆菌Tpb55，来源于专利号为CN102154186B中记载的枯草芽孢杆菌菌株Tpb55，保藏编号为 CGMCC NO.2843。
在本发明中，所述海洋木霉孢子培养所用的培养基优选为使海洋木霉能产孢子的培养基，比如NB培养基、PDA培养基等，具体可采用市售的使海洋木霉能产孢子的培养基。在本发明中，所述震荡培养基优选为使海洋木霉能产孢子的液体培养基。在本发明中，所述震荡培养优选采用摇床进行，本发明对所述摇床没有特殊限定，采用本领域常规使用的即可。在本发明中，所述震荡培养的温度优选为25～33℃，所述震荡培养的转速优选为160～200rpm，所述震荡培养的时间优选为48～72h。在本发明中，所述孢子培养物中海洋木霉的孢子浓度在1×105cfu/ml以上。在本发明中所述海洋木霉孢子培养物接种到震荡培养基中的体积比优选为1:50～100。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌种子培养所用的培养基优选为使枯草芽孢杆菌可生长的培养基，比如NB培养基、LB培养基培养基等，具体可采用市售的使枯草芽孢杆菌生长的培养基。在本发明中，所述震荡培养基优选为使枯草芽孢杆菌能生长的液体培养基。在本发明中，所述震荡培养优选在摇床上进行，本发明对所述摇床没有特殊限定，采用本领域常规使用的即可。在本发明中，所述震荡培养的温度优选为25～33℃、所述震荡培养的转速优选为160～200rpm，所述枯草芽孢杆菌震荡培养的时间优选为12～24h。在本发明中，所述培养物中枯草芽孢杆菌的活菌浓度在1×105cfu/ml以上。
在本发明中，加入枯草芽孢杆菌的时间太早海洋木霉生长不好，太晚枯草芽孢杆菌生长不好，所述海洋木霉震荡培养时间优选为48～72h。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌震荡培养物与海洋木霉震荡培养物的体积比优选为1:250～1:750。在本发明中，所述共发酵的温度优选为25～33℃、所述共发酵的转速优选为160～200rpm，所述共发酵的时间优选为6～8d。在本发明中，所述共发酵的发酵培养基优选包括NB培养基、察氏培养基、葡萄糖蛋白胨酵母膏(GPY)培养基、马铃薯葡萄糖水培养基或Luria-Bertani 培养基等，均采用市售即可。
本发明对所述共发酵物离心过滤的条件没有特殊限定，采用本领域技术人员常规离心过滤微生物培养物的离心过滤条件即可。
本发明还提供了基于上述技术方案所述的制备方法制备得到的复合菌发酵产物。在本发明中，所述复合菌发酵产物对植物疫霉病有显著的防治效果。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合菌发酵产物在防治植物疫霉病上的应用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.海洋木霉的筛选培养
(1)将海洋木霉在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基28℃下静置培养 7天。
(2)取上述培养长出的小块菌丝于200mL营养肉汤(NB)培养基中， 28℃、180rpm振荡培养15天，获得海洋木霉发酵液，设置3个重复。
2.海洋木霉活性测定
海洋木霉代谢产物溶液的配制
15天后，用纱布将海洋木霉发酵液中的培养液和菌体分开萃取，培养液用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取后浓缩至干，菌体用甲醇和二氯甲烷1:1混合液100mL浸泡3天后过滤，滤液浓缩后，水相采用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取，后浓缩至干。将得到的发酵液和发酵菌体萃取物分别用二甲亚砜 (DMSO)溶解，配制成10.0mg/mL溶液。
琼脂糖扩散法
将烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.Nicotianae，来源于中国农业科学院烟草研究所青岛基地烟草，0号小种)在燕麦(OA)培养基28℃培养3周，之后加入无菌0.1％KNO3溶液浸泡，26℃避光培养12-72h，用生理盐水将孢子洗出，调整浓度至105cfu/mL，分别取0.1mL含孢液于OA培养基上，涂布均匀。稍干后，用无菌打孔器在离培养基边缘3cm处打取4 个直径为5mm的小孔，4个小孔呈等边正方形排列。在3个小孔中加入30μL 的上述配制成的含有木酶代谢产物的溶液，另一个小孔作为对照，加入 DMSO，28℃培养72h。结果见图1。
从图1中可以看出，加入海洋木霉代谢产物的溶液的孔，烟草黑胫病菌丝并没有长过去，产生了明显的抑菌圈，而对照孔没有明显抑菌圈，证明了海洋棘孢木霉HG1、海洋里氏木霉HT6和海洋里氏木霉HT7对烟草黑胫病菌具有明显的抑制作用。
菌丝生长速率法
取5mL配制成的含有木霉代谢产物的溶液加到15mL燕麦培养基中混合均匀，制作平板培养基。从活化后的烟草黑胫病菌菌落边缘，取直径为5mm 的菌饼，均匀置于平板中央，设置对照组，对照加入DMSO，三次重复，28℃恒温培养96h，采用十字交叉法记录菌饼生长直径，计算抑制率。
抑制率(％)＝(1-处理组纯生长量/空白组纯生长量)×100
纯生长量(mm)＝菌饼生长直径(mm)-5
从图2中可以看出，加入海洋棘孢木霉HG1、海洋里氏木霉HT6和海洋里氏木霉HT7代谢产物溶液的生长直径明显小于对照组，证明了海洋棘孢木霉HG1(保藏编号为CGMCCNO.19276)、海洋里氏木霉HT6(保藏编号为CGMCC NO.19274)和海洋里氏木霉HT7(保藏编号为CGMCC NO.19275)对烟草黑胫病菌有明显的抑制作用。
实施例2
海洋棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tbp55种间互作培养体系的构建
(1)将HG1接种到NA(NB培养基加20g/L琼脂)培养基上，28℃，培养3天，无菌水洗出孢子，使孢子浓度达到105CFU/mL，然后取1mL到 50mLNB液体培养基中，28℃、180rpm震荡培养48h，得到长出菌丝的震荡培养物；
(2)将Tbp55接种在NA培养基上培养24h，后接种到50mLNB培养基中，28℃、180rpm培养24h，调整菌液浓度为105CFU/mL，取100μL加入到步骤(1)生长48h的50mL震荡培养物中，28℃、180rpm共发酵6d，得到HG1与Tbp55共发酵物。
(3)将步骤(2)中得到的HG1与Tbp55共发酵物用水膜过滤2遍，得复合菌发酵产物，取5mL复合菌发酵产物加入20mL温热的OA培养基中制作平板培养基，后采用菌丝生长速率法测试对烟草黑胫病菌的活性。结果见图3和表1。
实施例3
海洋里氏木霉HT6与枯草芽孢杆菌Tbp55种间互作培养体系的构建，其余条件同实施例2。结果见图4和表1。
实施例4
海洋里氏木霉HT7与枯草芽孢杆菌Tbp55种间互作培养体系的构建，其余条件同实施例2。结果见图5和表1。
对比例1
对海洋棘孢木霉HG1单独培养，同实施例2步骤(1)，对发酵液处理，同实施例2步骤(3)。结果见图3和表1。
对比例2
对海洋里氏木霉HT6单独培养，同实施例2步骤(1)，对发酵液处理，同实施例2步骤(3)。结果见图4和表1。
对比例3
对海洋里氏木霉HT7单独培养，同实施例2步骤(1)，对发酵液处理，同实施例2步骤(3)。结果见图5和表1。
对比例4
对枯草芽孢杆菌Tpb55单独培养，同实施例2步骤(2)涉及到的枯草芽孢杆菌Tpb55单独培养步骤，对发酵液处理，同实施例2步骤(3)。结果见图3-5和表1。
从图3-5中可以看出，种间互作后的共发酵产物比海洋木霉和芽孢杆菌纯培养的发酵产物抗菌活性都有提高，但HG1与Tbp55种间互作培养得到的共发酵产物对烟草黑胫病菌的抑制效果相较于纯培养更好。
表1.抗烟草黑胫病菌效果数据
菌株 对比例1 实施例2 对比例2 实施例3 对比例3 实施例4 对比例4 空白
直径cm 5.80±0.22 4.58±0.10 5.88±0.06 5.45±0.05 5.72±0.12 5.42±0.03 5.43±0.08 7.80±0.10
从表1可以看出，种间互作后的共发酵产物比海洋木霉和枯草芽孢杆菌纯培养的发酵产物对烟草黑胫病菌抑制效果好。
对比例5
步骤同实施例2，将NB培养基替换为葡萄糖蛋白胨酵母膏(GPY)培养基。结果见表2。
对比例6
步骤同实施例2，将NB培养基替换为改良察氏培养基。结果见表2。
对比例7
步骤同实施例2，将NB培养基替换为马铃薯葡萄糖水培养基(PDW)。结果见表2。
对比例8
步骤同实施例2，将NB培养基替换为Luria-Bertani培养基。结果见表 2。
表2不同培养基下HG1与Tpb55共培养产物抗烟草黑胫病菌数据
培养基 实施例2 对比例5 对比例6 对比例7 对比例8
直径(mm) 4.58±0.10 2.14±0.18 2.97±0.06 3.62±0.12 4.41±0.04
由表2可以看出，GPY和察氏培养基的发酵产物对于黑胫病菌丝生长的抑制率最高，特别是GPY培养基，与LB培养基和NB培养基的数据相比，其效果好了1倍。
对比例9
步骤同实施例2，将最后一步共发酵温度28℃替换为25℃。结果见表3。
对比例10
步骤同实施例2，将最后一步共发酵温度28℃替换为30℃。结果见表3。
对比例11
步骤同实施例2，将最后一步共发酵温度28℃替换为33℃。结果见表3。
表3不同发酵温度下HG1与Tpb55共培养产物抗烟草黑胫病菌数据
温度(℃) 实施例2 对比例9 对比例10 对比例11
直径(cm) 2.68±0.32 4.12±0.18 4.66±0.08 3.21±0.33
由表3可以看出，GPY培养基28℃条件下的发酵产物对于黑胫病菌丝生长的抑制率最高，与30℃发酵条件相比，效果提高了0.7倍。
实施例5
海洋棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tbp55种间互作抗烟草黑胫病菌盆栽实验
(1)将谷子置于蒸馏水中熬煮20min，用纱布滤干水取300g分置于锥形瓶中，高压灭菌(121℃，30min)。将烟草疫霉接种于OA培养基上活化4 天后，用打孔器取菌饼置于灭好的谷子培养基中(每瓶3-5个菌饼)，26℃下培养14天，即为烟草黑胫病菌菌谷。
(2)将50g土壤装入直径为10cm花盆中，取大小一致的烟苗移栽，水浇透后28℃培养3天。在近根部凿取深度5cm小孔，加入3g菌谷。2天后，将上述实施例2得到的海洋棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tbp55共发酵物过滤，用蒸馏水稀释3倍，每盆倒入20mL，5天后统计发病情况，设置3 次重复，并设置空白对照。结果见图6和表4。
表4 HG1与Tpb55种间互作产物抗烟草黑胫病菌盆栽数据
处理 发病率％ 病情指数 相对防效％
CK 75.00±8.33 76.23±14.53 -
HG1-Tbp55 40.44±17.34 42.59±15.30 44.77±15.85
从图6和表4可以看出，加入海洋棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tbp55 共培养发酵产物的烟苗成活率高，且该复合菌共发酵产物对感染烟草黑胫病菌的烟苗具有很好的防治效果，与空白对照相比，相对防疫达到44.77％。
经上述实施例试验结果可知，本发明提供的海洋木霉与枯草芽孢杆菌复合菌发酵产物的制备方法，制得的复合菌发酵产物对疫霉菌具很好的抑制作用。本发明技术方案制备的复合菌发酵产物应用于感染疫霉菌的植物中，可达到防治植物疫霉病的效果，而且可减少植物的发病率，增强植物的抵抗能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种防治植物疫霉病的复合菌发酵产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将海洋木霉进行孢子培养，将得到的孢子接种到震荡培养基中进行震荡培养，得到海洋木霉震荡培养物；
(2)将枯草芽孢杆菌进行种子培养，得到的种子培养物接种到震荡培养基中进行震荡培养，得到枯草芽孢杆菌震荡培养物，将所述枯草芽孢杆菌震荡培养物与步骤(1)得到的海洋木霉震荡培养物混合后进行共发酵，得到共发酵物，将所述共发酵物离心、过滤，得到复合菌发酵产物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述海洋木霉包括海洋棘孢木霉或海洋里氏木霉。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述海洋棘孢木霉包括海洋棘孢木霉HG1，所述海洋棘孢木霉HG1的保藏编号为CGMCC NO.19276。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述海洋里氏木霉包括海洋里氏木霉HT6或海洋里氏木霉HT7，所述海洋里氏木霉HT6的保藏编号为CGMCC NO.19274，所述海洋里氏木霉HT7的保藏编号为CGMCC NO.19275。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌Tpb55，所述枯草芽孢杆菌Tpb55的保藏编号为CGMCC NO.2843。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)震荡培养的条件包括：所述震荡培养的温度为25～33℃，所述震荡培养的转速为160～200rpm，所述震荡培养的时间为48～72h；
所述孢子培养物中海洋木霉的孢子浓度在1×105cfu/ml以上。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)震荡培养的条件包括：所述震荡培养的温度为25～33℃，所述震荡培养的转速为160～200rpm，所述震荡培养的时间为12～24h；
所述种子培养物中枯草芽孢杆菌的活菌浓度在1×105cfu/ml以上。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)共发酵的条件包括：所述共发酵的温度为25～33℃，所述共发酵的时间为6～8d，所述共发酵的转速为160～200rpm。
9.一种基于权利要求1-8任意一项所述的制备方法制备得到的复合菌发酵产物。
10.权利要求9所述的复合菌发酵产物在防治植物疫霉病上的应用。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113136358A (zh) * 2021-06-01 2021-07-20 重庆大学 一种提高人参皂苷产量的好氧共培养益生菌发酵工艺
CN113736693A (zh) * 2021-08-19 2021-12-03 青岛农业大学 一种抗紫外线的微生物菌剂及应用
CN113943193A (zh) * 2021-06-15 2022-01-18 闽江学院 一种海洋生物肥料及其制备方法和应用
CN114685201A (zh) * 2022-04-20 2022-07-01 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 一种堆肥发酵中改变物质转化代谢和病原微生物的方法
CN115590023A (zh) * 2022-04-18 2023-01-13 中国农业科学院烟草研究所（Cn） 癸二烯酸在防治植物疫霉病中的应用
CN116891821A (zh) * 2023-08-21 2023-10-17 中国农业科学院烟草研究所 棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55共培养的培养基及其生防制剂
CN117511749A (zh) * 2023-10-31 2024-02-06 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 一种棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55的固态发酵方法及其应用
CN116891821B (zh) * 2023-08-21 2024-06-07 中国农业科学院烟草研究所 棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55共培养的培养基及其生防制剂

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070122181A (ko) * 2006-06-23 2007-12-28 대구대학교 산학협력단 고추 작물을 위한 길항 미생물 트라이코델마 하르지아눔을이용한 미생물 제제
CN102154186A (zh) * 2011-04-14 2011-08-17 中国农业科学院烟草研究所 一株枯草芽孢杆菌及其在真菌病害防治中的应用
CN102911878A (zh) * 2012-09-27 2013-02-06 浙江大学 一株棘孢木霉菌株及其应用
CN105875645A (zh) * 2015-12-23 2016-08-24 鹤壁市禾盛生物科技有限公司 一种防治烟草根黑腐病的生物菌剂的制备方法
CN106497831A (zh) * 2016-10-21 2017-03-15 广州市林业和园林科学研究院 一种防治烟草疫霉病复合菌剂及其制备方法和应用
CN110938562A (zh) * 2019-12-04 2020-03-31 上海交通大学 木霉菌和芽孢杆菌共培养方法及其共代谢产物的用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070122181A (ko) * 2006-06-23 2007-12-28 대구대학교 산학협력단 고추 작물을 위한 길항 미생물 트라이코델마 하르지아눔을이용한 미생물 제제
CN102154186A (zh) * 2011-04-14 2011-08-17 中国农业科学院烟草研究所 一株枯草芽孢杆菌及其在真菌病害防治中的应用
CN102911878A (zh) * 2012-09-27 2013-02-06 浙江大学 一株棘孢木霉菌株及其应用
CN105875645A (zh) * 2015-12-23 2016-08-24 鹤壁市禾盛生物科技有限公司 一种防治烟草根黑腐病的生物菌剂的制备方法
CN106497831A (zh) * 2016-10-21 2017-03-15 广州市林业和园林科学研究院 一种防治烟草疫霉病复合菌剂及其制备方法和应用
CN110938562A (zh) * 2019-12-04 2020-03-31 上海交通大学 木霉菌和芽孢杆菌共培养方法及其共代谢产物的用途

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MUHAMMAD ZHHAIB ANJUM等: "Bio-efficacy of Trichoderma isolates and Bacillus Subtilis against root rot of muskmelon cucumis melo l. caused by Phytphthora Drechsleri under controlled and field conditions", 《PAK. J. BOT.》 *
OSZAKO TOMASZ等: "Influence of Bacillus subtilis and Trichoderma asperellum on the development of birch seedlings infected with fine root pathogen Phytophthora plurivora", 《SYLWAN》 *
张成省等: "枯草芽孢杆菌Tpb55挥发物对烟草的防病促生效应", 《中国生物防治》 *
黄瑞环等: "烟草主要病害拮抗菌的筛选鉴定及除草活性分析", 《烟草科技》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113136358A (zh) * 2021-06-01 2021-07-20 重庆大学 一种提高人参皂苷产量的好氧共培养益生菌发酵工艺
CN113136358B (zh) * 2021-06-01 2023-08-04 重庆大学 一种提高人参皂苷产量的好氧共培养益生菌发酵工艺
CN113943193A (zh) * 2021-06-15 2022-01-18 闽江学院 一种海洋生物肥料及其制备方法和应用
CN113736693A (zh) * 2021-08-19 2021-12-03 青岛农业大学 一种抗紫外线的微生物菌剂及应用
CN115590023A (zh) * 2022-04-18 2023-01-13 中国农业科学院烟草研究所（Cn） 癸二烯酸在防治植物疫霉病中的应用
CN115590023B (zh) * 2022-04-18 2024-02-09 中国农业科学院烟草研究所 癸二烯酸在防治植物疫霉病中的应用
CN114685201A (zh) * 2022-04-20 2022-07-01 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 一种堆肥发酵中改变物质转化代谢和病原微生物的方法
CN116891821A (zh) * 2023-08-21 2023-10-17 中国农业科学院烟草研究所 棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55共培养的培养基及其生防制剂
CN116891821B (zh) * 2023-08-21 2024-06-07 中国农业科学院烟草研究所 棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55共培养的培养基及其生防制剂
CN117511749A (zh) * 2023-10-31 2024-02-06 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 一种棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55的固态发酵方法及其应用

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