CN113736693A - 一种抗紫外线的微生物菌剂及应用 - Google Patents

一种抗紫外线的微生物菌剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗紫外线的微生物菌剂及应用。涉及微生物技术领域。包括枯草芽孢杆菌微胶囊和海洋棘孢木霉HG1；枯草芽孢杆菌微胶囊包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，保藏编号为CGMCCNo.2843；海洋棘孢木霉HG1，保藏编号为CGMCCNO.19276。本发明利用相容性好的丝素蛋白和多巴胺材料，通过微胶囊化制备枯草芽孢杆菌菌剂，改善了其抗紫外性能，与海洋棘孢木霉HG1进一步组合制备生物菌剂，提高了对植物病害的抑菌效果，制备的水分散粒剂对番茄灰霉病的防治效果达到76.27％，对烟草黑胫病的防治效果达到70.06％。

Description

一种抗紫外线的微生物菌剂及应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一种抗紫外线的微生物菌剂及应用。
背景技术
化学农药的使用虽然对保障农业生产起到了至关重要的作用，但由于长期使用，对环境生态也造成了影响，同时也进一步加剧了害物的抗药性导致防治效果降低，而且随着人们对食品安全性的要求越来越高，农药残留也引起了重视。减少化学农药使用，同时要保障对农业生产的良好发展成为迫切解决的问题。实践证明，环境友好、防治专一的微生物杀菌剂的应用是防治农业病虫害草害的重要途径。
枯草芽孢杆菌可以自身产生多种活性物质，对多种植物病害有良好的抑菌活性，而且生长速度快、营养需求简单、无致病性，用途广泛，是一种可以直接应用于生产的理想生防菌。虽然枯草芽孢杆菌应用广泛，但目前市场上的相关制剂产品存在贮存时间短、活性不高、防效差、对紫外线敏感等缺点。其中，改善枯草芽孢杆菌的抗逆性尤其是抗紫外线性能是其制剂研究的重要课题。
海洋棘孢木霉HG1作为防治植物病害最有效的生防因子，具有抗逆性强、生长速度快、孢子存活期长、对病原菌具有寄生作用、促进植物生长和土壤修复的重要功能。已有研究表明，枯草芽孢杆菌和海洋棘孢木霉HG1联合使用可以发挥两种不同菌剂的优势，利用枯草芽孢杆菌的自身代谢活性物质和海洋棘孢木霉HG1的占位优势等提高防治效果和微生态改善。
丝素蛋白作为蚕丝的重要组成部分，是一种低密度的结构蛋白、核心结构域无规则卷曲，使其强度坚韧。
多巴胺(Dopamine，DA)是一种生物神经递质，结构上有儿茶酚基与氨基，可以在固体表面自氧化聚合形成聚多巴胺涂层，聚多巴胺涂层上带有大量的酚羟基和氨基或亚胺基，增强了对大部分材料表面(尤其是光滑表面)的粘附性能，与细胞、蛋白具有良好的结合能力及生物相容性，因此多巴胺在材料表面改性、环境治理、药物传递、生物医学等方面都有广泛应用。
因此，如何提供一种抗紫外线的微生物菌剂是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种抗紫外线的微生物菌剂及应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种抗紫外线的微生物菌剂，包括枯草芽孢杆菌微胶囊和海洋棘孢木霉HG1；枯草芽孢杆菌微胶囊包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCC No.2843；海洋棘孢木霉HG1，保藏编号为CGMCC NO.19276；枯草芽孢杆菌微胶囊与海洋棘孢木霉HG1的质量比为4:1～9:1。
优选的：枯草芽孢杆菌微胶囊与海洋棘孢木霉HG1的质量比为9:1。
优选的：枯草芽孢杆菌微胶囊的制备方法包括如下步骤：
1)将枯草芽孢杆菌和丝素蛋白加入到Tris/HCl缓冲溶液中，充分混合均匀，得到菌悬液；
2)将盐酸多巴胺加入到步骤(1)得到的菌悬液中，25～30℃条件下避光有氧搅拌一定时间，使盐酸多巴胺与丝素蛋白交联聚合成微胶囊；
3)离心分离微胶囊，用Tris/HCl缓冲溶液和去离子水洗涤冲洗干净，在60～70℃真空干燥24h，即得枯草芽孢杆菌的微胶囊。
优选的：步骤1)中，枯草芽孢杆菌在菌悬液中的含量为108～1010cfu/mL。
优选的：步骤1)中，丝素蛋白在菌悬液中的浓度为10～20g/L，Tris/HCl缓冲溶液(菌悬液)的pH为8.0～9.0。
优选的：步骤2)中，盐酸多巴胺在菌悬液中的浓度为1～2g/L，搅拌时间为10～12h。
优选的：海洋棘孢木霉HG1浓度为108～1010cfu/g。
优选的：加入辅料，制备成水分散粒剂。
本发明还提供了一种抗紫外线的微生物菌剂在防治作物病害中的应用。
优选的：防治作物病害：防治番茄灰霉病、烟草黑胫病。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种抗紫外线的微生物菌剂及应用，相较于现有技术，本发明具有以下优点：
1.本发明选用相容性好的丝素蛋白和多巴胺材料，通过微胶囊化制备枯草芽孢杆菌菌剂，反应条件温和，对菌体损伤小，而且改善了其抗紫外性能，紫外照射处理30min存活率为82.22％，60min后的存活率为31.51％，而对照组60min的存活率仅为0.64％。
2.本发明将枯草芽孢杆菌菌剂与海洋棘孢木霉HG1(海洋棘孢木霉HG1)进一步组合制备生物菌剂，利用芽孢杆菌自身分泌的活性物质和海洋棘孢木霉HG1的占位效应，提高了对植物病害的抑菌效果，对番茄灰霉病菌和烟草黑胫病菌的抑菌率均达到70％以上，优于单个生防菌的抑菌效果，而且经紫外照射处理的复合菌剂对两种病原菌的抑菌率仍然保持在60％以上，远高于没有微胶囊化处理的对照组。
3.本发明的复合菌剂水分散粒剂对番茄灰霉病的防治效果达到76.27％，对烟草黑胫病的防治效果达到70.06％，均优于单个生防菌剂的防治效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的枯草芽孢杆菌与实施例1制备的枯草芽孢杆菌剂经紫外照射处理后的涂板后形成菌落数的显微照片及存活率变化图，其中，CK为未包埋的枯草芽孢杆菌，SP为枯草芽孢杆菌微胶囊菌剂。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种抗紫外线的微生物菌剂及应用。
实施例中的微生物材料枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCCNo.2843，同专利CN201110093415.4中保藏的微生物；海洋棘孢木霉HG1，保藏编号为CGMCCNO.19276，同专利CN202010349559.0中保藏的微生物。均由发明人自行采集获得。
丝素蛋白购自西安全奥生物科技有限公司。
实施例1
枯草芽孢杆菌微胶囊的制备：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，保藏编号为CGMCCNo.2843与灭菌丝素蛋白溶液加入到Tris/HCl缓冲溶液(pH＝8.5)中，充分混合均匀，得到菌悬液，其中枯草芽孢杆菌的浓度为1010cfu/mL，丝素蛋白的浓度为15g/L。将盐酸多巴胺加入到上述菌悬液中，保持盐酸多巴胺的浓度为2g/L，25-30℃条件下避光有氧条件下，400r/min搅拌12h，使多巴胺与丝素蛋白交联聚合成微胶囊，分离收集微胶囊，用Tris/HCl缓冲溶液和去离子水洗涤冲洗干净，即得枯草芽孢杆菌的微胶囊。
取所制备的枯草芽孢杆菌微胶囊和未包埋的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，保藏编号为CGMCCNo.2843分别平铺于无菌的培养皿中，距离紫外灯(30W)20cm下照射30min、60min，将经照射后的试验品在PCA培养基上稀释培养，观察菌落数，计算存活率，可以看出，微胶囊化的枯草芽孢杆菌的抗紫外线性能得到了良好的改善，照射处理60min后，存活率仍然达到31.51％，而对照枯草芽孢杆菌的存活率接近于零。
实施例2
枯草芽孢杆菌微胶囊与海洋棘孢木霉HG1不同组合的抑菌结果
选用番茄灰霉病菌、烟草黑胫病菌为供试菌(均由青岛农业大学提供)。在保证总体活菌数量一致的前提下，分别制备的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCC No.2843、枯草芽孢杆菌微胶囊和海洋棘孢木霉HG1的组合，保藏编号为CGMCCNO.19276(具体组合见表1)，其中海洋棘孢木霉HG1的含菌量为108～1010cfu/g，对不同组合分别设置正常处理和紫外处理30min，测定组合对以上供试菌的抑菌活性。
表1不同组合复合菌配方
Figure BDA0003220489800000051
对照组1：只含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCCNo.2843；
对照组2：只含有海洋棘孢木霉HG1，保藏编号为CGMCC NO.19276。
对照组1～2的活菌数量与组合1～4的活菌总数相同。
采用平板对峙法，测定不同组合复合菌和单一生防菌的对照组对番茄灰霉病菌和烟草黑胫病菌的抑菌效果。
具体为：首先将供试病原菌在PDA平板上活化，长满后在菌落边沿区域用打孔器制成菌饼转接至PDA平板中央，再将正常处理或紫外处理的不同组合的复合菌及对照组生防菌在距病原菌菌饼相同距离处接种，每皿接种四个供试菌，同时设空白对照即不接任何生防菌株的病原菌PDA平板。每个处理设置三次重复。以病原菌的培养条件培养一定时间后，测定病原菌的菌落生长量，计算抑菌率。
计算公式如下：
抑菌率(％)＝(空白对照菌落直径-对峙培养菌落直径)/空白对照菌落直径×100％。
具体结果见表2。
表2不同复合菌组合对病原菌的抑制效果
Figure BDA0003220489800000052
Figure BDA0003220489800000061
表2结果显示，不同组合的复合菌对番茄灰霉病菌的抑菌效果优于单个生防菌，抑制率均达到75％以上，经微胶囊化处理的枯草芽孢杆菌与海洋棘孢木霉HG1的组合与未微囊化处理的组合对番茄灰霉病菌的抑制率差异不明显，表明微囊化处理没有影响生防菌的抑菌活性。当微胶囊化处理的枯草芽孢杆菌菌剂与木霉菌二者质量比例为9:1时，抑菌效果最佳，抑菌率达到83.24％。所有组合经紫外处理后抑菌率均下降，但未微胶囊化的枯草芽孢杆菌与海洋棘孢木霉HG1的组合下降幅度较大，抑菌率均在50％以下，而微囊化的枯草芽孢杆菌与海洋棘孢木霉HG1的组合的抑菌率仍然保持在60％以上。
不同组合对烟草黑胫病菌的抑制效果也优于单个生防菌，其中经微胶囊化的枯草芽孢杆菌与海洋棘孢木霉HG1的质量比例为9:1时抑菌效果最佳，达到81.64％。经紫外照射处理后所有组合对烟草黑胫病均的抑制效果均下降，但微囊化处理的枯草芽孢杆菌与海洋棘孢木霉HG1的组合的抑菌率仍然保持在60％以上，表现出良好的抑制效果，其中组合1的防抑菌率最大，达到65.15％，而未微囊化处理的枯草芽孢杆菌与木霉菌的组合的抑菌活性均降低到50％以下。
实施例3
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCC No.2843与海洋棘孢木霉HG1水分散粒剂的制备
本发明的微生物复合菌可以根据以上复配的最优配方组合1和对照，采用已知的方法进一步制备成适合农业使用的水分散粒剂。配方中的百分比均为质量百分比。
表3是抗紫外性能的枯草芽孢杆菌菌剂与海洋棘孢木霉HG1组合的制剂实施例与对照。
表3不同菌剂的水分散粒剂的配方
Figure BDA0003220489800000071
注：以上所用的枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌微胶囊、海洋棘孢木霉HG1中的有效活菌的总数均为1010CFU/g。
对番茄灰霉病和烟草黑胫病的防治效果
将上述的水分散粒剂在田间分别进行防治番茄灰霉病和烟草黑胫病的药效实验，每间隔7天采用喷雾方式施药一次，总共施药2次，最后一次间隔7天检查结果。结果见表4和表5。
由表4中可以看出，微胶囊化的枯草芽孢杆菌与海洋棘孢木霉HG1复合的水分散粒剂对番茄灰霉病防治效果优于未微胶囊化的枯草芽孢杆菌与海洋棘孢木霉HG1的组合及单生防菌的效果，最高防效达到76.27％。从表5也可以看出相同的结果。
表4不同复合菌剂水分散粒剂对番茄灰霉病的防治效果(21d)
处理 稀释倍数 病情指数 防治效果(％)
CK - (88.42±1.98)a -
实施例3 500 (20.96±0.89)d 76.27
对照组3 500 (27.68±1.34)c 68.69
对照组4 500 (32.21±0.85)b 63.57
对照组5 500 (33.15±1.21)b 62.50
注：同行数据后，不同小写字母代表处理间P<0.05水平差异显著。
表5不同复合菌剂水分散粒剂对烟草黑胫病的防治效果(21d)
处理 稀释倍数 病情指数 防治效果
CK - (84.65±2.31)a -
实施例3 400 (25.34±0.89)c 70.06
对照组3 400 (31.84±0.91)c 62.39
对照组4 400 (36.82±1.35)b 56.50
对照组5 400 (34.65±1.13)b 59.06
注：同行数据后，不同小写字母代表处理间P<0.05水平差异显著。
本发明通过选择与微生物菌具有良好相容性的材料丝素蛋白包埋枯草芽孢杆菌，再利用多巴胺聚合作用制备枯草芽孢杆菌微胶囊，提高了其对紫外线的稳定性，然后进一步与海洋棘孢木霉HG1优化组合确定最优比例，并制备了环境友好型制剂水分散粒剂，田间药效表明抗紫外性能的枯草芽孢杆菌菌剂与海洋棘孢木霉HG1组合的水分散粒剂具有优于其他对比药剂的防治效果。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种抗紫外线的微生物菌剂，其特征在于，包括枯草芽孢杆菌微胶囊和海洋棘孢木霉HG1；所述枯草芽孢杆菌微胶囊包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCCNo.2843；所述海洋棘孢木霉HG1，保藏编号为CGMCCNO.19276；所述枯草芽孢杆菌微胶囊与所述海洋棘孢木霉HG1的质量比为4:1～9:1。
2.根据权利要求1所述的一种抗紫外线的微生物菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌微胶囊与所述海洋棘孢木霉HG1的质量比为9:1。
3.根据权利要求1所述的一种抗紫外线的微生物菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌微胶囊的制备方法包括如下步骤：
1)将枯草芽孢杆菌和丝素蛋白加入到Tris/HCl缓冲溶液中，充分混合均匀，得到菌悬液；
2)将盐酸多巴胺加入到步骤(1)得到的菌悬液中，25～30℃条件下避光有氧搅拌一定时间，使盐酸多巴胺与丝素蛋白交联聚合成微胶囊；
3)离心分离微胶囊，用Tris/HCl缓冲溶液和去离子水洗涤冲洗干净，在60～70℃真空干燥24h，即得枯草芽孢杆菌的微胶囊。
4.根据权利要求3所述的一种抗紫外线的微生物菌剂，其特征在于，步骤1)中，所述枯草芽孢杆菌在菌悬液中的含量为108～1010cfu/mL。
5.根据权利要求3所述的一种抗紫外线的微生物菌剂，其特征在于，步骤1)中，所述丝素蛋白在菌悬液中的浓度为10～20g/L，所述Tris/HCl缓冲溶液(菌悬液)的pH为8.0～9.0。
6.根据权利要求3所述的一种抗紫外线的微生物菌剂，其特征在于，步骤2)中，所述盐酸多巴胺在菌悬液中的浓度为1～2g/L，所述搅拌时间为10～12h。
7.根据权利要求1所述的一种抗紫外线的微生物菌剂，其特征在于，所述海洋棘孢木霉HG1浓度为108～1010cfu/g。
8.根据权利要求1～7任一所述的一种抗紫外线的微生物菌剂，其特征在于，加入辅料，制备成水分散粒剂。
9.权利要求1～8任一所述的一种抗紫外线的微生物菌剂在防治作物病害中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述防治作物病害：防治番茄灰霉病、烟草黑胫病。
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