CN106939302B

CN106939302B - Etec噬菌体、基于该噬菌体的生物消毒剂及其应用方法

Info

Publication number: CN106939302B
Application number: CN201710149411.0A
Authority: CN
Inventors: 王丽丽; 付丽娜; 徐永平; 李晓宇; 渠坤丽; 张楠
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2017-03-14
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2037-03-14
Also published as: CN106939302A

Abstract

本发明提供了一种ETEC噬菌体PES‑1，保藏号为：CGMCC No.13382；本发明还提供了基于该噬菌体的生物消毒剂，具体组成包括ETEC噬菌体PES‑1号菌液、十二烷基磺酸钠、SM缓冲液及0.1M蔗糖；该生物消毒剂的应用方法为，将效价≥1×10¹⁰pfu/mL的所述生物消毒剂以100ml/m³的剂量喷洒于养殖环境中。本发明所涉及的裂解性噬菌体PES‑1对ETEC具有广谱杀菌作用，特异性强，其辅料中的SM缓冲液和蔗糖可以保护噬菌体效价的稳定性，这有利于该消毒剂的长期使用和保存；对养殖环境净化效果好，安全无毒。

Description

ETEC噬菌体、基于该噬菌体的生物消毒剂及其应用方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及一株能够裂解ETEC的噬菌体PES-1、基于该噬菌体的生物消毒剂及其制备方法。

背景技术

在发展中国家和不发达国家，主要的食源性致病菌广泛流行，对人类健康构成重大威胁，尤其是发展中国家4岁以下的儿童，每年腹泻人数大约14亿，其中约3亿是由大肠杆菌引起的。大肠杆菌即肠埃希氏菌（Escherichia coli，E. coli），广泛分布在自然界中，是人和动物肠道中常见的一种细菌。1885年由德国科学家Escherich首次从婴儿腹泻物中分离出来。国内外研究人员根据不同的致病机理将致泻性大肠杆菌主要分为6类：产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)、肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli，EPEC)、肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhage E.coli， EHEC)、肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E. coli，EIEC)、肠黏附性大肠杆菌(Enteroadhesive E. coli，EAEC)和扩散黏附性大肠杆菌(Diffusely adherent E. coli，DAEC)。各国针对致病性大肠杆菌引起疾病的治疗方法主要是使用各种抗生素类药物。然而，近年来，从水果、蔬菜、肉类中分离得到的抗性致病菌已经成为农业、人类、兽医学中的主要问题。

产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)是引起仔猪腹泻的最主要致病菌之一。肠产毒素性大肠杆菌是致病性大肠杆菌中的一种，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌属(Escherichia)。菌体大小为(0.4-0.7)×(1.0-3.0) μm。大多周身有鞭毛，能运动，某些菌株有菌毛，无芽孢，兼性厌氧，在普通培养基上生长良好，菌落直径2-3 mm。腹泻的致病过程为细菌通过菌毛黏附小肠上皮细胞，大量增殖后产生肠毒素，引起一系列的级联反应，发生腹泻。ETEC致病因子主要是肠毒素和菌毛，肠毒素一般只有耐热性肠毒素和不耐热性肠毒素两种，但是菌毛种类较多，随地区不同而改变。ETEC性腹泻发病症状为仔猪粪便稀度高且呈黄色，肛门有粪便残留甚至红肿；普遍脱水严重、体重下降；皮毛稀疏凌乱、皮肤涩白没有红润光泽。初染腹泻仔猪体温一般不会升高，精神尚好，有食欲，如不及时治疗，病情可逐渐加重，精神萎靡、拱背、怕冷，严重时粪便失禁，发病3-5 d后死亡。由产肠毒素性大肠杆菌引起的仔猪黄痢和白痢危害性极大，已使养猪业蒙受巨大经济损失。常用于防治此病的抗生素因耐药与残留问题而备受争议，寻找抗生素替代品尤为必要。噬菌体作为一种新型“抗菌剂”已得到各国科学家的认可。

噬菌体是一种感染细菌的病毒，广泛分布在淡水、海洋环境、土壤表层、食物、粪便、人和动物以及其他环境。噬菌体对真核生物细胞（例如动物或植物）无害，并且很少引起人类的副作用。噬菌体是裂解性或溶源性的，但只有被证明安全和具有广泛宿主范围的裂解性噬菌体可以用于食品的生物防控。噬菌体及其内溶素可以以几种方式掺入食品系统中，例如喷雾、浸渍、固定、单独或制成“噬菌体鸡尾酒”使用。使用噬菌体的一个优点是可以选择性地控制细菌群体，而不干扰天然微生物群，并且对食物的物理化学和感官性质没有显著的影响。大肠杆菌作为一种致病性较高的细菌，用噬菌体作为其抗菌剂具有天然、安全、高效、无残留等优点，具有广阔的发展前景，因此受到越来越广泛的关注。

发明内容

本发明的目的在于提供一种ETEC噬菌体，基于该噬菌体制备一种新型生物消毒剂，以控制导致仔猪腹泻的主要病原菌产肠毒素性大肠杆菌，用于防治由ETEC引发的仔猪腹泻，同时净化养殖环境、设施。

为了达到上述目的，本发明提供了一种ETEC噬菌体，该噬菌体PES-1于2016年12月08日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为：CGMCCNo.13382，分类命名为产肠毒素性大肠杆菌裂解性噬菌体。

本发明所述ETEC噬菌体PES-1号用于防治产肠毒素性大肠杆菌。本发明ETEC噬菌体PES-1可以裂解多株ETEC。

本发明还提供了一种基于上述ETEC噬菌体PES-1号的生物消毒剂，有效成分为ETEC噬菌体PES-1号。

优选方式下，上述生物消毒剂按体积百分比计，具体组成为：ETEC噬菌体PES-1号菌液60％-70％，0.003M十二烷基磺酸钠（SDS）10％-20％，SM 缓冲液5％-10％，0.1M蔗糖5％-10％；

所述生物消毒剂中ETEC噬菌体PES-1号总噬菌体有效量≥10¹⁰ PFU/mL。

所述的消毒剂辅料为：SDS作为一种助溶剂，为市面上常用的阴离子表面活性剂；SM缓冲液作为一种噬菌体稳定剂，可以在保存过程中维持噬菌体效价，配方：每50 mL 1MTris-HCl（pH7.5）中加入明胶0.1g，MgSO₄·7H₂O ₂ g，NaCl 5.8 g；蔗糖为市面上常见的二糖，和SM缓冲液联合使用，可以更好地稳定噬菌体效价，当SM 缓冲液与0.1M蔗糖的体积比为1:1时效果最优。

本发明生物消毒剂可以在养殖环境中应用，从而降低养殖环境中仔猪的发病率，具体应用方法为，将效价≥1×10¹⁰PFU/mL的所述生物消毒剂以100ml/m³的剂量喷洒于养殖环境中，以杀灭养殖环境中的ETEC。

与现有产品相比，本发明具有的优点是：

1、本发明所涉及的裂解性噬菌体PES-1在养殖场的污水和粪便中分离获得，且对ETEC具有广谱杀菌作用，特异性强，其辅料中的SM缓冲液和蔗糖可以保护噬菌体效价的稳定性，这有利于该消毒剂的长期使用和保存;

2、养殖场常用化学消毒剂的种类包括：含氯消毒剂，过氧化物类消毒剂，醛类和醇类消毒剂，含碘消毒剂和酚类消毒剂，化学消毒剂氧化能力强，高浓度可刺激、损害皮肤黏膜，腐蚀物品。本发明的生物消毒剂对环境和人安全无毒，且克服了化学消毒剂的腐蚀性和刺激性气味。

保藏说明

本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物（株）为PES-1，分类命名为产肠毒素性大肠杆菌裂解性噬菌体，于2016年12月8日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏编号CGMCC No.13382。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1.产肠毒素性大肠杆菌 LT凝胶电泳图

图2.产肠毒素性大肠杆菌 ST凝胶电泳图

图3. PES-1一步生长曲线

图4.噬菌体PES-1体外抑菌实验

图5.保存一个月后噬菌体PES-1效价变化

图6.噬菌体PES-1电镜图片

具体实施方式

以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。

实施例1产肠毒素性大肠杆菌的分离

在不同超市、菜市场采集猪肉样品，在养猪场采集猪粪样品，猪肉样品首先在脑心浸出液肉汤(brain heart infusion broth，BHI)中37℃培养3h，随后在双倍磷酸胰蛋白胨肉汤(double-strength Tryptone phosphate，TP)中44℃培养20h；粪便样品在42℃的BHI中培养20 h。取液体培养液，稀释后涂布于麦康凯平板培养基上生长12h后，红色菌落形态呈表面隆起、边缘整齐、光滑、圆润等特征。依据麦康凯固体选择培养基的化学特性，初步判断红色菌落为大肠杆菌，挑取疑似大肠杆菌菌落纯化后划线培养，挑取的红色单菌落经纯培养后，在麦康凯平板上依然呈现出大肠杆菌的典型特征，样品保存留作后续实验。鉴定ETEC主要测定大肠杆菌肠毒素，肠毒素有耐热性肠毒素( heat-stable enterotoxin，ST)和不耐热性肠毒素( heat -labile enterotoxin，LT) 两种，二者单独或共同存在于所有ETEC中。因此，设计并合成两种肠毒素基因，进行特异性PCR反应，能够扩增出目的条带的即为目标ETEC单菌落，如图1、2所示。

实施例2产肠毒素性大肠杆菌噬菌体的分离、扩增及纯化

1. 水样的处理

取养殖场污水，加入CaCl₂至终浓度为1mol/L，8000 rpm离心10min，去除污水中的沉淀颗粒。取上清用0.22μm滤膜滤过除菌。取滤液20ml，与20ml²×LB培养基混合，按1％的接种量，接种400μl的ETEC，37℃富集培养12 h。取5ml的上述菌液，4℃，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜滤过除菌，即得噬菌体原液。

2. 噬菌体的分离

采用双层琼脂平板法分离噬菌体，具体方法如下：将噬菌体原液10倍梯度稀释，分别取300ul稀释液与300ul相应的对数期ETEC混合，37℃孵育15min，与5ml 55℃保温的完全熔化上层琼脂(琼脂浓度为0.5％)混合，均匀铺在下层琼脂(琼脂浓度1.5％)平皿上，冷却15min后倒置37℃过夜培养。次日，观察噬菌斑的出现情况。挑取单个噬菌斑，重复3次双层琼脂平板实验，得到单一的噬菌体。再挑取单个噬菌斑溶解在1ml的SM缓冲液中。

3. 噬菌体的扩增

挑取ETEC单个菌落，接种于50ml液体LB培养基中，37℃、150 rpm振荡培养至对数生长期早期；加入1ml含有噬菌斑的SM缓冲液，37℃、150rpm振荡培养待菌液澄清后，4℃、5000rpm离心10min，取上清。反复扩增，使用0.22μm滤膜过滤，得到所要体积的噬菌体裂解液。

4. 噬菌体的纯化

向噬菌体裂解液中加入NaCl，终浓度为1mol/L，冰浴1h后，4℃、8000rpm 离心10min，沉淀菌体碎片，收集上清；根据上清的体积，加入PEG8000，终浓度为10％ (m/v)，4℃、10000g离心10min，去上清，用等体积SM缓冲液溶解沉淀的噬菌体，即得到初步纯化的噬菌体裂解液。

实施例3噬菌体的生物学特性

1.噬菌体的电镜观察

取超速离心提纯的噬菌体悬液滴于覆有聚乙烯甲醛膜的铜网上少许，以 2％磷钨酸 (pH7.0) 染色5-10min，将铜网放于干燥滤纸上，自然干燥。然后用日立JEM2100C型电镜观察，如图6所示。

2. 噬菌体的一步生长曲线

加入噬菌体及对数早期的宿主菌使MOI＝0.1，37℃孵育15min 后，8000 rpm离心10min，弃上清，LB培养基悬浮菌体，再次离心、悬浮沉淀，洗涤2次后，用5ml预热的LB培养基混悬沉淀并充分混匀，迅速置于37℃摇床(150rpm)中培养，开始计时，于0时刻和每隔10min取样100μl，8000rpm离心5min，吸取上清，10倍梯度稀释测定噬菌体滴度。各时间点均作双份复管取平均值，同时以不加噬菌体的宿主菌和不加宿主菌的噬菌体为对照，实验重复3次，如图3所示。

实验结果表明，噬菌体PES-1的潜伏期为20 min，裂解期为40 min，裂解量为267PFU/infected cell。

申请人在养猪场分离得到9株ETEC，在养殖场污水中分离到4株ETEC噬菌体，其中的PES-1对9株噬菌体都有裂解作用，因此选作此生物消毒剂的主要成分，于2016年12月08日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为：CGMCC No.13382，分类命名为产肠毒素性大肠杆菌裂解性噬菌体。

实施例4 噬菌体PES-1的噬菌谱分析

分别取大肠杆菌9株，铜绿假单胞菌1株，副溶血性弧菌1株，金黄色葡萄球菌1株，无乳链球菌1株(菌株来源见表1)，将菌株复苏，培养，取培养至对数期的菌液100μl 均匀涂布于LB平板，待其干燥后分别取10μl实施例2制备的噬菌体PES-1分别点样于菌苔表面，并以生理盐水点样作对照，每个样品做3个重复，待液滴干燥后倒置于37℃或28℃培养箱，培养12～16 h于第二天观察效果。PES-1能够裂解养殖场分离到的多株ETEC，但是不能裂解其它属的细菌。说明PES-1既有针对ETEC的广谱性，又有针对不同属细菌的特异性。

结果如表1所示：

表1.噬菌体PES-1裂解谱

本发明噬菌体PES-1是长尾噬菌体，相比于其他ETEC噬菌体的裂解谱更广。

实施例5噬菌体消毒剂的制备

将本实验室保藏的纯化后的噬菌体PES-1进行活化，使其浓度≥10¹⁰PFU/mL，然后按照以下体积比加入各种辅料进行混合，混合均匀，配方组成如下：

（1）ETEC噬菌体PES-1 60％；

十二烷基磺酸钠（SDS）溶液20％；

SM 缓冲液10％；

0.1M蔗糖10％.

（2）ETEC噬菌体PES-1 70％；

十二烷基磺酸钠（SDS）溶液20％；

SM 缓冲液5％；

0.1M蔗糖5％.

实施例6消毒剂主要成分PES-1的体外抑菌试验

取5瓶装有100 mL LB液体培养基的锥形瓶，以1%的接种量接种ETEC，37℃、150rpm培养至对数前期（OD600在0.3左右）。其中三瓶按照感染复数为0.1、1、10的比例加入噬菌体，另外两瓶分别加入等体积的PBS和硫酸链霉素作为阴性对照与阳性对照。混匀后在37℃、150 rpm条件下培养，每隔1 h取样观察混合液在OD600条件下的吸光度。检测结果如图4所示，从实验结果可以看出，噬菌体在不同MOI条件下，都可以将菌液OD600的值控制在0.5以下，且与硫酸链霉素的抑菌效果相当。

实施例7噬菌体消毒剂对养猪场环境的消毒效果

在养殖场随机选取10个点（每个点均为1m²×20cm）作为试验区，并做标记，将9株浓度为1×10⁸cfu/ml的产肠毒素性大肠杆菌的混合液均匀喷洒于养殖场试验区，然后以实施例4获得的噬菌体消毒剂(效价为1×1010pfu/mL)以100ml/m³的剂量对试验区喷洒消毒，2h后检测产肠毒素性大肠杆菌残留，发现其中2个试验区仍有产肠毒素性大肠杆菌残留，4h后检测产肠毒素性大肠杆菌残留，10个试验区均未检测到产肠毒素性大肠杆菌。

说明该消毒剂可以有效杀灭养殖环境中的产肠毒素性大肠杆菌。

实施例8 SM缓冲液和蔗糖对噬菌体效价的保护作用

将噬菌体原液分为四组，每组100ml，测定第一组的效价为1×10¹⁰PFU/mL作为对照，其余三组分别加入50ml PBS缓冲液，50ml SM缓冲液，50ml SM缓冲液+0.1M蔗糖（两者比例1:1），将后三组噬菌体4℃放置一个月后，分别测定其效价，检测结果分别为1×10⁷ PFU/mL，1×10⁸ PFU/mL，1×10⁹ PFU/mL，如图5所示。

可以得出，50ml SM缓冲液+0.1M蔗糖（两者比例1:1）对噬菌体效价的保护作用最好。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种ETEC噬菌体，其特征在于，该噬菌体PES-1于2016年12月08日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为：CGMCC No.13382，分类命名为产肠毒素性大肠杆菌裂解性噬菌体。

2.一种基于权利要求1所述ETEC噬菌体的生物消毒剂，其特征在于，有效成分为ETEC噬菌体PES-1号；

按体积百分比计，具体组成为：ETEC噬菌体PES-1号菌液60％-70％，0.003M十二烷基磺酸钠10％-20％，SM缓冲液5％-10％，0.1M蔗糖5％-10％；

所述生物消毒剂中ETEC噬菌体PES-1号总噬菌体有效量≥10¹⁰PFU/mL；将效价≥1×10¹⁰PFU/mL的所述生物消毒剂以100ml/m³的剂量喷洒于养殖环境中。