CN101724607A - 一种产肠毒素性大肠杆菌etec-k99的噬菌体ek99-c及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种噬菌体，特别涉及一种产肠毒素性大肠杆菌K99(ETEC-K99)的强裂解性噬菌体EK99-C；本发明公开了一种分离获得的产肠毒素性大肠杆菌K99的强裂解性噬菌体，及其用于幼畜腹泻治疗、细菌感染以及环境净化消毒方面的应用；所述分离获得的噬菌体(命名为：EK99-C)是对病原大肠杆菌K99菌株(ETEC-K99)具有强裂解活性的噬菌体单体，可以用作幼畜(猪、牛、羊)的K99菌株引起的动物腹泻治疗和畜舍养殖、屠宰等环境、器具上K99菌株的杀菌用途。本发明还提供了一种治疗动物腹泻和环境、器具消毒的新方法和新思路--生物防控技术。该噬菌体已经在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号：CCTCC NO：M209208。

Description

一种产肠毒素性大肠杆菌ETEC-K99的噬菌体EK99-C及其应用

发明领域

本发明涉及一种噬菌体，特别涉及一种产肠毒素性大肠杆菌K99(ETEC-K99)的强裂解性噬菌体EK99-C，其分离物及其单一或混合使用在治疗幼畜腹泻、抗细菌感染以及环境净化杀菌方面的应用。

发明背景

产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)是幼龄动物(仔猪、犊牛、羔羊等)腹泻中常见而且重要的致病菌之一，此类大肠杆菌能借助于其所产生的菌毛抗原粘附于动物的小肠黏膜上，定居并产生肠毒素，从而呈现出致病作用。大肠杆菌致病力主要由黏附素性菌毛和肠毒素两类毒力因子构成。目前在各种动物中已发现并展开研究的大肠杆菌菌毛抗原主要有：K88(F4)、K99(F5)、987P(F6)、F41及F17等。在引起初生仔猪、羔羊和犊牛腹泻的肠毒素大肠杆菌中，K99是常见的粘附素，这些细菌表面纤毛能与小肠黏膜上皮细胞表面的特异性受体位点结合，使细菌吸附于肠黏膜表面并产生肠毒素，导致急性腹泻、脱水，最后衰竭死亡。

K99粘附素是Smith等1972年从腹泻犊牛和羔羊中分离到的，定居于牛、羊、猪小肠中后段，是导致幼畜腹泻的主要元凶：在新生仔猪大肠杆菌引起的腹泻中，由大肠杆菌-K99引起的占30％以上；在初生羔羊中导致腹泻发病率高达35％，死亡率47％左右；犊牛腹泻是在生后0～3天感染毒性大肠杆菌而发病，一旦发病，80％就会死亡。可见，肠毒素性大肠杆菌感染幼畜导致动物急性腹泻，造成幼畜成活率低，大大影响了我国动物养殖的经济效益。该腹泻在养殖场发病普遍、死亡率高，严重威胁了动物健康，阻碍了畜牧业的发展。每年此类疾病所带来的经济损失数以亿计，各养殖场为预防和治疗这些疾病，花费了大量的资金。

而治疗这类疾病最常用的方法是用抗生素治疗，但随着大量耐药菌的出现，抗生素对各种细菌的抑菌效果已达不到预期的要求。尽管疫苗的开发给了大肠杆菌病治疗新的希望，但效果不错的进口疫苗价格昂贵，且由于大肠杆菌血清型较多，不同血清型抗原性不同，菌株之间缺乏完全保护，不能针对所有猪场流行的致病血清型，疫苗的应用存在很多局限性。

因此，亟待研究开发一种新型的疗法和产品，以解决和应对细菌对抗生素耐药性问题，以控制细菌性感染疾病在动物间的感染和传播。

噬菌体作为一种新兴的治疗方法，已经越来越受到国内外科学家的关注，美国医疗机构在1999年的国际噬菌体会议上预测，在未来的3-5年内，美国医院将使用噬菌体制剂治疗抗生素无法控制的感染。

噬菌体是一类细菌依赖性病毒，可以吞噬、侵染细菌，并在菌体内繁殖使细菌裂解而杀灭细菌。其被发现于1个世纪以前，但随抗生素的发现，科学家几乎停滞了对噬菌体的研究。现今，随着细菌对抗生素抗药性和耐药菌株日益显现，抗生素的无效性日益明显，使得科学家又再度萌发了利用噬菌体来消灭病原菌的设想。

噬菌体在溶解其特异性宿主细菌时十分有效，且杀死细菌的机制与抗生素不同，不易产生耐药性和残留，十分适合成为理想的“新作用模型”的新型抗菌剂，因此，各国研究机构都将其作为一种新型、天然、安全的防治细菌性疾病的生物杀菌剂而进行研究。

美国4家公司正试图发展噬菌体抗菌疗法，他们正在研制针对一些重要的病原菌，如耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)和食物传播的病原菌(沙门菌)的噬菌体(或噬菌体混合物)。Intralytix公司目前正在进行针对VRE和MRSA的项目，他们研究的目标是噬菌体混合物，这种方法能减少耐药。通过针对多个菌株和应用杀菌机理不同的多种噬菌体，治疗可能产生耐药病原体。Biophage公司的研究目的也是人类健康应用，但近期研究是针对农业。公司处于后期市场前研究的两种制品是抗大肠杆菌和沙门菌制品，分别应用于猪和家禽。这些制品已完成动物模型试验，所用的噬菌体源于加拿大魁北克农场。公司正在收集加拿大和美国各地的噬菌体样本，这能使制品对更多的菌株有效。对于人类治疗公司已收集了大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌和假单胞菌的特异性噬菌体。PhageTherapeutics公司的3个项目都是应用于人类健康，为针对葡萄球菌、绿脓杆菌和结核杆菌的制品。抗葡萄球菌制品已配制完成，其制造工艺已获美国食品和药物管理局批准。Exponential公司已进行抗VRE噬菌体制品的临床试验，I期研究已于去年完成，制品能为健康志愿者很好耐受。加拿大Guelph大学病理学系的Carlton Gyles教授和加拿大自然科学与工程研究委员会以及蒙特利尔大学的JohFairbrother教授2005年也开展了猪大肠杆菌病的噬菌体治疗方法的研究。日本广岛大学鱼病实验室2000年分离到变形假单胞菌的两株噬菌体PPpW-3和PPpW-4。用变形假单胞菌感染鱼苗后，再口服噬菌体PPpW-3和PPpW-4进行治疗，2周后，对照组鱼的死亡数为65.0％，实验组为22.5％，并且池搪中的变形假单胞菌数明显降低。2002年日本学者ToshihiroNakai还报道了噬菌体治疗养殖鲱鱼加氏乳球菌引起的疾病具有良好效果。

美国专利5,688,501(Merril，et al.)公开用特定细菌的特异性裂解或非裂解噬菌体治疗动物体内由细菌导致的感染性疾病的方法。美国专利4,957,686(Norris)公开改善口腔卫生的程序，它包含将具有容易粘附唾液腺膜特性的寄生于细菌的噬菌体引入口腔。

噬菌体有效性也在大肠杆菌(Smith，H.W.，a.H.，M.B.J.ofGen.Microbiol.，1982，128((Pt 2))：p.307-318)，伤寒沙门氏菌(Merril，C.R.，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93(8)：p.3188-3192上)和金黄色葡萄球菌(ShigenobuMatsuzaki，et al，J.of Infec.Dis.2003，187：p.613-624)感染的相应动物模型研究中得到了证实。

2006年，美国食品和药物管理局(FDA)首次批准将病毒用作食品添加剂。这种产品包含6种噬菌体病毒，主要用于杀灭肉制品中的李氏杆菌。

噬菌体用于治疗感染性疾病的原理是基于其自身的生物学特性而发展出来的。噬菌体有两种生长方式：溶原性生长及裂解性生长。溶原性生长即是指噬菌体DNA进入宿主菌细胞后，与宿主菌细胞的DNA进行整合，并随着宿主菌的分裂而分裂，但并不导致宿主菌的死亡。而裂解性生长则是指噬菌体进入宿主菌细胞后，破坏宿主菌的DNA，并以之为原料合成自身的DNA，然后利用宿主细胞内的蛋白质合成蛋白质外壳，进而组装成一个完整的新的噬菌体。当宿主细胞内的噬菌体达到一定数量后，就会导致宿主菌裂解、死亡。其释放出来的噬菌体又可以继续感染周围的细菌，实现倍增效应，从而实现治疗细菌感染的目的。此外，噬菌体制剂吸附率高、潜伏期短、裂解量(即单个噬菌体感染细菌后裂解所释放出来的噬菌体数量)大、特异性强(噬菌体制剂一般只对宿主菌有损害，而对人体正常细胞及正常菌群无损害，不会导致二重感染)。因此，用噬菌体来治疗感染是一个很有前途的抗感染治疗新途径。当然，噬菌体对宿主菌损害的机制目前尚有争论，但这并不妨碍噬菌体制剂用于治疗的可行性。

发明内容

要解决的技术问题

本发明的目的在于：提供一种对产肠毒素大肠杆菌ETEC-K99有强裂解性的噬菌体EK99-C。

本发明的另一目的是：针对目前产肠毒素大肠杆菌引起的仔猪腹泻发病率高、用抗生素和疫苗等措施不能有效控制该病传播等问题，提供一种新的治疗产品和治疗手段，开发一种新的对ETEC-K99引起的仔猪、羔羊、犊牛的腹泻有显著治疗效果的单一或组合药物产品和治疗方法。该噬菌体EK99-C可以特异性的灭活ETEC-K99大肠杆菌，为工业化生产噬菌体杀菌剂提供噬菌体株来源。

本发明的再一目的是：提供所述的噬菌体在各种动物养殖畜舍、屠宰场等环境的净化消毒以及对相关器具表面的消毒处理的应用，以消除和防止ETEC-K99细菌的生长、繁殖及污染。

本发明还涉及用于选择如以上描述的对ETEC具有实质裂解潜力的噬菌体的分离制备方法。

技术方案

噬菌体EK99-C在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号：CCTCCNO：M209208，保藏日期为2009年9月23日。

本发明的噬菌体EK99-C(CCTCCNO：M209208)具有以下特征：

1.形态学特性

在电子显微镜下观察磷钨酸负染的噬菌体颗粒(图1)，该噬菌体具有呈正多面体的头部结构和细长柔软的尾部，头部直径约

尾部长约180nm。

2、培养学特性

本发明的噬菌体株在固体培养基上可以形成较大透亮空斑，周围无晕环，清晰可见，直径为2-3mm。

3.噬菌体基因组核酸类型鉴定

取纯化EK99-C噬菌体颗粒，用蛋白酶K消化噬菌体衣壳，释放出核酸，酚氯仿抽提，溶解定量后分别采用Dnase I、Rnase A和S1核酸酶以及限制性核酸内切酶BamHI酶切噬菌体基因组核酸，根据酶切图谱(图2)，认为该噬菌体核酸是双链DNA分子(dsDNA)。

根据国际病毒分类委员会2005年发表的《病毒分类-国际病毒分类委员会第八次报告》中对噬菌体的新分类方法，本发明获得的噬菌体EK99-C的形态学特征应属于I群尾病毒目长尾病毒科，命名为EK99-C。

噬菌体EK99-C的分离制备

本发明样品采自江苏省射阳景荣猪场污水，经双层滤纸过滤，3000rpm离心20min，再用0.22μm滤膜过滤上清。

取50ml过滤上清，加入2ml噬菌体宿主菌(K99)过夜培养物，再加入CaCl₂母液(已过0.22μm滤膜除菌)至终浓度1mM混匀后，加入20ml LB培养基，室温作用1h，再放置于37℃培养12～16h。次日，取上述培养物以14000rpm离心30min，取上清；14000rpm再次离心20min，取上清加入0.1％氯仿，形成噬菌体原液。

将普通营养琼脂平板分为2个区域：吸取宿主菌液0.1ml滴于普通营养琼脂平板正中央，将菌液均匀地涂开；待其晾干后，滴噬菌体原液0.05ml于其中一个区域，并将其涂布均匀；待自然晾干后，置于37℃温箱培养10h后，观察两个区域的变化。同时设立对照，对照中仅涂噬菌体原液，以鉴定噬菌体中是否含有宿主菌。

取噬菌体原液0.1ml，进行10倍稀释，取10²、10⁴和10⁶稀释液各0.1ml与过夜培养的宿主菌液0.1ml混匀，室温作用15min后，加入约5ml 0.7％LB培养基，混匀后迅速倾倒入LB培养基平板上层，摇匀平置5min，待其凝固，置于37℃温箱培养12h后观察，获得形成噬菌斑的双层平板。

噬菌体的纯化培养和扩增

在形成噬菌斑的双层平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，用接种针穿刺目的噬菌斑，将穿刺后接种针伸入3-5ml LB培养基中，重复3-5次后，加入噬菌体宿主菌液0.1ml，混匀，室温作用15min，37℃培养10～14h，14000rpm，4℃，离心20min，取上清，同时加入0.1ml氯仿，室温作用20min，无菌过滤(0.22μm)上清液；

取2ml新鲜培养的宿主菌，离心，0.4ml LB培养基重悬，加0.1ml噬菌体(以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1∶1、1∶10和1∶100的比例)。加麦芽糖(0.2％)，MgSO₄(10mM)，37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100ml LB液体培养基，其中含有麦芽糖(0.2％)，MgSO₄(10mM)，37℃摇震培养9-12h；加0.1ml氯仿，37℃继续摇震培养10-20min，获得裂解液。

将裂解液转移至离心管，离心8000rpm，去细菌碎片，取上清液；加RNase A、DNase I至1μg/ml，37℃温育30min；加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1h或4℃过夜；4℃离心10000rpm20min，去上清液；加2ml SM液，充分洗溶管壁及沉淀，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的PEG和细胞碎片，温和振荡30s；4℃，3000rpm离心15min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体，双层平板检测纯化噬菌体(见图1)。

纯化的噬菌体命名为EK99-C，于2009年9月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M209208，分类命名为产肠毒素性大肠杆菌K99(ETEC-K99)噬菌体EK99-C。

噬菌体EK99-C的应用，

1)将该噬菌体用于预防和治疗由ETEC-K99病原引起的仔猪、羔羊和犊牛等幼畜腹泻；其治疗方式包括喷雾、注射、口服和口腔涂抹；

2)将该噬菌体作为原料之一与其他噬菌体、抗生素或药学上可接受的载体或赋形剂等混合制备成药物，用于防治或治疗含ETEC-K99细菌在内的更广泛的细菌性感染和对环境或器皿中含ETEC-K99的净化消毒应用。

具体实施时，为补充该噬菌体的杀菌效果，可以与其他噬菌体分离物混合或与抗生素联合使用，用于防治或控制更广泛的细菌性感染和污染。

还可以将本发明所述的噬菌体作为原料之一与其他噬菌体、抗生素或载体如有机物、二硫苏糖醇、金属螯合剂、缓冲液、等一切药学上可接受的载体或赋形剂混合制备成药用产品，用于抑制ETEC-K99及更广泛细菌的生长、繁殖，预防和控制含ETEC-K99导致的污染和腹泻。

有益效果

1、本发明的优点是根据本发明选择的噬菌体或其制品对引起仔猪、羔羊、犊牛等幼畜由ETEC-K99病原引起的腹泻，效果明显，特异性强；且所述的噬菌体制品是无毒的，可以安全地用于幼畜腹泻的预防和治疗。

2、本发明的另一优点是提供了一种有助于消毒、清洁和净化畜舍环境中工作表面以及地面、墙壁等等的活性消毒用品，能够防止ETEC的污染和过度生长。

3、本发明中的噬菌体EK99-C可以单独或混合使用，可作为一种潜在药物治疗由产肠毒性大肠杆菌引起的细菌感染。

4、本发明中噬菌体可以和其他噬菌体联合使用，以获得较宽的噬菌范围。本发明中噬菌体可以和其他抗菌剂混合使用，在获得抗菌广谱性的同时，对大肠杆菌特异性杀灭。能与该发明中噬菌体联合使用的抗菌剂包括但不限于抗生素和化学抗菌剂。

5、本发明中的噬菌体可应用于工业生产，可由宿主菌大肠杆菌特异性扩增，可应用标准病毒纯化方法高度纯化，作为杀菌剂或消毒剂防止产肠毒素型大肠杆菌污染。

6、本发明中噬菌体经小鼠毒理实验，对实验小鼠未见异样，将小鼠断颈处死，尸检，未发现其内脏有异样变化。该噬菌体是安全的。

附图说明

图1噬菌体EK99-C电镜图

图2噬菌体EK99-C酶切图

图3噬菌体EK99-C双层平板

图4不同温度对噬菌体EK99-C的作用结果

图5不同pH条件对噬菌体EK99-C的作用结果

具体实施方式

实施例1：噬菌体EK99-C的分离制备

本发明试验用噬菌体宿主菌ETEC-K99为江苏省农业科学院兽医研究所在猪场分离并鉴定过的宿主菌。

本发明样品采自江苏省射阳景荣猪场污水，经双层滤纸过滤，3000rpm离心20min，再用0.22μm滤膜过滤上清。

取50ml过滤上清，加入2ml噬菌体宿主菌ETEC-K99过夜培养物，再加入CaCl₂母液(已过0.22μm滤膜除菌)至终浓度1mM混匀后，加入20ml LB培养基，室温作用1h，再放置于37℃培养12～16h。次日，取上述培养物以14000rpm离心30min，取上清；14000rpm再次离心20min，取上清加入0.1％氯仿，形成噬菌体原液。

将普通营养琼脂平板分为2个区域：吸取宿主菌液0.1ml滴于普通营养琼脂平板正中央，将菌液均匀地涂开；待其晾干后，滴噬菌体原液0.05ml于其中一个区域，并将其涂布均匀；待自然晾干后，置于37℃温箱培养10h后，观察两个区域的变化。同时设立对照，对照中仅涂噬菌体原液，以鉴定噬菌体中是否含有宿主菌。

取噬菌体原液0.1ml，进行10倍稀释，取10²、10⁴和10⁶稀释液各0.1ml与过夜培养的宿主菌液0.1ml混匀，室温作用15min后，加入约5ml 0.7％LB培养基，混匀后迅速倾倒入LB培养基平板上层，摇匀平置5min，待其凝固，置于37℃温箱培养12h后观察，获得形成噬菌斑的双层平板。

噬菌体的纯化培养和扩增

在形成噬菌斑的双层平板上挑取形态大小一致的单个噬菌斑，用接种针穿刺目的噬菌斑，将穿刺后接种针伸入3-5ml LB培养基中，重复3-5次后，加入噬菌体宿主菌液0.1ml，混匀，室温作用15min，37℃培养10～14h，在温度为4℃下14000rpm离心20min，取上清，同时加入0.1ml氯仿，室温作用20min，无菌过滤(0.22μm)上清液；

取2ml新鲜培养的宿主菌，离心，0.4ml LB培养基重悬，加0.1ml噬菌体(以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1∶1、1∶10和1∶100的比例)，加麦芽糖(0.2％)，MgSO₄(10mM)，37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100ml LB液体培养基，其中含有麦芽糖(0.2％)，MgSO₄(10mM)，37℃摇震培养9-12h；加0.1ml氯仿，37℃继续摇震培养10-20min，获得裂解液。

将裂解液转移至离心管，离心8000rpm，去细菌碎片，取上清液；加RNase A、DNase I至1μg/ml，37℃温育30min；加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1h或4℃过夜；4℃离心10000rpm20min，去上清液；加2ml SM液，充分洗溶管壁及沉淀，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的PEG和细胞碎片，温和振荡30s；4℃，3000rpm离心15min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体，双层平板检测纯化噬菌体(见图1)。

纯化的噬菌体命名为EK99-C，于2009年9月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M209208，分类命名为产肠毒素性大肠杆菌K99(ETEC-K99)噬菌体EK99-C。温度及pH对噬菌体稳定性的影响

分别取0.1ml 1×10⁸pfu/ml纯化噬菌体于30℃～90℃水浴作用1h，将样品冰浴冷却后测其效价；分别取pH3.0～10.0的蛋白胨水和2×10⁸pfu/ml纯化噬菌体等量混合，37℃水浴作用2h后测其效价。

结果如图3所示，EK99-C噬菌体在30～50℃分别作用1h后，其活性无显著变化；60℃作用1h后，活性有所降低；70℃作用后，其效价降至10²pfu/ml。

结果如图所示，EK99-C在pH为3和4时，其效价降低约一个数量级；pH为5.0～8.0时，其效价与初始效价无显著性差异；当pH为8.0～10时，其效价降至约10⁷pfu/ml。

不同保藏温度对噬菌体的影响

将纯化的噬菌体10¹¹pfu/ml用10％甘油的SM分别保存于4℃、-20℃及-70℃中，分别于90d、180d检测噬菌体效价。

结果见表1，显示为180d后检测数据，4℃保存至180d，其效价下降一个数量级；-20℃及-70℃保存180d后，效价有微弱变化，其活性较稳定。

表1不同保藏温度下的噬菌体活性检测(180d)

噬菌体宽检测

取0.1ml 10⁵纯化的噬菌体与单核增生性李斯特菌、肠炎沙门菌、痢疾杆菌、福氏志贺菌以及ETEC-K99菌液各0.1ml混匀，室温放置15min后，加入上层0.7％LB培养基约5ml，将该混合液迅速倾倒入下层LB培养基平板上，37℃温箱培养10～12h后观察噬菌斑形成情况。

结果表明：单核增生性李斯特菌、肠炎沙门菌、痢疾杆菌以及福氏志贺氏菌在双层平板上层培养基生长良好，无噬菌斑形成；而在大肠杆菌K99的平板中有噬菌斑形成，说明K99-C噬菌体对对应宿主菌具有裂解作用，无交叉裂解作用，对ETEC-K99菌株特异性比较强异性。

噬菌体安全性实验

8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠，27g±2g，共20只，购自扬州大学比较医学中心。随机分为2组，各10只；其中一组口服EK99-C10¹⁰pfu/0.1ml/只；对照组口服等体积PBS。连续口服14d，脱劲致死小鼠，观察内脏、消化道及黏膜变化情况。

结果显示，此计量的噬菌体对小鼠日常行为没有影响，解剖检查无异常，且在饲喂结束两天后，在小鼠粪便中检测不到噬菌体。

噬菌体体内杀菌实验

挑取K99单个克隆，经过夜培养后，调整其浓度为10⁹cfu/ml；分别以每只10⁸cfu/100μl的剂量口服BALB/c小鼠(8周龄，SPF级，实验前体内K99检测为阴性)，并在1h后，分别口服10⁹pfu/100μl剂量相应的噬菌体(用0.2％蛋白胨-PBS作为赋形剂)，对照组则口服等体积的PBS，分别在12h、24h、36h将小鼠致死，取肠道，加入2mlPBS，匀浆，4℃离心4000rpm 20min，取0.1ml上清进行稀释，并取不同稀释度涂布SS琼脂平板，计算K99菌落总数。

结果如表4所示，在口服噬菌体12h后，检测到的细菌菌落总数为4.05×10³cfu，显著低于对照组；24h及36h后，则检测不到K99细菌。

表2小鼠体内噬菌体杀菌实验结果

仔猪腹泻治疗实验

选取10日龄健康乳猪6头，用ETEC-K99菌株进行攻毒实验，第二天乳猪全部出现腹泻症状，将6头猪分成三组，分别采用肌肉注射、口服和喷雾噬菌体方式对感染发生腹泻乳猪进行治疗，依据体重给予10⁶、10⁷、10⁸cfu/mL的噬菌体悬液，结果显示：三种方式均可减轻仔猪的腹泻症状，其中口服和肌肉注射组能明显有效地控制仔猪的腹泻症状，仔猪精神状态明显好转，治疗效果优于喷雾给药方式。

这说明：1)该噬菌体对治疗因ETEC-K99病源引起的仔猪腹泻，有很好的效果；2)治疗方式可以采取喷雾、口服和注射三种方式，但口服和注射效果要优于喷雾的治疗效果，注射效果相对更好。因此，该噬菌体可以作为治疗仔猪早期腹泻的一种潜在治疗方式。

环境净化与器具细菌污染防治应用

挑取K99单克隆，经过夜培养后，调整期浓度为10⁴cfu/ml，喷洒在食槽(金属托盘)表面；然后将纯化噬菌体以10⁴、10⁵、10⁶pfu/ml浓度，对食槽(金属托盘)实施喷洒消杀，60min后，检测宿主菌。

检测结果显示，在以10⁴、10⁵、10⁶pfu/ml浓度噬菌体实施喷洒消杀60min后，食槽表面已检测不到宿主菌，因此，以浓度≥10⁴pfu/ml噬菌体能够有效的杀灭器具表面污染的大肠杆菌K99。以上各实施例不是对本发明的限制，本发明也不限于以上实施例。

Claims (4)

1.一种产肠毒素性大肠杆菌ETEC-K99的噬菌体EK99-C，其特征在于保藏号CCTCCNO：M209208。

2.根据权利要求1所述的噬菌体EK99-C的应用，其特征在于将所述的噬菌体用于制备预防或治疗幼畜由ETEC-K99病原引起的腹泻或感染的药物。

3.根据权利要求1所述的噬菌体EK99-C的应用，其特征在于将所述的噬菌体用于畜禽养殖、屠宰场环境的净化和器皿的消毒。

4.根据权利1所述的噬菌体EK99-C的应用，其特征在于所述的幼畜为仔猪、羔羊或犊牛。

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