CN117106657A - 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）SKLAN202302、感染动物腹泻模型的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302、感染动物腹泻模型的构建方法及其应用。所述方法包括：以21‑28日龄断奶仔猪或小鼠为试验动物，采用腹腔注射大肠埃希氏菌SKLAN202302菌悬液的方式进行感染，观察感染后仔猪或小鼠状态并记录腹泻症状和死亡情况，时间短、操作次数少，感染动物模型临床症状和病理变化正确反映大肠埃希氏菌SKLAN202302的毒力，模型更加接近实际生产中仔猪腹泻的症状和原因，模型动物易获得，且接近于人的生理特征，适合用作人类医学临床和仔猪生产中大肠杆菌感染的研究模型，为细菌性腹泻病的机制研究提供合适的实验动物模型。
Description
技术领域
本发明涉及细菌性腹泻模型，特别是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302、感染动物腹泻模型的构建方法及其应用。
背景技术
大肠杆菌是引起仔猪腹泻的主要病原之一，包括仔猪黄痢、仔猪白痢、断奶仔猪腹泻、出血性肠炎等疾病。大肠杆菌也是引起人类胃肠道感染和腹泻的主要病原菌之一。近年来，大肠杆菌引起的仔猪腹泻流行广泛，病死率一直居高不下，在当前集约化养殖的条件下，大肠杆菌性腹泻常引起大批仔猪发病，发病过程迅速，在生产和养殖中造成了巨大的经济损失。因此，大肠杆菌性腹泻的防治工作对养殖业的发展尤为重要。
大肠杆菌是引起仔猪断奶后腹泻的主要感染因子，会引起肠腔内水和电解质分泌增加，肠细胞功能和免疫功能改变，通常伴有严重的结肠炎症反应。仔猪感染大肠杆菌后主要表现为恶心、呕吐、畏寒、腹痛、腹泻、结肠炎，大便性状为黄水样或糊状。大肠杆菌感染还可能导致继发感染，引起生长迟缓和发育不良，引起机体免疫系统失衡和严重的炎症反应造成肠道损伤。
动物模型是研究大肠杆菌致病机理、与宿主间相互作用的重要媒介，也是寻找防治大肠杆菌性腹泻方法的重要工具。每年因肠道疾病对动物生产影响较大，比如仔猪痢疾、仔猪胃肠炎、细菌诱导的仔猪腹泻等肠道炎症性疾病是引发仔猪死亡的首要因素。构建大肠杆菌感染仔猪腹泻模型，研究大肠杆菌感染机制，寻找防治方法有助于降低大肠杆菌性腹泻，创造更高的经济效益，为深入探索和预防仔猪断奶腹泻提供可靠的模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302、感染动物腹泻模型的构建方法及其应用，该模型针对目前临床胃肠道感染和腹泻高发病率以及生猪生产中仔猪断奶腹泻高发病率和死亡率的现状，为深入探究预防和治疗仔猪断奶腹泻提供可靠的模型。
本发明的另一目的是提供一株分离自生产中发生腹泻的仔猪结肠食糜的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一株能构建腹泻模型的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302，该菌分离自生产中发生腹泻的仔猪结肠食糜，能引发仔猪和小鼠腹泻。该菌现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNo.26420，保藏日期为2023年01月06日。
经16S rDNA测序结果比对，该菌鉴定为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302。
第二方面，本发明提供所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302在构建仔猪或小鼠腹泻模型中的应用。
第三方面，本发明提供一种大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302感染仔猪或小鼠腹泻模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤1，利用麦康凯液体培养基富集培养大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302，37℃培养8小时，制备得到菌悬液，测得菌悬液中大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)SKLAN202302的浓度为2×109CFU/mL。
步骤2，将步骤1得到的菌悬液离心后得到菌体，用生理盐水清洗3遍，再用生理盐水稀释到原来浓度。
步骤3，选取21-28日龄断奶仔猪，给仔猪腹腔注射大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)SKLAN202302菌液1mL，24小时后再次注射3mL，48小时后注射5mL。在此期间仔猪自由采食和饮水。
步骤4，选取21-28日龄ICR雌鼠，给小鼠腹腔注射大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)SKLAN202302菌液0.1mL，24小时后再次注射0.2mL，48小时后注射0.3mL。在此期间小鼠自由采食和饮水。
第四方面，本发明制备得到的腹泻模型可以用于细菌性腹泻机制探究和筛选预防和治疗断奶仔猪腹泻药物及饲料添加剂。
第五方面，本发明的有益效果是操作简单，过程安全，所得模型更接近于实际生产中的发病情况。
附图说明
图1大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302特性。(A)1％的孔雀石绿染色后的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302形态；(B)麦康凯琼脂培养基涂布平板培养后大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302菌落形态。
图2大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302感染后仔猪表型。(A)仔猪精神沉郁、发生呕吐；(B)仔猪出现畏寒扎堆现象；(C)仔猪出现腹泻，粪便呈水样或糊状；(D)仔猪腹部有大量出血点；(E)仔猪回肠和大肠表面有出血点，回肠末端和结肠内壁褶皱充血，有出血点。
图3腹腔注射大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302后24天内仔猪粪便中大肠杆菌含量。*表示p<0.05。
图4仔猪空肠肠道形态。(A)H&E染色空肠肠道形态；(B)空肠绒毛高度、隐窝深度和绒毛/隐窝比值。*表示p<0.05。
图5仔猪回肠肠道形态。(A)H&E染色回肠肠道形态；(B)回肠绒毛高度、隐窝深度、绒毛/隐窝比值和杯状细胞数量；(C)AB-PAS染色回肠肠道形态和杯状细胞数量。*表示p<0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。以下实施例中若未特别指明，所用技术手段皆为本领域技术人员所熟知的常规手段，除大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302外，所用试剂和原料均市售商品。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302分离自生产中腹泻的杜×长×大28日龄仔猪结肠食糜中。
实施例1大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302菌株的分离与16S rDNA鉴定
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302的分离和鉴定：
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302分离自生产中腹泻的杜×长×大28日龄仔猪结肠食糜中。
(1)结肠食糜收集：选取10头生产中腹泻的杜×长×大28日龄仔猪屠宰分离仔猪结肠，剖开肠段收集结肠食糜各1g，加入20mL含有20％甘油的无菌生理盐水中进行涡旋混匀，然后分装到无菌冻存管中，每管1.5ml，液氮速冻后保存至-80℃冰箱。
(2)菌株分离：取步骤(1)中保存的仔猪结肠食糜1mL，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，吸取稀释液0.1mL于麦康凯琼脂培养基上均匀涂布，37℃培养48h，将生长出的菌落通过平板划线接种到新的麦康凯琼脂培养基进行纯化培养48h。
(3)菌株富集：将纯化培养后的菌株用无菌接种环接种到无菌麦康凯液体培养基中，置于摇床中，37℃培养48h后进行16S rDNA鉴定，并将剩余部分用含有20％甘油的生理盐水稀释保存至-80℃冰箱。
(4)16S rDNA鉴定：将富集后的菌液，使用细菌通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，进行菌落PCR扩增后，进行16S rDNA测序鉴定，序列表如表1所示，在NCBI上将各个菌株的16S rDNA序列与数据库中所有已测定细菌的16S rDNA序列进行比对。根据测序结果以及微生物学特征及生理生化特性，其中10株菌种类鉴定为大肠杆菌。本发明所选取的菌与大肠埃希氏菌相似度为99.65％，鉴定为大肠埃希氏菌。
表1大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302DNA序列表
实施例2大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302特性检测
1、生长曲线测定
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302培养至浓度达到2×109CFU/mL吸取菌液接种到麦康凯液体培养基中，接种量为培养基的1％，放入37℃的摇床中。每隔1h使用酶标仪测定培养基在OD600的值。结果显示大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302菌株在3小时后即可达到对数生长期，8小时进入平台期，最大活菌数达到2.8×109CFU/mL。
2、形态及菌落观察
将菌体涂抹于载玻片上并烘干，用含有1％的孔雀石绿染色3分钟，染色完成后用去离子水缓慢冲洗，洗去多余的染色液，烘干玻片，置于显微镜油镜下观察和拍照。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302形态和麦康凯琼脂培养基培养后菌落形态如图1(A)所示。用接种环蘸取一环菌液在麦康凯琼脂培养基进行划线，37℃培养48h后对其菌落形态进行观察，结果见图1(B)。
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302的微生物学特性如下：
(1)菌落形态：单菌落呈圆形，边缘半透明规则，呈现乳白色。
(2)染色后大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302菌形态呈现杆状，不运动，无鞭毛。
(3)生长特性：在麦康凯液体培养基中，置于37℃摇床培养，3小时后开始进入对数生长期，8小时进入平台期，最大活菌数2.8×109CFU/mL。
实施例3大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302感染小鼠腹泻模型的构建
1、试验方法
选取21日龄雌性ICR小鼠24只，随机分为2个组，分别为对照组和大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302组，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302组采用腹腔注射的方式给小鼠注射浓度为2×109CFU/ml的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302菌液0.1mL，24小时后再次注射0.2mL，48小时后注射0.3mL，构建小鼠腹泻模型。对照组注射等量的生理盐水。试验期间小鼠正常采食和饮水。连续观察一周，每天记录小鼠的腹泻情况，实验开始和结束时记录小鼠的体重。
2、试验结果
注射大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302后小鼠精神沉郁、扎堆，粪便湿润甚至出现水样粪便。小鼠被毛杂乱粗糙，食欲不佳。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302注射组小鼠腹泻率为43.65％，同时体重显著低于对照组(p<0.01)。
表2体重和腹泻率
实施例4大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302感染仔猪腹泻模型的构建
1、试验方法
选取28日龄断奶仔猪36头，随机分为2个组，分别为对照组和大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302组，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302组采用腹腔注射的方式给仔猪注射浓度为2×109CFU/ml的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302菌液1mL，24小时后再次注射3mL，48小时后注射5mL，构建仔猪腹泻模型。对照组注射等量的生理盐水。连续观察一周，每天记录仔猪的腹泻情况，实验开始和结束时记录仔猪的体重和采食量。
饲养管理：实验期内按照猪场常规饲养管理程序操作，自由采食和饮水，并按照猪场的免疫程序进行免疫。
指标测定：试验开始和结束时，分别于当日饲喂前空腹称重作为试验初始重和末重，以重复组为单位详细记录耗料量，记录各组腹泻发生情况，计算平均日增重、料重比和腹泻率(表1)。日增重＝(末重-初始重)/试验天数；料重比＝平均日采食量/平均日增重；腹泻率＝总腹泻率次数/(总头数×试验天数)×100％)。
2、试验结果
(1)大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302对仔猪生长性能和腹泻率的影响
图2大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302感染后仔猪表型。注射大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302后仔猪出现精神沉郁、扎堆现象，同时发生呕吐和腹泻现象。仔猪背毛杂乱粗糙，食欲不佳，粪便为水样粪便。处理组仔猪腹泻率为50.79％。解剖后仔猪腹部有大量出血点，回肠和大肠表面有出血点，回肠末端和结肠内壁褶皱充血。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302注射后仔猪体重显著降低，采食量降低，同时心脏、肝脏和脾脏指数显著增加。
表3生长性能及器官指数
(2)大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302感染后仔猪粪便中大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302含量
在大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302感染前1天和感染后1天、10天、17天和24天收集仔猪新鲜粪便，采用平板涂布法测定仔猪粪便中大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302含量。结果显示，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302感染后第1天和第10天仔猪粪便中大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302数量显著增加，到第17天后恢复至对照水平，如图3所示。
实施例5大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302感染对仔猪肠道形态的影响
1、试验方法
动物试验同实施例4，试验结束后取仔猪空肠和回肠段约1cm肠环固定于4％多聚甲醛中，取肠道黏膜保存于-80℃用于后续分析。
2、试验结果
注射大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302后仔猪腹腔出现出血点，回肠末端、结肠、盲肠肠壁均有出血点。小肠长度显著降低。对仔猪空肠和回肠进行石蜡切片和H&E染色观察发现大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302处理仔猪空肠和回肠绒毛稀疏、短小、顶端出现脱落现象。绒毛排列杂乱，绒毛高度和隐窝深度均显著低于对照组。对回肠进行AB-PAS染色，计算杯状细胞数量，结果显示大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)SKLAN202302处理仔猪回肠杯状细胞数量显著降低。图4为腹腔注射大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302后仔猪空肠肠道形态。(A)H&E染色空肠肠道形态；(B)空肠绒毛高度、隐窝深度和绒毛/隐窝比值。*表示p<0.05。图5为腹腔注射大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302后仔猪回肠肠道形态。(A)H&E染色回肠肠道形态；(B)回肠绒毛高度、隐窝深度、绒毛/隐窝比值和杯状细胞数量；(C)AB-PAS染色回肠肠道形态和杯状细胞数量。*表示p<0.05。
需要说明的是，按照本发明上述各实施例，本领域技术人员是完全可以实现本发明独立权利要求及从属权利的全部范围的，实现过程及方法同上述各实施例；且本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。
以上所述，仅为本发明部分具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302，其特征在于，所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302保藏编号为CGMCC No.26420。
2.权利要求1所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302在构建大肠杆菌性感染动物腹泻模型中的应用。
3.一种构建大肠埃希氏菌SKLAN202302感染动物腹泻模型的方法，其特征在于，所述方法包括：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302富集培养，制备菌悬液，将菌悬液腹腔注射给实验动物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述实验动物为杜×长×大断奶仔猪或ICR小鼠。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述断奶仔猪为21-28日龄的断奶仔猪，所述小鼠为21-28日龄ICR雌鼠。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述菌悬液中大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)SKLAN202302的浓度为1×108CFU/mL～2×109CFU/mL，用生理盐水进行配制。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，给仔猪腹腔注射大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302菌液1mL，24小时后再次注射3mL，48小时后注射5mL；在此期间仔猪自由采食和饮水。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，给小鼠腹腔注射大肠埃希氏菌(Escherichia coli)SKLAN202302菌液0.1mL，24小时后再次注射0.2mL，48小时后注射0.3mL；在此期间小鼠自由采食和饮水。
9.按照权利要求3-8任一项所述方法制备的细菌性腹泻动物模型的以下任一应用：
(1)用于由大肠杆菌性腹泻所致疾病的防治药物筛选；
(2)用于降低仔猪生产中细菌性腹泻的发生和成本损失的研究；
(3)用于细菌性腹泻影响动物肠道健康机制的研究，包括回肠炎、结肠炎和腹泻。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040191170A1 (en) * | 2001-04-03 | 2004-09-30 | Mond James J. | Animal model for enteric pathogens |
| JP2007060963A (ja) * | 2005-08-30 | 2007-03-15 | Eiyo Byorigaku Kenkyusho:Kk | 動物に病原体感染症を発症させるための動物用カプセル製剤およびそれを用いて動物に病原体感染症を発症させる方法 |
| CN101724607A (zh) * | 2009-12-18 | 2010-06-09 | 江苏省农业科学院 | 一种产肠毒素性大肠杆菌etec-k99的噬菌体ek99-c及其应用 |
| CN114747534A (zh) * | 2021-12-02 | 2022-07-15 | 中国农业大学 | 腹泻性大肠杆菌感染动物模型的构建方法及其应用 |
| CN114752532A (zh) * | 2022-04-29 | 2022-07-15 | 扬州大学 | 一株能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌分离株及其应用 |
-
2023
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040191170A1 (en) * | 2001-04-03 | 2004-09-30 | Mond James J. | Animal model for enteric pathogens |
| JP2007060963A (ja) * | 2005-08-30 | 2007-03-15 | Eiyo Byorigaku Kenkyusho:Kk | 動物に病原体感染症を発症させるための動物用カプセル製剤およびそれを用いて動物に病原体感染症を発症させる方法 |
| CN101724607A (zh) * | 2009-12-18 | 2010-06-09 | 江苏省农业科学院 | 一种产肠毒素性大肠杆菌etec-k99的噬菌体ek99-c及其应用 |
| CN114747534A (zh) * | 2021-12-02 | 2022-07-15 | 中国农业大学 | 腹泻性大肠杆菌感染动物模型的构建方法及其应用 |
| CN114752532A (zh) * | 2022-04-29 | 2022-07-15 | 扬州大学 | 一株能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌分离株及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 戴勇: "《临床医学动物实验基础理论与方法》", 海天出版社, pages: 117 * |
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