CN113957005B - 一株具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚菌及其应用 - Google Patents

一株具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域,公开了一株具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚菌,其特征是:保藏编号为CCTCC NO:M2021753;保藏日期为2021年6月23日;保藏单位为中国典型培养物保藏中心。该布劳蒂亚菌改善宿主肠屏障功能,预防ETEC等病原菌对肠上皮的侵袭,促进肠道健康,并且与其余布劳蒂亚菌菌株相比,在预防和修复肠上皮损伤方面更具优势。同时,本发明还公开了布劳蒂亚菌的用途。

Description

一株具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚 菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体为一株具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚菌及其应用。
背景技术
据报道,人类肠道微生物群落可分为三种“肠道型”,即拟杆菌属(Bacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)和瘤胃球菌属(Ruminococcus),其中瘤胃球菌型主要由Clostridiales目、Blautia(即布劳蒂亚菌)目和未分类的Lachnospiraceae目相关类群驱动。Blautia广泛分布于哺乳动物的粪便和肠道中。
B.hydrogenotrophica和B.stercoris是最先从人类粪便中分离出的Blautia。在Blautia属的细菌中,B.wexlerae和B.luti在人肠道内含量最为丰富,是人类肠道的优势菌种之一。另外,其他Blautia菌种也被发现存在于多种环境中。例如,B.coccoides首先是从喂食高乳糖饲料的小鼠粪便中分离出来,从犬的粪便中也分离得到B.glucerasei,甚至从污水和瘤胃中也分离出B.producta、B.schinkii等菌种。
这些发现表明了布劳蒂亚菌在肠道和其他环境中对动物生存和进化的重要性。
本方案所要解决的技术问题是:如何通过新发现的布劳蒂亚菌来修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一株具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚菌(Blautia hominis LYH1),该布劳蒂亚菌改善宿主肠屏障功能,预防ETEC等病原菌对肠上皮的侵袭,促进肠道健康,并且与其余布劳蒂亚菌菌株相比,在预防和修复肠上皮损伤方面更具优势。
同时,本发明还公开了布劳蒂亚菌的用途。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一株具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚菌,保藏编号为CCTCC NO:M2021753;保藏日期为2021年6月23日;保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
拉丁文名称为:Blautia hominis LYH1;保藏地点在:中国.武汉.武汉大学。
优选地,所述布劳蒂亚菌从健康仔猪粪便中分离获得的。
在上述的具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚菌中,所述布劳蒂亚菌的16S r RNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。
同时,本发明还公开了一种如上述的具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚菌的应用,所述布劳蒂亚菌应用于饲料添加剂。
在上述的具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚菌的应用中,用作猪饲料添加剂。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明布劳蒂亚菌从健康仔猪粪便中分离获得,其可通过改善宿主肠屏障功能,预防ETEC等病原菌对肠上皮的侵袭,促进肠道健康,并且与其余布劳蒂亚菌菌株相比,在预防和修复肠上皮损伤方面更具优势。
其具有应用于各种动物食用添加剂特别是哺乳动物的饲料添加剂,更合适地,可应用于猪饲料添加剂。
附图说明
图1为本发明的实施例1的小鼠结肠炎性损伤的修复作用实验中的对照组、DSS组合SSS+菌株组的小鼠体重、DAI和结肠长度;
图2为本发明的实施例1的小鼠结肠炎性损伤的修复作用实验中的对照组、DSS组合SSS+菌株组的小鼠结肠食糜特定菌群数量;
图3为本发明的实施例1的小鼠结肠炎性损伤的修复作用实验中的对照组、DSS组合SSS+菌株组的小鼠结肠粘膜紧密连接蛋白和细胞因子基因相对表达量;
图4为本发明的实施例1的对常见病原菌的抑制作用实验中的布劳蒂亚菌培养物对常见病原菌的抑制作用;
图5为本发明的实施例1的布劳蒂亚菌与其他布劳蒂亚菌菌株对大肠杆菌感染小鼠肠屏障功能的影响实验中的各组小鼠血清LPS与D-乳酸含量;
图6为本发明的实施例1的布劳蒂亚菌与其他布劳蒂亚菌菌株对大肠杆菌感染小鼠肠屏障功能的影响实验中的各组小鼠结肠粘膜屏障相关基因表达量;
图7为布劳蒂亚菌的保藏证明。
附图2-3、5-6中不同字母表示组间统计学差异显著(P<0.05),相同字母则表示差异不显著(P>0.05)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、菌株的筛选与鉴定
(1)菌株的分离与纯化
厌氧采集健康仔猪新鲜粪便样本,在厌氧工作站中将样本用灭菌生理盐水梯度稀释,灭菌纱布过滤,取稀释梯度为10-6和10-7粪便悬液分别涂布于脑心浸液肉汤(BHI)琼脂糖平板(琼脂糖浓度为15g/L液体培养基),37℃条件下厌氧培养48h后,挑取单菌落于BHI琼脂糖平板上进3次划线纯化,再挑取单菌落于BHI液体培养基富集36h,在培养基中加入甘油(终浓度为25%)-80℃保存。
(2)菌株的鉴定
参考《伯杰氏系统细菌学手册》对上述保存菌种的形态特征、生理生化特征进行鉴定,并通过测定16S r RNA基因序列对其进行遗传学分类鉴定。
菌株形态特征:革兰氏阳性细菌,倒置显微镜观察其菌体为不活动的球形或椭圆形,成对或成串出现。BHI培养基上菌落显示为乳白色,呈圆形,边缘不整齐。
菌株生理生化特征:该菌株可产生α-半乳糖苷酶,β-半乳糖苷酶,α-葡萄糖苷酶,β-葡萄糖苷酶,α-阿拉伯糖苷酶,β-葡萄糖醛酸酶,N-乙酰基-β-氨基葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、精氨酸芳酰胺酶、亮氨酸芳酰胺酶,可以利用d-阿拉伯糖、l-阿拉伯糖、d-核糖、d-木糖、d-半乳糖、d-葡萄糖、d-果糖、d-甘露糖、肌醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、l-岩藻糖、d-阿拉伯糖醇等碳源,产生乙酸、琥珀酸、乳酸、延胡索酸。明胶水解反应为阴性。
菌株的16S r RNA基因序列如下(SEQ ID NO:1):
aaggcctggccgcagctaccatgcaagtcgagcgaagcacttaagtggatctcttcggattgaaacttatttgactgagcggcggacgggtgttataacgcgtgggtaacctgcctcatacagggggataacagttagaaatggctgctaataccgcataagcgcacaggaccgcatggtctggtgtgaaaaactccggtggtatgagatggacccgcgtctgattagctagttggaggggtaacggcccaccaaggcgacgatcagtagccggcctgagagggtgaacggccacattgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggggaaaccctgatgcagcgacgccgcgtgaaggaagaagtatctcggtatgtaaacttctatcagcagggaagaaaatgacggtacctgactaagaagccccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggggcaagcgttatccggatttactgggtgtaaagggagcgtagacggaagagcaagtctgatgtgaaaggctggggcttaaccccaggactgcattggaaactgtttttctagagtgccggagaggtaagcggaattcctagtgtagcggtgaaatgcgtagatattaggaggaacaccagtggcgaaggcggcttactggacggtaactgacgttgaggctcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatactaggtgtcgggtggcaaagccattcggtgccgcagcaaacgcaataagtattccacctggggagtacgttcgcaagaatgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaagtcttgacatccctctgaccggcccgtaacggggccttcccttcggggcagaggagacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctatccttagtagccagcaggtgaagctgggcactctagggagactgccggggataacccggaggaaggcggggacgacgtcaaatcatcatgccccttatgatttgggctacacacgtgctacaatggcgtaaacaaagggaagcgagacagcgatgttgagcaaatcccaaaaataacgtcccagttcggactgcagtctgcaactcgactgcacgaagctggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtcagtaacgcccgaagtcagtgacccaacctacaggaggagctgccgaagcgaccgtgtgtt
该菌株16S rRNA序列与NCBI GenBank数据库中的Blautia hominis strain KB1的序列相似性为98.44%,说明该菌株属于Blautia hominis的新菌株。
二、布劳蒂亚菌对小鼠结肠炎性损伤的修复作用
(1)研究目的:采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠结肠炎,同时灌胃布劳蒂亚菌菌液,通过检测疾病活动指数(DAI)、结肠长度、结肠食糜短链脂肪酸(SCFA)含量、特定菌群含量、结肠粘膜紧密连接蛋白和炎症相关细胞因子基因表达量等指标,考察布劳蒂亚菌活菌处理是否缓解小鼠结肠炎性损伤。
(2)试验设计:采用单因子试验设计,选择30只8周龄健康雄性C57BL/6小鼠,按体重无差异原则随机分为3组,即对照组、DSS处理组、DSS+菌株组,每组10只小鼠,单笼饲养。所有小鼠饲喂AIN93标准饲料。试验共分2个阶段,各持续1周。对照组小鼠试验全期正常饲养,不作任何处理;DSS处理组小鼠第1周正常饲养,从试验第8天开始在其饮水中添加3.5%DSS,诱导急性结肠炎;DSS+菌株组小鼠试验全期每隔1天灌胃2mL浓度为1×109CFU/mL的布劳蒂亚菌菌液,并从试验第8天开始饮用3.5%DSS溶液;对照组和DSS处理组小鼠试验全期每隔1天灌胃等体积无菌培养基。从试验第2周开始,每天记录小鼠体重,并对其粪便进行评分,同时采用联苯胺法检测粪便隐血,计算DAI。试验结束后屠宰所有小鼠,测量结肠长度,采集结肠食糜保存于-80℃,用于SCFA和菌群含量测定;每只小鼠剪取约2cm结肠,无菌生理盐水轻轻冲洗,保存于-80℃用于相关基因表达量的测定。
(3)材料与方法:
培养基配方(每1000ml)和培养条件:葡萄糖5g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉10.0g、NaHCO30.4 g、Na2HPO4·12H2O 4.0g、K2HPO4 0.04g、KH2PO4 0.04g、MgSO4·7H2O 0.008g、CaCl2·2H2O 0.008g、NaCl 0.08g、MnCl2·4H2O 0.01g、CoCl2·6H2O 0.001g、FeCl3·6H2O 0.008g,加无氧蒸馏水至1000mL,加0.1%刃天青1mL指示培养基厌氧状况。菌株于37℃厌氧培养24-36h至OD600为0.8以上。
DAI的计算:根据体重指数(体重记为0,体重下降率1-5%记为1分,体重下降率5-10%记为2分,体重下降率10-15%记为3分,体重下降率大于15%记为4分)、粪便评分(正常记为0,松散记为2分,腹泻记为4分)、粪便隐血(正常记为0分,隐血阳性记为为2分,肉眼可见便血记为4分),按公式DAI=(体重指数+大便形状+出血情况)/3。粪便隐血采用联苯胺法测定。
菌群与相关基因的定量:采用real-time PCR方法对小鼠结肠食糜中的乳酸杆菌、双歧杆菌、酪酸梭菌、大肠杆菌等特定菌群,以及结肠粘膜紧密连接蛋白和细胞因子基因进行绝对定量。引物序列和参考文献见附表1。
附表1本试验所用引物序列及参考文献
Figure GDA0003392753220000071
Figure GDA0003392753220000081
Figure GDA0003392753220000091
(4)试验结果与分析:
如图1所示,在试验第1周正常饲养情况下,灌胃布劳蒂亚菌活菌对小鼠体重无显著影响(A);试验第2周,与对照组相比,DSS处理显著(P<0.05)降低小鼠体重(B)和结肠长度(D),同时显著提高小鼠DAI(P<0.05)。在DSS处理情况下灌胃布劳蒂亚菌活菌可明显缓解小鼠小鼠体重下降(B)和DAI的升高(C),且对结肠长度有明显改善(D)。
注:A:试验1-7d各组小鼠体重变化;B:试验8-14d各组小鼠体重变化;C:结肠炎模型建立期间(8-14d)各组小鼠DAI变化;D:各组小鼠结肠长度
由附表2可知,与对照组相比,DSS处理显著降低小鼠结肠乙酸含量(P<0.05),但灌胃布劳蒂亚菌活菌后,小鼠结肠乙酸含量显著升高且高于对照组(P<0.05);同时,活菌处理组小鼠结肠丁酸浓度显著高于对照组和DSS组(P<0.05)。
附表2各组小鼠结肠食糜主要SCFA浓度
Figure GDA0003392753220000101
注:同列数字不同字母上标表示差异显著(P<0.05)。
如图2所示,与对照组相比,DSS处理显著降低小鼠结肠乳酸杆菌、双歧杆菌、酪酸梭菌等有益菌数量,同时显著增加大肠杆菌数量(P<0.05);灌胃布劳蒂亚菌活菌可显著改善上述有益菌数量,降低大肠杆菌数量(P<0.05)。值得一提的是,DSS+菌株组小鼠结肠酪酸梭菌数量甚至显著高于对照组(P<0.05)。
上述结果表明,灌胃布劳蒂亚菌活菌可提高结肠炎小鼠结肠内主要SCFA,特别是丁酸的浓度,这可能直接促进了乳酸杆菌、双歧杆菌、酪酸梭菌等有益菌的增殖,从而抑制有害菌的生长。
由图3可知,与对照组相比,DSS处理显著降低小鼠结肠粘膜ZO-1、Occludin、Claudin-2等紧密连接蛋白基因的相对表达量(P<0.05),同时显著提高TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性细胞因子表达量(P<0.05);灌胃布劳蒂亚菌活菌显著提高结肠炎小鼠紧密连接蛋白基因表达量,同时显著下调炎性细胞因子基因表达(P<0.05)并与对照组表达水平相当(P>0.05)。
上述结果说明布劳蒂亚菌活菌处理可明显缓解由结肠炎导致的小鼠肠屏障损伤。
三、布劳蒂亚菌对常见病原菌的抑制作用
(1)研究目的:根据小鼠试验结果,布劳蒂亚菌活菌处理可显著提高结肠炎小鼠结肠食糜中的SCFA浓度,同时降低大肠杆菌浓度,说明其可能对有害菌的生长具有抑制作用。本试验通过布劳蒂亚菌培养物与常见病原菌的共培养,考察布劳蒂亚菌是否对病原菌具有抑制作用。
(2)试验设计:本试验中的4种常见病原菌包括猪链球菌(Streptococcus suis)、产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。处理组分别在4种病原菌的液体培养基中加入来自同一发酵瓶的布劳蒂亚菌培养物(不含菌体的培养基上清液);对照组则分别在4种病原菌的液体培养基中加入灭菌布劳蒂亚菌培养物,病原菌培养基与布劳蒂亚菌培养物体积比为10:1。每种病原菌做4个重复。每隔4h取1mL病原菌培养液测定其OD600。
(3)材料与方法:
布劳蒂亚菌培养物的制备:布劳蒂亚菌的培养方法同上,培养基体积为200mL(250mL厌氧发酵瓶),当菌液OD600为0.8-1.0时终止培养。充分混匀菌液后,吸取10mL菌液,10000g离心5分钟,取上清即为布劳蒂亚菌培养物。
病原菌培养基:本试验中采用的猪链球菌培养基为胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB),每100mL培养基含1.5g胰蛋白胨、0.5g大豆蛋白胨、0.5g NaCl,最终pH为7.2;大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、产气荚膜梭菌的培养采用LB培养基,每1000mL培养基含胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g,最终pH为7。
(4)结果与分析:
由图4可知,与对照组相比,布劳蒂亚菌培养物可在4-48h显著抑制猪链球菌(A)、产肠毒素性大肠杆菌(B)、鼠伤寒沙门氏菌(C)、产气荚膜梭菌(D)等常见病原菌的生长(P<0.05)。
注:对照组(C)和布劳蒂亚菌培养物处理组(B)0-48h培养液OD600值;A:猪链球菌;B:产肠毒素性大肠杆菌;C:鼠伤寒沙门氏菌;D:产气荚膜梭菌。
四、布劳蒂亚菌与其他Blautia hominis菌株对大肠杆菌感染小鼠肠屏障功能的影响
(1)研究目的:通过建立产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)感染的小鼠模型,比较布劳蒂亚菌与商业菌株对小鼠肠道通透性、紧密连接蛋白表达量的影响是否具有差异,以及布劳蒂亚菌是否在缓解小鼠细菌感染性肠炎方面更具应用优势。
(2)试验设计:选择体重约为20g的健康雄性C57BL/6小鼠40只,随机分为5组(C1、C2、L、S、M),饲喂标准商业化饲粮,自由采食和饮水,试验期为14天,前4天为建模期,后10天为处理期。其中,C1组小鼠前4天每天灌胃无菌培养基,后10天每2天灌胃无菌培养基;C2组小鼠前4天每天灌胃ETEC培养液,后10天每2天灌胃无菌培养基;L组小鼠前4天每天灌胃ETEC培养液,后10天每2天灌胃布劳蒂亚菌培养液;S组小鼠前4天每天灌胃ETEC培养液,后10天每2天灌胃Blautia schinkii BNCC352000(购自北纳生物)培养液;M组小鼠前4天每天灌胃ETEC培养液,后10天每2天灌胃0.2mL Blautia mianzhuensis ACCC 00708(购自中国农业微生物菌种保藏管理中心)培养液。ETEC与各菌株浓度均为1×109CFU/mL,每次灌胃量均为0.3mL。布劳蒂亚菌菌株的复苏与富集培养参照上述方法进行,商业菌株的复苏与富集培养参照其说明进行。试验结束后屠宰所有小鼠,采集静脉血、回肠、结肠等样品。
(3)结果与分析:
如图5所示,与健康小鼠(C1)相比,ETEC攻毒(C2)显著提高小鼠血清中的脂多糖(LPS)与D-乳酸含量(P<0.05)。与ETEC感染小鼠(C2)相比,前期灌胃布劳蒂亚菌(L)、Blautia schinkii BNCC352000(S)、Blautia mianzhuensis ACCC 00708均可显著(P<0.05)降低小鼠血清LPS与D-乳酸含量,但布劳蒂亚菌(L)的降低幅度显著(P<0.05)大于上述两株商品模式菌株。
如图6所示,与健康小鼠(C1)相比,ETEC攻毒(C2)显著降低小鼠结肠粘膜中的ZO-1、ZO-2、Claudin等紧密连接蛋白基因的表达量(P<0.05),而前期灌胃布劳蒂亚菌(L)可显著(P<0.05)缓解这些基因表达量的降低,但前期灌胃其余两种商品模式菌株(S、M)则无此效应。
血清LPS与D-乳酸是反映肠道通透性的金标准,而紧密连接蛋白是肠道中最重要的物理屏障。当病原菌感染产生炎症时,肠上皮屏障受到破坏,内毒素(如LPS)等通过受损的位点进入血液,引发机体炎症。因此,上述结果证实布劳蒂亚菌可通过改善宿主肠屏障功能,预防ETEC等病原菌对肠上皮的侵袭,促进肠道健康。同时,与其余Blautia hominis菌株相比,布劳蒂亚菌在预防和修复肠上皮损伤方面更具优势。
对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一株具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1438
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
aaggcctggc cgcagctacc atgcaagtcg agcgaagcac ttaagtggat ctcttcggat 60
tgaaacttat ttgactgagc ggcggacggg tgttataacg cgtgggtaac ctgcctcata 120
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taacgcccga agtcagtgac ccaacctaca ggaggagctg ccgaagcgac cgtgtgtt 1438

Claims (5)

1.一株具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚菌(Blautia hominis),其特征在于:保藏编号为CCTCC NO:M2021753;保藏日期为2021年6月23日;保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
2.根据权利要求1所述的具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚菌(Blautia hominis),其特征在于:所述布劳蒂亚菌从健康仔猪粪便中分离获得的。
3.根据权利要求1所述的具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚菌(Blautia hominis),其特征在于,所述布劳蒂亚菌的16S r RNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种如权利要求1-3任一所述的具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚菌的应用,其特征在于,所述布劳蒂亚菌应用于饲料添加剂。
5.根据权利要求4所述的具有修复肠上皮炎性损伤和抑制病原菌作用的布劳蒂亚菌的应用,其特征在于,用作猪饲料添加剂。
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