CN115737689B

CN115737689B - 乳酸杆菌在制备预防和治疗炎症性肠病的药物中的应用

Info

Publication number: CN115737689B
Application number: CN202211353013.8A
Authority: CN
Inventors: 徐建国; 刘丽云; 杨晶
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2022-11-01
Filing date: 2022-11-01
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2042-11-01
Also published as: CN115737689A

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及乳酸杆菌在制备预防和治疗炎症性肠病的药物中的应用。本发明发现徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)06‑2、徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)HT111‑2具有防治炎症性肠病的功效，能够显著改善结肠炎症，而且具有较高的安全性，显示出在制备炎症性肠病治疗和/或预防药物方面的潜力，为IBD的防治提供了新的策略，具有潜在的临床应用前景。

Description

乳酸杆菌在制备预防和治疗炎症性肠病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及乳酸杆菌在制备预防和治疗炎症性肠病的药物中的应用。

背景技术

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)以及克罗恩病(Crohn's disease，CD)，其临床特征十分明确，主要表现为肠道黏膜的慢性、非特异性炎症反应。IBD的发病率和流行范围日益增加，已然成为全球性的健康问题，而且IBD难以治愈、反复发作，对患者的生活造成极大不便，因此应对其给予高度重视。目前IBD的发病机制尚不十分明确，但许多研究表明肠道微生物群失调、机体免疫系统异常以及遗传易感性和环境等多因素的结合破坏了肠道内环境的平衡，最终引起疾病的产生。

目前临床上治疗IBD的药物主要有氨基水杨酸类药物、皮质类固醇类药物以及生物和免疫制剂类的药物，这些药物对IBD的治疗起到了一定的积极效果，但长期服用会给机体带来相当大的副作用。因此，开发能够有效缓解IBD且副作用较小的药物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供徐建国氏乳杆菌在预防、治疗炎症性肠病方面的新用途。

乳酸杆菌涵盖了许多不同种的细菌，不同种细菌的功能通常存在较大差异。徐建国氏乳杆菌是发明人前期发现的乳酸杆菌的一个新种，徐建国氏乳杆菌06-2、徐建国氏乳杆菌HT111-2是属于该种的两个菌株，已知具有降脂、缓解糖尿病和肝病的功能。然而，目前从未发现徐建国氏乳杆菌具有缓解炎症性肠病的功能。发明人在对炎症性肠病的功效成分的研究过程中，意外地发现徐建国氏乳杆菌06-2、徐建国氏乳杆菌HT111-2对于结肠炎症具有明显的改善作用，并基于上述发现完成了本发明。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)在制备用于治疗结肠炎的药物中的应用；

所述徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)为徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)06-2和/或徐建国氏乳杆菌(Lactobacillusxujianguonis)HT111-2。

本发明中，徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)06-2的保藏编号为CGMCC No.23437，保藏日期为2021年 9月17日，分类命名为Lactobacillus xujianguonis，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。该菌株已在专利申请CN114231472A中公开。

徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)HT111-2的保藏编号为CGMCCNo.1.13855，保藏日期为2021年12月16日，分类命名为徐建国氏乳杆菌(Lactobacillusxujianguonis)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。该菌株已在专利申请CN114292795A中公开。

上述两个菌株均从仅摄食植物的青海野生旱獭粪便中分离筛选得到。

第二方面，本发明提供徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)在制备用于预防结肠炎的药物中的应用；

在本发明的一些实施方式中提供徐建国氏乳杆菌(Lactobacillusxujianguonis)06-2在制备用于预防和/或治疗结肠炎的药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中提供徐建国氏乳杆菌(Lactobacillusxujianguonis)HT111-2在制备用于预防和/或治疗结肠炎的药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中提供徐建国氏乳杆菌(Lactobacillusxujianguonis)06-2和徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)HT111-2在制备用于预防和/或治疗结肠炎的药物中的应用。

第三方面，本发明提供徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用；

第四方面，本发明提供徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)在制备用于预防炎症性肠病的药物中的应用；

在本发明的一些实施方式中提供徐建国氏乳杆菌(Lactobacillusxujianguonis)06-2在制备用于预防和/或治疗炎症性肠病的药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中提供徐建国氏乳杆菌(Lactobacillusxujianguonis)HT111-2在制备用于预防和/或治疗炎症性肠病的药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中提供徐建国氏乳杆菌(Lactobacillusxujianguonis)06-2和徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)HT111-2在制备用于预防和/或治疗炎症性肠病的药物中的应用。

优选地，上述应用中，所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。

优选地，上述应用中，所述药物具有缓解肠道炎症的功能。

优选地，上述应用中，所述药物具有增加结肠长度的功能。

优选地，上述应用中，所述药物具有增强抗炎因子分泌的功能。

其中，所述抗炎因子优选为IL-10。

以上所述的药物的有效成分包含徐建国氏乳杆菌(Lactobacillusxujianguonis)06-2和/或徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)HT111-2。

上述药物中，徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)06-2、徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)HT111-2优选以活菌形式存在。

上述药物中，徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)06-2、徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)HT111-2可以菌液、冻干粉等形式提供。

在本发明的一些实施方式中，所述药物为胶囊、冻干粉或者菌液制剂。

本发明的有益效果在于：本发明发现徐建国氏乳杆菌(Lactobacillusxujianguonis)06-2、徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)HT111-2具有防治炎症性肠病的功效，能够有效减轻因炎症导致的结肠长度缩短，降低疾病活动指数(DAI)和结肠的炎症损伤程度，进而显著改善结肠炎症，而且具有较高的安全性，摄入该菌的动物的体征正常，胃、肠、肝、脾等病理检测均未见异常，且不会进行异位定植，显示出在制备炎症性肠病治疗和/或预防药物方面的潜力，为IBD的防治提供了新的策略，具有潜在的临床应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例2中徐建国氏乳杆菌CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855对DSS诱导的结肠炎模型小鼠疾病活动指数(DAI)影响的比较图。

图2为本发明实施例2中徐建国氏乳杆菌CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855对DSS诱导的结肠炎模型小鼠结肠长度影响的比较图。

图3为本发明实施例2中徐建国氏乳杆菌CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855对DSS诱导的结肠炎模型小鼠结肠组织病理改变的HE染色图。

图4为本发明实施例2中徐建国氏乳杆菌CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855对DSS诱导的结肠炎模型小鼠结肠组织病理评分的比较图。

图5为本发明实施例2中徐建国氏乳杆菌CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855对DSS诱导的结肠炎模型小鼠血清中IL-10含量影响的比较图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 乳酸杆菌的分离、筛选和鉴定

1. 乳酸杆菌的分离

1) 从保菌管中取出标本100μL，加入到预装900μL无菌PBS的EP管中，依次对样本进行梯度稀释，旱獭粪便标本浓度稀释至10^-6倍；

2) 取不同稀释度的样品100μL涂布于MRS培养基上，放入培养箱中；

3) 在37℃，厌氧环境中培养48h；

4) 取出培养皿，用无菌接种环挑取不同形态特征的菌落，转接至新的MRS 固体培养基中进行纯化，37℃厌氧培养48h，连续转接3次，将纯化菌株在pH=3.5的液体MRS中培养，筛选耐酸生长优良的菌株可用于实验或冷冻保藏。

2. 菌种保藏

采用含25%甘油的MRS培养基作为保菌液进行菌种的冷冻保藏，方法如下：

1) 将容量为2mL的保菌管加入1.5mL的无菌保菌液，经121℃，15min高压灭菌处理后以备使用；

2) 乳酸杆菌在MRS固体培养基上连续转接3次后，用无菌接种环刮涂菌落；

3) 将菌落转移到含无菌保菌液的保菌管中，混匀后-80℃冻存。

3. 菌落外观和菌体形态观察

保藏编号为CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855的乳酸杆菌06-2和HT111-2属厌氧菌，在厌氧条件下生长良好，在MRS加5%的脱脂纤维羊血培养基上形成圆形、边缘不规则、中间隆起、表面粗糙的淡黄色菌落，直径约1-1.2 mm；在有氧条件下不生长。在光学显微镜下，经革兰氏染色，菌体呈淡紫色，可出现首尾相接的排列方式。菌体在透射电镜下呈杆状，无芽胞、无鞭毛、无菌毛、无动力，直径约 0.7-1×2.5-4.28 µm。

4. 细菌总DNA提取和16S rRNA基因PCR扩增

将单个菌落接种于MRS培养基上，37℃厌氧过夜培养，按照细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)说明书操作，提取DNA。然后使用16S rRNA基因通用引物扩增所选菌落16SrDNA并测序，序列在NCBI上进行BLAST比对，进行初步鉴定。

所用的细菌16S rRNA基因PCR扩增的引物以及PCR反应的条件如下所述，实验全部用50μL的PCR体系。将16S rRNA基因测序结果提交至NCBI进行BLAST比对，结果提示CGMCCNo.23437和CGMCC No.1.13855菌株为乳杆菌属的一个新种。且CGMCC No.23437菌株的16SrRNA基因序列与CGMCC 1.13855菌株的序列一致性为99.44%，说明CGMCC No.23437和CGMCC1.13855属于同一个种，命名为徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)。

通用引物的16S rRNA PCR 扩增条件如下：

引物序列：

27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；

1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'；

PCR反应体系(50μL)：

Premix Taq 25μL;

dd H₂O 19μL；

27F/1492R 2/2μL；

DNA 2μL。

PCR扩增条件：95℃热启动、变性5min；95℃、30sec，54℃、45sec，72℃、45sec，35个循环；72℃、7min。

5. 菌株的生化鉴定方法

采用法国梅里埃公司生产的“BioMerieux”细菌系统生化鉴定卡API 50CH和APIZYM对菌株06- 2和HT111-2以及参考菌株进行碳水化合物酵解和酶促反应生化鉴定。

结果：根据生化鉴定，获得了两株生化特征为徐建国氏乳杆菌的菌种，将这两株徐建国氏乳杆菌进行生物保藏，菌株保藏编号分别为CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855，现这两株菌株已被命名为：徐建国氏乳杆菌06-2(Lactobacillus xujianguonis 06-2)和徐建国氏乳杆菌HT111-2(Lactobacillus xujianguonis HT111-2 )。

实施例2 徐建国氏乳杆菌CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855对DSS诱导小鼠结肠炎的改善

1、实验方法：

40只6-8周雌性SPF级C57BL/6小鼠适应5天后，随机分为四组(n=10)，即对照组(NC组)、模型组(DSS组)、CGMCC No.23437干预组(06-2组)和CGMCC No.1.13855干预组(HT111-2组)。DSS组、06-2组和HT111-2组分别以200 uL PBS/只、CGMCC No.23437或CGMCCNo.1.13855菌悬液(1×10⁸CFU/只)预灌胃7 d(D-7 ~ D-1)后，对这三组小鼠的饮用水中添加3%(W/V)DSS，并继续灌胃7 d (D0 ~ D6)。每日记录小鼠的体重、粪便性状和潜血状况，据此计算疾病活动指数(disease activity index，DAI)。粪便性状：0 正常；1 柔软但仍成型；2 稀便；3 腹泻；4 水样腹泻；便血状态：0 无大便潜血；2 大便潜血阳性；4 可见直肠出血；体重变化：0 体重无下降；1 体重下降1-5%；2 体重下降5-10%；3 体重下降10-15%；4 体重下降＞15%。DAI＝体重下降百分率得分＋粪便性状得分＋粪便潜血情况得分。

实验结束后，测量小鼠结肠长度，取远端结肠浸泡于4%多聚甲醛供后续组织病理学分析。病理切片制作过程：结肠组织经过脱水、包埋、切片后，进行苏木精-伊红(H&E)染色。在显微镜下阅览切片。具体病理评分标准如表1所示。

表1 小鼠结肠组织病理评分标准

2、实验结果：

徐建国氏乳杆菌CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855对DSS诱导的结肠炎模型小鼠体重的影响如表2所示。对实验小鼠分别预灌胃PBS或者徐建国氏乳杆菌CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855七天(D-7-D-1)，四组均未发现小鼠死亡现象，而且干预组与对照组体重变化无差异(P>0.05)。模型组和干预组喂食3%DSS的七天(D0-D6)，在D4-D6的三天，模型组比对照组小鼠体重明显下降(P< 0.05)；在D4和D5的两天，CGMCC No.1.13855干预组比模型组小鼠体重明显增加(P< 0.05)；而CGMCC No.23437干预组与模型组体重变化无差异(P>0.05)。

表2 实验小鼠每日体重统计结果(g)

注：与模型组相比，*，P< 0.05；**，P< 0.01；***，P< 0.001。

表3和图1显示了徐建国氏乳杆菌CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855对DSS诱导的结肠炎模型小鼠疾病活动指数(DAI)的影响。模型组和干预组喂食3%DSS的七天(D0-D6)，在D2-D6的五天，模型组明显高于对照组小鼠DAI得分(P<0.01)；在D3-D6的四天，CGMCCNo.1.13855干预组明显低于模型组小鼠DAI得分(P<0.01)；在D4-D6的三天，CGMCCNo.23437干预组明显低于模型组小鼠DAI得分(P< 0.05)。

表3实验小鼠DAI评分结果

注：与模型组相比，*，P< 0.05；**，P< 0.01；***，P< 0.001。

图2显示了徐建国氏乳杆菌CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855对DSS诱导的结肠炎模型小鼠结肠长度的影响。模型组和干预组喂食3%DSS七天(D0-D6)，模型组小鼠结肠长度为4.83± 0.35cm，明显短于对照组小鼠结肠长度6.94± 0.70cm(P< 0.001)，CGMCCNo.23437和CGMCC No.1.13855干预组结肠长度分别为5.93± 0.57 cm和6.03± 0.71cm，明显长于模型组小鼠结肠长度4.83± 0.35cm(P< 0.001)。

图3显示了徐建国氏乳杆菌CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855对DSS诱导的结肠炎模型小鼠结肠组织病理改变的影响。模型组和干预组喂食3%DSS七天(D0-D6)，模型组小鼠结肠组织病理变化为肠组织可见弥漫性黏膜溃疡，黏膜上皮及隐窝结构消失，被增生的结缔组织替代，杯状细胞数量中度至重度减少，偶见残留的隐窝异型性扩张，并可见嗜碱性絮状物；炎症反应重度，侵及黏膜下层，可见大量的淋巴细胞浸润，黏膜下层可见多灶性水肿，结缔组织疏松；CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855干预组结肠组织病理变化为肠组织可见小灶性黏膜坏死，黏膜上皮及隐窝结构消失，被增生的结缔组织替代，杯状细胞数量轻度减少，少量隐窝异型性扩张，并可见嗜碱性絮状物，偶见隐窝脓肿，炎症反应较轻，侵及黏膜下层，可见少量的淋巴细胞浸润；对照组小鼠结肠组织无病理变化。

图4显示了徐建国氏乳杆菌CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855对DSS诱导的结肠炎模型小鼠结肠组织病理评分的影响。模型组和干预组喂食3%DSS七天(D0-D6)，模型组小鼠结肠组织病理评分为2.18±0.27分，明显高于对照组小鼠结肠组织病理评分2.18±0.27分(P< 0.001)，CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855干预组结肠组织病理评分分别为1.49±0.53和1.59±0.59分，明显低于模型组小鼠结肠的组织病理评分2.18±0.27分(P<0.001)。

图5显示了徐建国氏乳杆菌CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855对DSS诱导的结肠炎模型小鼠血清中IL-10含量的影响。模型组和干预组喂食3%DSS七天(D0-D6)，模型组小鼠血清中IL-10含量为254.3±30.6 ng/mL，明显低于对照组小鼠血清中IL-10含量291.8±30.6 ng/mL(P< 0.05)，CGMCC No.23437和CGMCC No.1.13855干预组小鼠血清中IL-10含量分别为296.8±31.6 ng/mL和296.6±33.5 ng/mL，明显高于模型组小鼠血清中IL-10含量254.3±30.6 ng/mL(P< 0.05)。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)在制备用于治疗结肠炎的药物中的应用；

所述徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)为徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)06-2和/或徐建国氏乳杆菌(Lactobacillusxujianguonis)HT111-2；

其中，徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)06-2的保藏编号为CGMCCNo.23437，徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)HT111-2的保藏编号为CGMCCNo.1.13855。

2.徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)在制备用于预防结肠炎的药物中的应用；

3.徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的应用；

4.徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)在制备用于预防炎症性肠病的药物中的应用；

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。

6.根据权利要求1~4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物具有缓解肠道炎症的功能。

7.根据权利要求1~4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物具有增加结肠长度的功能。

8.根据权利要求1~4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物具有增强抗炎因子分泌的功能。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗炎因子为IL-10。

10.根据权利要求1~4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的有效成分包含徐建国氏乳杆菌(Lactobacillus xujianguonis)06-2和/或徐建国氏乳杆菌(Lactobacillusxujianguonis)HT111-2。