CN107164336A - 一种大肠杆菌噬菌体及其应用 - Google Patents

一种大肠杆菌噬菌体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107164336A
CN107164336A CN201710540832.6A CN201710540832A CN107164336A CN 107164336 A CN107164336 A CN 107164336A CN 201710540832 A CN201710540832 A CN 201710540832A CN 107164336 A CN107164336 A CN 107164336A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacteriophage
escherichia coli
enterohemorrhagic escherichia
ecom
mcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710540832.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107164336B (zh
Inventor
孙利厂
王冉
葛展霞
何涛
庞茂达
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Academy of Agricultural Sciences filed Critical Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201710540832.6A priority Critical patent/CN107164336B/zh
Publication of CN107164336A publication Critical patent/CN107164336A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107164336B publication Critical patent/CN107164336B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10131—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一株保藏编号为CCTCC NO:M 2017190的大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_C1，该噬菌体为双链DNA，肌尾病毒科，具有呈正二十面体的头部和可伸缩的尾部，在固体培养基上可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为0.5‑1mm；该噬菌体对空间环境中肠出血性大肠杆菌，特别是mcr‑1阳性肠出血性大肠杆菌具有较好的消杀效果，应用于制备防治肠出血性大肠杆菌感染的药物中可实现广谱杀菌的效果。

Description

一种大肠杆菌噬菌体及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别是一种肠出血性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_C1及其应用。
背景技术
肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)是产志贺毒素大肠杆菌(Shiga-toxin producing Escherichia coli, STEC)的一类亚群,1982年被证实是一种重要的人畜共患病原菌,可以引起人不同程度腹泻、出血性结肠炎(Hemorrhagiccolitis, HC),溶血性尿毒综合症(Haemolytic uraemic syndrome, HUS)等,严重的可导致死亡。
肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli）广泛分布于自然界的土壤、水和农产品及林产品中，在人和动物的肠道及呼吸道内也常见，是典型的条件致病菌，常于动物抵抗力下降时引起暴发性流行，如鹅腹泻、家兔的肠炎、雏鸡腹泻、绵羊的传染性口炎、大熊猫的腹泻、猪腹泻等。
青霉素类、头孢类和碳青霉烯类等β-内酰胺类药物是防治肠出血性大肠杆菌感染最主要的药物，其中青霉素类和头孢类药物在治疗肠出血性大肠杆菌感染中广泛使用，但由于长期的药物选择性压力，病原菌表现出了对这些药物严重的耐药性。
华南农业大学刘健华教授和中国农业大学沈建忠教授（Liu YY, Wang Y, WalshTR, Yi LX, Zhang R, Spencer J, Doi Y, Tian G, Dong B, Huang X, Yu LF, Gu D,Ren H, Chen X, Lv L, He D, Zhou H, Liang Z, Liu JH, Shen J. 2016. Emergenceof plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and humanbeings in China: a microbiological and molecular biological study. LancetInfect Dis 16:161-168.）在动物和住院患者中发现多粘菌素耐药的新基因mcr-1（LiuYY, Wang Y, Walsh TR, Yi LX, Zhang R, Spencer J, Doi Y, Tian G, Dong B, HuangX, Yu LF, Gu D, Ren H, Chen X, Lv L, He D, Zhou H, Liang Z, Liu JH, Shen J.2016. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 inanimals and human beings in China: a microbiological and molecular biologicalstudy. Lancet Infect Dis 16:161-168.）该基因由质粒所携带，可以在不同菌株间进行水平转移。此前仅报道过由基因突变导致的多粘菌素耐药，而这种耐药性是不会在细菌间进行传播的。由于多粘菌素被认为是对抗多重耐药细菌的最后一道防线，因此，质粒携带的mcr-1基因一经发现，立即引起全球广泛关注。根据该文献报道mcr-1基因主要存在于中国，可能已传播至东南亚国家，目前尚无良好的防控方法。
噬菌体是一种杀灭细菌的病毒，寄生于细菌并利用细菌来复制繁殖，最后将细菌裂解死亡，由于其天然的杀菌特性，而被科学家认为是潜在的“超级细菌的有效克星”，而噬菌体对宿主细菌的特异性高、强大的裂解能力以及对人类和动物（产品）没有毒副作用、不会产生药物残留等优势而显示出了比抗生素更加广阔的应用前景和价值。
噬菌体制剂的研制开发和应用无疑是解决这一问题的理想方法，在噬菌体产品开发方面，东欧一些国家已经批准某些噬菌体产品应用于人类皮肤金葡菌感染的治疗，美国也批准某些产品应用于动物性食品的表面消毒，如2006年美国FDA批准李斯特噬菌体制剂在禽产品和芝士上应用，用于消毒。目前利用噬菌体消杀环境中肠出血性大肠杆菌（特别是mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌）尚未见报道。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种能裂解肠出血性大肠杆菌的噬菌体vB_EcoM_C1，该噬菌体具有较宽的裂解谱，不仅可以裂解mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌，也可以裂解不携带mcr-1的肠出血性大肠杆菌，既可以裂解标准菌株ATCC 25922，也可以裂解从环境中或者发病动物粪便中分离的肠出血性大肠杆菌临床株，可以单独或与其他物质复配使用，为消毒净化环境提供一种安全、无毒的噬菌体消杀产品，本发明是这样实现的：
一种大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_C1，其保藏号为CCTCC M 2017190；申请人将该噬菌体自命名为vB_EcoM_C1；该噬菌体具有呈正二十面体的头部和可伸缩的尾部；噬菌体在1.2%的LB琼脂培养基上可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为0.5-1mm；基因组核酸的酶切图谱显示该噬菌体核酸是双链DNA（dsDNA）；根据国际病毒分类委员会(ICTV)2005年发表的《病毒分类—国际病毒分类委员会第八次报告》，vB_EcoM_C1属于肌尾病毒科（Myoviridae）。该噬菌体在30-70℃中放置60min，活性稳定，在80℃中则失活；处于pH5.0-10.0时，其效价与初始效价无显著性差异。
进一步，本发明所述肠出血性大肠杆菌噬菌体在制备防治由肠出血性大肠杆菌感染的药物（包括粉剂和液体剂型）中的应用，特别是在制备防治由mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌引起的动物腹泻药物中的应用，上述药物可以用于防治人和动物（鸡、猪、牛、鹅、鸭）肠出血性大肠杆菌感染。
进一步，本发明所述肠出血性大肠杆菌噬菌体在杀灭环境中肠出血性大肠杆菌中的应用，特别是杀灭养殖场环境中mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌中的应用；所述养殖场环境是指畜禽体表、饲料、养殖器具、地面、墙面、粪便、垫料及其他空间环境。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
（1）肠出血性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_C1具有较强的杀灭活性和较宽的裂解谱，既可以特异性裂解mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌，也可以杀灭不含mcr-1基因的其它多重耐药的肠出血性大肠杆菌，应用于制备防治肠出血性大肠杆菌感染的药物中可实现广谱杀菌的效果。
（2）该噬菌体vB_EcoM_C1经小鼠试验，毒副作用小，安全性高；由于mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌噬菌体具有较好的亲水相，容易配制成喷洒液、药浴液或注射液，对环境的mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌的污染可进行有效杀灭。
附图说明
图1. vB_EcoM_C1噬菌斑照片。
图2. 噬菌体vB_EcoM_C1的透射电镜照片。
图3. 温度对噬菌体vB_EcoM_C1活性影响示意图。
图4. pH值对噬菌体vB_EcoM_C1活性影响示意图。
图5. 培养基中噬菌体vB_EcoM_C1杀菌效果示意图。
图6. 鹅料槽中噬菌体vB_EcoM_C1杀菌效果示意图。
具体实施方式
为方便理解本发明的技术方案，以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述实施例中所涉及的试剂、器材，若非特别说明，均由商业渠道购买获得。实施例涉及的菌株、试剂及培养基：
实施例中涉及的宿主菌为mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌临床株，为江苏地区某鹅场病鹅腹泻粪便中分离得到，由江苏省农业科学院保藏。
1mol/L 无菌CaCl2溶液（1L）：用天平称量111gCaCl2固体，倒入烧杯加水溶解，将溶液倒入1L容量瓶并用蒸馏水润洗烧杯2-3次，润洗液一并倒入容量瓶,再向容量瓶里加蒸馏水至刻度为止，混匀后高压灭菌备用。
蛋白胨水（200mL）：称取4g蛋白胨，1g氯化钠于200mL蒸馏水中，调节pH为7.4后，121℃高压灭菌15min，冷却备用。
1.2% LB琼脂培养基/平板（200mL）：称取2g胰蛋白胨，2g氯化钠，1g酵母粉及2.4g琼脂于200mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷却备用。
0.6% LB琼脂培养基/平板（200mL）：称取2g胰蛋白胨，2g氯化钠，1g酵母粉及1.2g琼脂于200mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷却备用。
LB液体培养基（200mL）：称取2g胰蛋白胨，2g氯化钠，1g酵母粉于200mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷却备用。
SM溶液（1L）：称取6.055gTris于20mL蒸馏水溶解，使用浓盐酸调节pH为7.5，定容至50 mL，然后加入5.8gNaCl和2gMgSO4, 溶解后定容至1L，121℃高压灭菌15min，冷却备用。
实施例1 噬菌体分离及制备
将宿主菌划线接种于1.2%LB琼脂培养基上，培养过夜后，挑取单克隆接种于1ml LB液体培养基中，37℃振荡培养5-6 h后作为宿主菌培养物备用。
2016年夏季，采集江苏省常州市某鹅场污水，取上清经双层滤纸过滤，10000rpm离心20min，再用0.22μm滤膜过滤上清；取10mL过滤后的上清，加入0.5mL宿主菌过夜培养物，再加入无菌CaCl2母液至终浓度1.25mM混匀后，加入20ml LB液体培养基，室温作用30min，再放置于37℃培养6～8h后；然后取培养物以12000rpm，4℃，离心30min，取上清；取此上清10mL，再次加入0.5mL宿主菌过夜培养物，加入无菌CaCl2母液至终浓度1.25mM混匀后，加入20ml LB液体培养基，按上述培养方法培养离心，获得富集的上清；按照以上的试验方法再富集一次，将富集三次的上清用0.22μm滤膜过滤，形成噬菌体原液。
将1.2% LB琼脂平板分为2个区域：吸取以上宿主菌培养物0.1mL滴于平板正中央，用涂棒将菌液均匀地涂开；待其晾干后，取上述噬菌体原液10mL滴于其中一个区域；待自然晾干后，置于37℃培养箱培养10h后，观察滴加噬菌体区域有无空斑形成。
如果有空斑形成，证明有噬菌体存在。取噬菌体原液100mL，进行一系列的10倍稀释。取10-2、10-4和10-6稀释液各0.1mL与宿主菌培养物0.1mL混匀，室温作用15min后，加入约4mL融化的0.6% LB琼脂培养基，混匀后迅速倾倒入1.2% LB琼脂培养基平板上层，摇匀平置10min，待其凝固，置于37℃温箱培养12h后观察，获得形成单个噬菌斑的双层平板。
实施例2 噬菌体扩增和纯化
在实施例1形成噬菌斑的双层平板上，用移液器的枪头挑取直径较大的单个噬菌斑，接种于3~5 ml LB液体培养基中，加入噬菌体宿主菌液0.1mL，混匀，室温作用15min，37℃培养10～14h，12000rpm，4℃ 离心10min，取上清，加入0.3%氯仿；重复双层实验，如此反复挑取4-5次单个噬菌斑，将噬菌体纯化成大小一样的噬菌斑。
取1mL新鲜培养的宿主菌，加0.3mL噬菌体裂解液（以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1:1、1:10和1:100的比例）。37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100mL LB液体培养基，再加入CaCl2母液至终浓度1.25mM，37℃摇振培养12~16h，12000rpm，4℃ 离心10min，取上清，即为噬菌体裂解液。
PEG纯化：在50ml裂解液中加入RNase A、DNaseⅠ至终浓度均为1μg/mL，37℃温育30min；加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1h或4℃过夜；4℃离心10000rpm 10min，去上清液；加2mL SM液，充分洗涤沉淀，室温作用1h；加入等体积的氯仿抽提，温和振荡30s；4℃ ，5000rpm离心10min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体。
CsCl等密度梯度离心纯化: 离心管底部先缓慢加入1.6gm/cc CsCl 10mL，再依次加入1.4gm/cc CsCl 10mL，25% 蔗糖5mL，噬菌体裂解液10mL，平衡；加入离心管套中，缓慢悬挂于转子中；打开超速离心机（Optima L-80 XP Ultracentrifuge,Beckman）开关，设置转速30000rpm，时间120min，温度18℃；离心结束后待真空下降为0时，打开仓门，取出样品，关机；样品下端有一层白色带，即1.4gm/cc与1.6gm/cc间，用细针头从带侧面插入，小心吸取，20mL样品最终获得约5-8mL；将样品置于透析袋中，用10mM Tris-HCl，PH为7.4，100mMMgCl2缓冲液进行透析，2L一次（10-14kd）；最终将样品吸出，体积约为10mL，测定噬菌体效价。
采用双层平板法检测噬菌体效价：将以上纯化的噬菌体液进行10倍梯度稀释，取相应的几个梯度的噬菌体稀释液各0.1 mL与宿主菌液0.1 mL充分混匀，铺双层琼脂平板，37℃恒温培养10 h左右，对每个琼脂平皿进行噬菌斑计数。选择出现100-200左右噬菌斑的平皿，根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度即得噬菌体效价。纯化的噬菌体如图1所示，噬菌体在1.2%的LB琼脂培养基中可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为1-2mm。
申请人将纯化的噬菌体自命名为vB_EcoM_C1，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：中国·武汉·武汉大学，邮编430072，保藏号：CCTCC M 2017190，分类命名：大肠杆菌噬菌体（Escherichia coli phage），保藏日期为2017年4月13日。
实施例3 噬菌体vB_EcoM_C1透射电镜观察
取实施例2中PEG纯化的噬菌体做电镜观察，具体操作步骤为：加10μL 样本滴在铜网上，待其沉淀15 min, 用滤纸吸去多余的液体，用 2%的磷钨酸（PTA）染色1-2min，干燥后使用透射电镜（日立H-7650）观察；观测结果如图2 所示，头部呈正二十面体，头部直径约为80nm，尾长约为110nm。根据国际病毒分类委员会(ICTV) 2005年发表的《病毒分类—国际病毒分类委员会第八次报告》，vB_EcoM_C1属于肌尾病毒科（Myoviridae）。
实施例4 噬菌体vB_EcoM_C1的温度和酸碱耐受性实验
取1mL实施例2获得的纯化的噬菌体（5.2×108 PFU/mL）于30℃～80℃水浴分别作用30min和60min，将样品冷却后测其效价；分别取pH2.0～13.0的蛋白胨水和2.5×108 PFU/mL纯化噬菌体等量混合，37℃水浴作用2h后测其效价。
温度检测结果如图3所示，噬菌体vB_EcoM_C1在32～55℃分别作用30min和60min后，其活性无显著变化；在65℃和75℃作用下，活性有显著降低；80℃作用30min后，无噬菌体存活。
pH检测结果如图4所示，在pH为2.5和3时，检测不到噬菌体；pH为4.2和5.3时，其效价与初始效价相差较大，PH为6.0～10.5时，其效价与初始效价无显著性差异；而当pH大于11时，检测不到噬菌体。
实施例5 噬菌体vB_EcoM_C1宿主谱分析
将实施例2获得的噬菌体vB_EcoM_C1效价调整为1010 PFU/mL备用。
试验选择20株乳房炎病牛中分离的肠出血性大肠杆菌临床株和标准菌株ATCC25922(购自ATCC，）为对象，其中10株临床株携带有mcr-1基因，另外10株临床株为mcr-1基因阴性，对噬菌体vB_EcoM_C1的宿主谱进行分析，具体操作如下：分别取20株肠出血性大肠杆菌临床株和2株标准菌株的过夜培养物100μL，滴加在1.2% LB培养基平板中央，用涂棒分别将它们涂制成均匀的菌苔。然后将每个平板平均分成两个区域，其中一个区域，取10μL噬菌体vB_EcoM_C1滴加在菌苔表面，另一个区域滴加10μL生理盐水作对照，待液滴干燥后倒置于37℃培养12~16h，观察结果，如有噬菌斑产生则记为“+”，否则为“-”，结果如表1所示:
表1. 噬菌体vB_EcoM_C1的宿主谱分析
表1中菌株1-20均为申请人自命名的临床株，其中1-10为mcr-1基因阳性，11-20为mcr-1基因阴性。
由表1可见，噬菌体vB_EcoM_C1对20株肠出血性大肠杆菌临床株中的13株有裂解作用，裂解率为65%，其中包括7株mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌，同时vB_EcoM_C1对标准菌株ATCC 25922也有裂解能力，说明该噬菌体具有宽裂解谱的特性。
实施例6 噬菌体vB_EcoM_C1在培养基中的杀菌效果
取一株mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌的过夜培养物 1.0mL，用LB液体培养基将其OD600nm值调整为0.5（约为 5×108PFU/mL），分别加入噬菌体vB_EcoM_C1 5×104PFU/mL（MOI=0.0001）、5×105PFU/mL（MOI=0.001）、5×106PFU/mL（MOI=0.01）、5×107PFU/mL（MOI=0.1）和5×108PFU/mL（MOI=1），5×109PFU/mL（MOI=10）和5×1010PFU/mL（MOI=100）于37℃静置培养，同时以不加噬菌体作为对照组。在培养的0、1、2、3、4、5、6、7h 检测OD600nm值的变化。
结果见图5，与正常细菌对照组相比，噬菌体vB_EcoM_C1处理组，30min后，肠出血性大肠杆菌数量开始下降，且噬菌体浓度越大，细菌数量降低越明显，当MOI>0.01时，1h时肠出血性大肠杆菌的数量已控制到较低值，且2 h时OD600nm的吸光值接近于0，说明噬菌体vB_EcoM_C1在培养基中杀菌迅速而且彻底。
实施例7 噬菌体vB_EcoM_C1控制养殖环境中的mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌的污染
以鹅场作为试验地点，选择一株mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌临床株为试验菌株，将浓度为105CFU/mL的mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌取1mL均匀喷洒在鹅料槽表面（约1m2），然后以1mL浓度为108 PFU/mL噬菌体vB_EcoM_C1（培养基为LB液体培养基）对料槽表面实施喷杀，1h后，使用平板计数法检测料槽表面mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌的数量。
检测结果如图6显示，1h后，料槽表面mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌的数量降到103CFU以下，5h后，料槽表面mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌的数量降到10 CFU以下，说明该噬菌体可以有效杀灭养殖环境（奶牛料槽表面）中的mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌。
实施例8 噬菌体vB_EcoM_C1控制养殖环境中的mcr-1阴性肠出血性大肠杆菌的污染
以鹅场作为试验地点，选择一株不携带mcr-1基因的肠出血性大肠杆菌临床株为试验菌株，将浓度为105CFU/mL的肠出血性大肠杆菌取1mL均匀喷洒在鹅料槽表面（约1m2），然后以1mL浓度为108PFU/mL噬菌体vB_EcoM_C1对料槽表面实施喷杀，1h后，使用平板计数法检测肠出血性大肠杆菌的数量。
检测结果显示，2h后，料槽表面肠出血性大肠杆菌的数量降到103CFU以下，5h后，料槽表面肠出血性大肠杆菌的数量降到10 CFU以下，说明该噬菌体可以有效杀灭养殖环境（奶牛料槽表面）中的肠出血性大肠杆菌。
实施例9 噬菌体vB_EcoM_C1控制mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌对饲料的污染
将过夜培养的mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌调整浓度为105CFU/mL，用小型喷雾器(瓶)将1mL菌液均匀喷洒在摊开的100g鹅育肥饲料（上海金盟饲料有限公司）表面，摊开面积约1m2, 然后将纯化的噬菌体vB_EcoM_C1以108 PFU/mL的浓度实施喷杀，喷施量1mL，2 h后开始检测饲料中mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌的数量。
检测结果显示，在以108 PFU/mL浓度实施喷杀2 h后，饲料中宿主菌的数量降到10CFU/g以下，说明该噬菌体可以有效杀灭饲料中污染的mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌。
实施例10 噬菌体vB_EcoM_C1的安全性实验
6-8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠，平均体重27±2g，共40只，购自扬州大学比较医学中心。将小鼠随机分为2组，每组20只；其中一组口服噬菌体vB_EcoM_C1 108PFU/0.25mL/只(实施例2提供)；对照组口服等体积PBS。连续口服14d后，每组脱颈致死5只小鼠，观察内脏、消化道及黏膜变化情况；每组剩余的15只继续饲喂，每天取其粪便检测噬菌体数量变化。
结果显示，此剂量噬菌体对小鼠健康及日常行为没有影响，解剖检查未见任何异常，且在口服噬菌体结束7天后，在小鼠粪便中检测不到噬菌体。
因此认为，该大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_C1可应用于制备防治肠出血性大肠杆菌感染药物。
在实际使用中，大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_C1还可以用于杀灭环境中的肠出血性大肠杆菌（特别是mcr-1阳性肠出血性大肠杆菌），所述环境包括养殖场环境（如畜禽体表、饲料、养殖器具、地面、墙面、粪便、垫料）及空间环境。

Claims (7)

1.一株大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_C1，其保藏编号为CCTCC NO: M 2017190。
2.如权利要求1所述大肠杆菌噬菌体在制备防治肠出血性大肠杆菌感染药物中的应用。
3.如权利要求1所述大肠杆菌噬菌体在杀灭空间环境中肠出血性大肠杆菌中的应用。
4.如权利要求1所述大肠杆菌噬菌体在杀灭禽畜体表肠出血性大肠杆菌中的应用。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述空间环境包括养殖环境，所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、粪便和垫料。
6.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述空间环境包括饲料和饮水。
7.如权利要求3所述应用，其特征在于，将浓度为107PFU/mL的肠出血性大肠杆菌噬菌体液喷施于空间环境中，施用量为1mL/m2，用于杀灭空间环境中肠出血性大肠杆菌。
CN201710540832.6A 2017-07-05 2017-07-05 一种大肠杆菌噬菌体及其应用 Active CN107164336B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710540832.6A CN107164336B (zh) 2017-07-05 2017-07-05 一种大肠杆菌噬菌体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710540832.6A CN107164336B (zh) 2017-07-05 2017-07-05 一种大肠杆菌噬菌体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107164336A true CN107164336A (zh) 2017-09-15
CN107164336B CN107164336B (zh) 2019-11-12

Family

ID=59822692

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710540832.6A Active CN107164336B (zh) 2017-07-05 2017-07-05 一种大肠杆菌噬菌体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107164336B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109251899A (zh) * 2018-09-30 2019-01-22 南京医科大学 耐药大肠杆菌噬菌体及其应用
CN110607284A (zh) * 2019-10-23 2019-12-24 青岛农业大学 大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_swi3及其应用
CN113881641A (zh) * 2021-10-19 2022-01-04 广西大学 一株大肠杆菌噬菌体ep01及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1590445A2 (en) * 2003-01-16 2005-11-02 Fredric R. Bloom Bacteria for high efficiency cloning
CN101724607A (zh) * 2009-12-18 2010-06-09 江苏省农业科学院 一种产肠毒素性大肠杆菌etec-k99的噬菌体ek99-c及其应用
CN102002509A (zh) * 2010-05-25 2011-04-06 江南大学 一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用
CN106544351A (zh) * 2016-12-08 2017-03-29 江苏省农业科学院 CRISPR‑Cas9体外敲除耐药基因mcr‑1的方法及其专用细胞穿透肽
CN106591241A (zh) * 2015-10-15 2017-04-26 中国科学院大学 污水处理系统中一株新型肠出血性大肠杆菌o157噬菌体pe-3的分离及鉴定
CN106754745A (zh) * 2016-11-29 2017-05-31 江苏省农业科学院 一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1590445A2 (en) * 2003-01-16 2005-11-02 Fredric R. Bloom Bacteria for high efficiency cloning
CN101724607A (zh) * 2009-12-18 2010-06-09 江苏省农业科学院 一种产肠毒素性大肠杆菌etec-k99的噬菌体ek99-c及其应用
CN102002509A (zh) * 2010-05-25 2011-04-06 江南大学 一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用
CN106591241A (zh) * 2015-10-15 2017-04-26 中国科学院大学 污水处理系统中一株新型肠出血性大肠杆菌o157噬菌体pe-3的分离及鉴定
CN106754745A (zh) * 2016-11-29 2017-05-31 江苏省农业科学院 一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用
CN106544351A (zh) * 2016-12-08 2017-03-29 江苏省农业科学院 CRISPR‑Cas9体外敲除耐药基因mcr‑1的方法及其专用细胞穿透肽

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李冰等: "致病性大肠杆菌噬菌体分离及裂解特性分析", 《中国家禽》 *
肖雷等: "噬菌体对致病性耐药大肠杆菌的裂解试验", 《上海畜牧兽医通讯》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109251899A (zh) * 2018-09-30 2019-01-22 南京医科大学 耐药大肠杆菌噬菌体及其应用
CN109251899B (zh) * 2018-09-30 2021-08-03 南京医科大学 耐药大肠杆菌噬菌体及其应用
CN110607284A (zh) * 2019-10-23 2019-12-24 青岛农业大学 大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_swi3及其应用
CN113881641A (zh) * 2021-10-19 2022-01-04 广西大学 一株大肠杆菌噬菌体ep01及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107164336B (zh) 2019-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108359644B (zh) 一种宽谱沙门氏菌噬菌体及其应用
CN106754745B (zh) 一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用
CN110438091B (zh) 一株新的肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用
CN101724607B (zh) 一种产肠毒素性大肠杆菌的噬菌体ek99-c及其应用
CN105008525B (zh) 噬菌体、包括其的组合物及其用途、抗生素、饲料添加剂、饮用水添加剂、消毒剂及清洁剂
CN105008526B (zh) 噬菌体、包括其的组成物及其应用
CN106574251B (zh) 噬菌体、包括其的组合物及其用途、抗生素、添加剂、禽饲料、禽饮用水、消毒剂及清洗剂
CN105331587B (zh) 一种副溶血弧菌噬菌体及其制备方法和应用
CN112029732A (zh) 一种耐高温宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体及其组合物
CN112280749B (zh) 大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_swi3及其应用
CN105324481B (zh) 噬菌体、包括其的组成物及其应用
US20180282703A1 (en) Novel bacteriophage and antibacterial composition comprising the same
CN101519651B (zh) 一种福氏志贺氏菌噬菌体菌株及其应用
CN110607284A (zh) 大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_swi3及其应用
CN109251898A (zh) 一株金黄色葡萄球菌噬菌体及其用途
CN110144333B (zh) 一株铜绿假单胞菌噬菌体及其应用
CN110129283A (zh) 一种短尾大肠杆菌噬菌体及其应用
CN107164336B (zh) 一种大肠杆菌噬菌体及其应用
CN113583971B (zh) 一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用
CN105456301A (zh) 一种噬菌体制剂及其应用
CN111254121A (zh) 一种沙门氏菌噬菌体及在防治沙门氏菌感染的疾病的药物中的应用
CN111647567A (zh) 一种耐酸的沙门氏菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
CN104845943B (zh) 一种链球菌噬菌体及其应用
CN111363724B (zh) 一种新型噬菌体、噬菌体混合制剂及其在防治水貂出血性肺炎的药物中的应用
CN108103029A (zh) 一株可裂解牛源无乳链球菌的噬菌体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant