CN106754745A - 一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用 - Google Patents

一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株能裂解NDM‑1阳性肺炎克雷伯氏菌临床分离菌的强裂解性噬菌体及其作为生物制剂在防治NDM‑1肺炎克雷伯氏菌引发的感染和污染中的应用，该噬菌体保藏号为CCTCC M 2015760，具有正二十面体的头部和可伸缩的尾部，属于肌尾科双链DNA噬菌体；该噬菌体具有较强的杀灭活性和较宽的噬菌裂解谱，可用于制备防治由NDM‑1阳性肺炎克雷伯氏菌引起的细菌感染的药物，以及杀灭养殖环境和医疗环境中的NDM‑1阳性肺炎克雷伯氏菌。

Description

一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别是一株肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_he1(klebsiella peneumoniae phage vB_KpnM_he1)及其应用。
背景技术
克雷伯氏菌属(Klebsiella)为肠杆菌科中一类有荚膜的革兰氏阴性杆菌，其中肺炎克雷伯氏菌(又称肺炎杆菌)、臭鼻克雷伯氏杆菌和鼻硬结克雷伯氏菌与人类关系密切，特别是肺炎克雷伯氏菌，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上，为呼吸道感染的重要病原体，常引起重症肺炎，还可引起泌尿道感染、胆道感染、败血症和化脓性脑膜炎等严重疾病。
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae)广泛分布于自然界的土壤、水和农产品及林产品中，在人和动物的肠道及呼吸道内也常见，是典型的条件致病菌，常于动物抵抗力下降时引起暴发性流行，如奶牛的乳房炎、家兔的肠炎、肺炎，雏鸡腹泻，绵羊的传染性口炎，大熊猫的腹泻、肝炎，猪腹泻，貂肺炎和豚鼠肺炎等。以奶牛为例，肺炎克雷伯氏菌感染可引起奶牛乳房炎，造成产奶量下降，牛奶品质降低，而且病原菌还具有通过食物链(奶产品)传递给人类的风险，从而对人类健康造成潜在危害。
青霉素类、头孢类和碳青霉烯类等β-内酰胺类药物是防治肺炎克雷伯氏菌感染最主要的药物，其中青霉素类和头孢类药物在治疗肺炎克雷伯氏菌感染中广泛使用，但由于长期的药物选择性压力，病原菌表现出了对这些药物严重的耐药性。
NDM-1基因为新德里金属β-内酰胺酶基因，该基因编码的蛋白为一种水解酶，可以水解几乎所有的β-内酰胺类药物，并且携带NDM-1基因的细菌一般同时携带其它种类的耐药基因，表现出对多种药物的耐药性(Multi-drug resistance)，因此，含有NDM-1基因的细菌被称为“超级细菌”。肺炎克雷伯氏菌本身就是一种重要的人兽共患性细菌，而携带NDM-1基因的肺炎克雷伯氏菌(如2015年浙江省首次检出1株携带NDM-1基因的肺炎克雷伯氏菌《中国人兽共患病学报》)能够对人医临床上使用的β-内酰胺类药物产生耐药性，导致临床治疗的失败。
目前人医临床上针对NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌的感染，主要采取的治疗措施仍是抗生素疗法，即选择对该菌敏感的非β-内酰胺类药物进行治疗，但是抗生素长期使用亦可能激发或诱导病原菌的进一步超乎人类想象的变异，产生更为可怕的“超级耐药细菌”(Super bugs)，因此，寻找一种有效的抗生素替代疗法成为摆在全球科学工作者面前的重要科学问题。
噬菌体是一种杀灭细菌的病毒，寄生于细菌并利用细菌来复制繁殖，最后将细菌裂解死亡，由于其天然的杀菌特性，而被科学家认为是潜在的“超级细菌的有效克星”，而噬菌体对宿主细菌的特异性高、强大的裂解能力以及对人类和动物(产品)没有毒副作用、不会产生药物残留等优势而显示出了比抗生素更加广阔的应用前景和价值。
噬菌体制剂的研制开发和应用无疑是解决这一问题的理想方法，在噬菌体产品开发方面，东欧一些国家已经批准某些噬菌体产品应用于人类皮肤金葡菌感染的治疗，美国也批准某些产品应用于动物性食品的表面消毒，如2006年美国FDA批准李斯特噬菌体制剂在禽产品和芝士上应用，用于消毒。
吉林大学2013年公开了一株NDM-1肺炎克雷伯氏菌的噬菌体(路荣，《NDM-1肺炎克雷伯氏菌裂解性噬菌体的分离鉴定及其对小鼠菌血症的治疗研究》，硕士论文，2013.6)，路荣公开的噬菌体NKP-1是用ATCCBAA-2146(美国ATCC保藏中心)为宿主分离的，噬菌体NKP-1裂解谱很窄，仅能裂解ATCC BAA-2146宿主菌，这就限制了该噬菌体的进一步应用。另有，吉林大学的逯茵茵(逯茵茵，《肺炎克雷伯氏菌裂解性噬菌体的分离和鉴定》，硕士论文，2015.6)公开的噬菌体和其中 属于长尾科病毒，属于足尾科病毒，而属于滴状病毒，与本发明发现的病毒外观形状差异迥异，不属于同一类噬菌体。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种能裂解肺炎克雷伯氏菌的噬菌体vB_KpnM_he1，该噬菌体具有较宽的裂解谱，不仅可以裂解NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌，也可以裂解不携带NDM-1的肺炎克雷伯氏菌，既可以裂解标准菌株ATCC BAA-2146，也可以裂解从乳房炎牛奶和奶牛粪便中分离的肺炎克雷伯氏菌临床株，可以单独或与其他物质复配使用，为消毒净化环境提供一种安全、无毒的噬菌体产品，本发明是这样实现的：
一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体，所述噬菌体保藏号为CCTCC No:M2015760，申请人将该噬菌体自命名为vB_KpnM_he1。该噬菌体具有呈正二十面体的头部和可伸缩的尾部；噬菌体在固体培养基上可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为1-2mm；基因组核酸的酶切图谱显示该噬菌体核酸是双链DNA(dsDNA)；根据国际病毒分类委员会(ICTV)2005年发表的《病毒分类—国际病毒分类委员会第八次报告》，vB_KpnM_he1属于肌尾病毒科(Myoviridae)。该噬菌体在30-70℃中放置60min，活性稳定，在80℃中则失活；处于pH5.0-10.0时，其效价与初始效价无显著性差异。
本发明所述保藏号为CCTCC No:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌体在制备防治NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌感染的药物中的应用。
本发明所述保藏号为CCTCC No:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌体在杀灭环境中NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌中的应用。
进一步，本发明所述保藏号为CCTCC No:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌体在制备防治NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌感染的药物中的应用，所述药物剂型为粉剂或液体剂型。
进一步，本发明所述保藏号为CCTCC No:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌体在制备防治NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌感染的药物中的应用是指，所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体在制备防止奶牛乳房炎药物中的应用。
进一步，本发明所述保藏号为CCTCC No:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌体在杀灭环境中NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌中的应用，所述环境包括养殖环境和医疗环境。
进一步，本发明所述保藏号为CCTCC No:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌体在杀灭环境中NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌中的应用，所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、垫料、饲料、饮水或空间环境。
进一步，本发明所述保藏号为CCTCC No:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌体在杀灭环境中NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌中的应用是指，将浓度为108PFU/mL的肺炎克雷伯氏菌噬菌体液喷施于环境中，施用量为1mL/m2
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_he1具有较强的杀灭活性和较宽的裂解谱，既可以特异性裂解NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌，也可以杀灭不含NDM-1基因的其它多重耐药的肺炎克雷伯氏菌，应用于制备防治肺炎克雷伯氏菌感染的药物中可实现广谱杀菌的效果。
(2)该噬菌体vB_KpnM_he1经小鼠试验，毒副作用小，安全性高；由于NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌噬菌体具有较好的亲水相，容易配制成喷洒液、药浴液或注射液，对环境的NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌的污染可进行有效杀灭。
附图说明
图1.噬菌体vB_KpnM_he1噬菌斑照片。
图2.噬菌体vB_KpnM_he1的透射电镜照片。
图3.温度对噬菌体vB_KpnM_he1活性影响示意图。
图4.pH值对噬菌体vB_KpnM_he1活性影响示意图。
图5.培养基中噬菌体vB_KpnM_he1杀菌效果示意图。
图6.奶牛料槽中噬菌体vB_KpnM_he1杀菌效果示意图。
具体实施方式
为方便理解本发明的技术方案，以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述实施例中所涉及的试剂、器材，若非特别说明，均由商业渠道购买获得。
实施例中涉及的宿主菌为NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌临床株，为江苏地区某奶牛场的奶牛乳房炎奶样中分离得到。
1mol/L无菌CaCl2溶液(1L)：用天平称量111gCaCl2固体，倒入烧杯加水溶解，将溶液倒入1L容量瓶并用蒸馏水润洗烧杯2-3次，润洗液一并倒入容量瓶,再向容量瓶里加蒸馏水至刻度为止，混匀后高压灭菌备用。
蛋白胨水(200mL)：称取4g蛋白胨，1g氯化钠于200mL蒸馏水中，调节pH为7.4后，121℃高压灭菌15min，冷却备用。
1.2％LB琼脂培养基(200mL)：称取2g胰蛋白胨，2g氯化钠，1g酵母粉及2.4g琼脂于200mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷却备用。
0.6％LB琼脂培养基(200mL)：称取2g胰蛋白胨，2g氯化钠，1g酵母粉及1.2g琼脂于200mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷却备用。
LB液体培养基(200mL)：称取2g胰蛋白胨，2g氯化钠，1g酵母粉于200mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷却备用。
SM溶液(1L)：称取6.055gTris于20mL蒸馏水溶解，使用浓盐酸调节pH为7.5，定容至50mL，然后加入5.8gNaCl和2gMgSO4,溶解后定容至1L，121℃高压灭菌15min，冷却备用。
实施例1噬菌体分离及制备
将宿主菌划线接种于1.2％LB琼脂培养基上，培养过夜后，挑取单克隆接种于1mlLB液体培养基中，37℃振荡培养5-6h后作为宿主菌培养物备用。
2015年夏季，采集江苏省南京市某奶牛场污水，取上清经双层滤纸过滤，10000rpm离心20min，再用0.22μm滤膜过滤上清；取10mL过滤后的上清，加入0.5mL宿主菌过夜培养物，再加入无菌CaCl2母液至终浓度1.25mM混匀后，加入20ml LB液体培养基，室温作用30min，再放置于37℃培养6～8h后；然后取培养物以12000rpm，4℃，离心30min，取上清；取此上清10mL，再次加入0.5mL宿主菌过夜培养物，加入无菌CaCl2母液至终浓度1.25mM混匀后，加入20ml LB液体培养基，按上述培养方法培养离心，获得富集的上清；按照以上的试验方法再富集一次，将富集三次的上清用0.22μm滤膜过滤，形成噬菌体原液。
将1.2％LB琼脂平板分为2个区域：吸取以上宿主菌培养物0.1mL滴于平板正中央，用涂棒将菌液均匀地涂开；待其晾干后，取上述噬菌体原液10μL滴于其中一个区域；待自然晾干后，置于37℃培养箱培养10h后，观察滴加噬菌体区域有无空斑形成。
如果有空斑形成，证明有噬菌体存在。取噬菌体原液100μL，进行一系列的10倍稀释。取10-2、10-4和10-6稀释液各0.1mL与宿主菌培养物0.1mL混匀，室温作用15min后，加入约4mL融化的0.6％LB琼脂培养基，混匀后迅速倾倒入1.2％LB琼脂培养基平板上层，摇匀平置10min，待其凝固，置于37℃温箱培养12h后观察，获得形成单个噬菌斑的双层平板。
实施例2噬菌体扩增和纯化
在实施例1形成噬菌斑的双层平板上，用移液器的枪头挑取直径较大的单个噬菌斑，接种于3～5ml LB液体培养基中，加入噬菌体宿主菌液0.1mL，混匀，室温作用15min，37℃培养10～14h，12000rpm，4℃离心10min，取上清，加入0.3％氯仿；重复双层实验，如此反复挑取4-5次单个噬菌斑，将噬菌体纯化成大小一样的噬菌斑。
取1mL新鲜培养的宿主菌，加0.3mL噬菌体裂解液(以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1:1、1:10和1:100的比例)。37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100mLLB液体培养基，再加入CaCl2母液至终浓度1.25mM，37℃摇振培养12～16h，12000rpm，4℃离心10min，取上清，即为噬菌体裂解液。
PEG纯化：在50ml裂解液中加入RNase A、DNaseⅠ至终浓度均为1μg/mL，37℃温育30min；加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1h或4℃过夜；4℃离心10000rpm10min，去上清液；加2mL SM液，充分洗涤沉淀，室温作用1h；加入等体积的氯仿抽提，温和振荡30s；4℃，5000rpm离心10min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体。
CsCl等密度梯度离心纯化:离心管底部先缓慢加入1.6gm/cc CsCl 10mL，再依次加入1.4gm/cc CsCl 10mL，25％蔗糖5mL，噬菌体裂解液10mL，平衡；加入离心管套中，缓慢悬挂于转子中；打开超速离心机(Optima L-80XP Ultracentrifuge,Beckman)开关，设置转速30000rpm，时间120min，温度18℃；离心结束后待真空下降为0时，打开仓门，取出样品，关机；样品下端有一层白色带，即1.4gm/cc与1.6gm/cc间，用细针头从带侧面插入，小心吸取，20mL样品最终获得约5-8mL；将样品置于透析袋中，用10mM Tris-HCl，PH为7.4，100mMMgCl2缓冲液进行透析，2L一次(10-14kd)；最终将样品吸出，体积约为10mL，测定噬菌体效价。
采用双层平板法检测噬菌体效价：将以上纯化的噬菌体液进行10倍梯度稀释，取相应的几个梯度的噬菌体稀释液各0.1mL与宿主菌液0.1mL充分混匀，铺双层琼脂平板，37℃恒温培养10h左右，对每个琼脂平皿进行噬菌斑计数。选择出现100-200左右噬菌斑的平皿，根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度即得噬菌体效价。纯化的噬菌体如图1所示，噬菌体在1.2％的LB琼脂培养基中可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为1-2mm。
申请人将纯化的噬菌体自命名为vB_KpnM_he1，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：中国·武汉·武汉大学，邮编，430072。保藏号：CCTCC No:M2015760，分类命名：肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_he1(Klebsiella peneumoniae phage vB_KpnM_he1)，保藏日期为2015年12月16日。
实施例3噬菌体vB_KpnM_he1透射电镜观察
取实施例2中PEG纯化的噬菌体做电镜观察，具体操作步骤为：加10μL样本滴在铜网上，待其沉淀15min,用滤纸吸去多余的液体，用2％的磷钨酸(PTA)染色1-2min，干燥后使用透射电镜(日立H-7650)观察；观测结果如图2所示，头部呈正二十面体，头部直径约为80nm，尾长约为110nm。根据国际病毒分类委员会(ICTV)2005年发表的《病毒分类—国际病毒分类委员会第八次报告》，vB_KpnM_he1属于肌尾病毒科(Myoviridae)。
实施例4噬菌体vB_KpnM_he1的温度和酸碱耐受性实验
取1mL实施例2获得的纯化的噬菌体(5.2×108PFU/mL)于30℃～80℃水浴分别作用30min和60min，将样品冷却后测其效价；分别取pH2.0～13.0的蛋白胨水和2.5×108PFU/mL纯化噬菌体等量混合，37℃水浴作用2h后测其效价。
温度检测结果如图3所示，噬菌体vB_KpnM_he1在30～50℃分别作用30min和60min后，其活性无显著变化；在60℃和70℃作用下，活性有显著降低；80℃作用30min后，无噬菌体存活。
pH检测结果如图4所示，在pH为2和3时，检测不到噬菌体；pH为4.0和5.0时，其效价与初始效价相差较大，PH为6.0～10.0时，其效价与初始效价无显著性差异；而当pH为11、12、13时，检测不到噬菌体。
实施例5噬菌体vB_KpnM_he1宿主谱分析
将实施例2获得的噬菌体vB_KpnM_he1效价调整为1010PFU/mL备用。
试验选择20株乳房炎病牛中分离的肺炎克雷伯氏菌临床株和标准菌株ATCC BAA-2146D和ATCC BAA-1706B为对象，其中10株临床株携带有NDM-1基因，另外10株临床株为NDM-1基因阴性，对噬菌体vB_KpnM_he1的宿主谱进行分析，具体操作如下：分别取20株肺炎克雷伯氏菌临床株和2株标准菌株的过夜培养物100μL，滴加在1.2％LB培养基平板中央，用涂棒分别将它们涂制成均匀的菌苔。然后将每个平板平均分成两个区域，其中一个区域，取10μL噬菌体vB_KpnM_he1滴加在菌苔表面，另一个区域滴加10μL生理盐水作对照，待液滴干燥后倒置于37℃培养12～16h，观察结果，如有噬菌斑产生则记为“+”，否则为“-”，结果如表1所示:
表1.噬菌体vB_KpnM_he1的宿主谱分析
由表1可见，噬菌体vB_KpnM_he1对20株肺炎克雷伯氏菌临床株中的13株有裂解作用，裂解率为65％，其中包括7株NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌，分属于ST1661型(6株)和ST2108型(1株)，6株NDM-1阴性肺炎克雷伯氏菌，分属于ST2108型(4株)、ST530型(1株)和ST17型(1株)，同时vB_KpnM_he1对标准菌株ATCC BAA-2146和ATCCBAA-1706也有裂解能力，说明该噬菌体具有宽裂解谱的特性。
实施例6噬菌体vB_KpnM_he1在培养基中的杀菌效果
取一株NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌的过夜培养物1.0mL，用LB将其OD600nm值调整为0.5(约为5×108PFU/mL)，分别加入噬菌体vB_KpnM_he1 5×104PFU/mL(MOI＝0.0001)、5×105PFU/mL(MOI＝0.001)、5×106PFU/mL(MOI＝0.01)、5×107PFU/mL(MOI＝0.1)和5×108PFU/mL(MOI＝1)，5×109PFU/mL(MOI＝10)和5×1010PFU/mL(MOI＝100)于37℃静置培养，同时以不加噬菌体作为对照组。在培养的0、1、2、3、4、5、6、7h检测OD600nm值的变化。
结果见图5，与正常细菌对照组相比，噬菌体vB_KpnM_he1处理组，30min后，肺炎克雷伯氏菌数量开始下降，且噬菌体浓度越大，细菌数量降低越明显，当MOI>0.01时，1h时肺炎克雷伯氏菌的数量已控制到较低值，且2h时OD600nm的吸光值接近于0，说明噬菌体vB_KpnM_he1在培养基中杀菌迅速而且彻底。
实施例7噬菌体vB_KpnM_he1控制NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌感染试验
试验选择在南京市某奶牛场进行，试验对象为泌乳期荷斯坦奶牛，选取12头健康奶牛，使用一株强毒力NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌临床株(PCR检测其携带fimH、mrkD、ureA、wabG、uge和alls等毒力基因)进行乳房内攻毒，攻毒剂量为108CFU，人工建立奶牛乳房炎模型。每头牛的四个乳区都要进行攻毒，每天攻毒两次，连续攻毒三天。第四天后进行观察，以体细胞数作为评价指标，如果至少有一个乳区奶样中的体细胞数>50万/mL,并且能从该奶样中分离得到NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌即为乳房炎模型建立成功。
将这12头奶牛随机分为两组：噬菌体实验组和抗生素对照组，每组6头奶牛。实验组奶牛用实施例2提供(使用CsCl等密度梯度离心纯化)的噬菌体稀释液(终效价为1010PFU/mL)，在每次挤奶前和挤奶后用噬菌体进行乳头药浴，乳头药浴每天3次，每次1min，持续使用30天；对照组牛使用注射用氨苄西林钠(上海公谊兽药厂)进行治疗。在治疗开始的第1d、15d和30d时，应用北京乳房炎检测试剂(BMT)对受试奶牛的乳房炎发病率进行统计，结果如表2所示：
表2.噬菌体治疗组和对照组的乳房炎检出率
试验30d后，噬菌体药浴组牛乳房炎的阳性乳区少了4个，发病头数减少了2头；抗生素对照组牛隐性乳房炎的阳性乳区减少了0个，发病头数减少了0头。实验结果表明，抗生素对NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌引起的奶牛乳房炎治疗无效，而噬菌体vB_KpnM_he1对NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌引起的奶牛乳房炎具有一定的防治效果。
具体实践中，噬菌体vB_KpnM_he1还可以应用于制备其他用于防治NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌感染的药物，剂型可以是粉剂或液体剂型，感染对象包括人和动物(鸡、猪、牛、鹅、鸭等)，以代替抗生素类药物使用。
实施例8噬菌体vB_KpnM_he1控制养殖环境中的NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌的污染
以奶牛养殖场作为试验地点，选择一株NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌临床株为试验菌株，将浓度为105CFU/mL的NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌取1mL均匀喷洒在奶牛料槽表面(约1m2)，然后以1mL浓度为108PFU/mL噬菌体vB_KpnM_he1对料槽表面实施喷杀，1h后，使用平板计数法检测料槽表面NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌的数量。
检测结果如图6显示，1h后，料槽表面NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌的数量降到103CFU以下，5h后，料槽表面NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌的数量降到10CFU以下，说明该噬菌体可以有效杀灭养殖环境(奶牛料槽表面)中的NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌。
实施例9噬菌体vB_KpnM_he1控制养殖环境中的NDM-1阴性肺炎克雷伯氏菌的污染
以奶牛养殖场作为试验地点，选择一株不携带NDM-1基因的肺炎克雷伯氏菌临床株为试验菌株，将浓度为105CFU/mL的肺炎克雷伯氏菌取1mL均匀喷洒在奶牛料槽表面(约1m2)，然后以1mL浓度为108PFU/mL噬菌体vB_KpnM_he1对料槽表面实施喷杀，1h后，使用平板计数法检测肺炎克雷伯氏菌的数量。
检测结果显示，2h后，料槽表面肺炎克雷伯氏菌的数量降到103CFU以下，5h后，料槽表面肺炎克雷伯氏菌的数量降到10CFU以下，说明该噬菌体可以有效杀灭养殖环境(奶牛料槽表面)中的肺炎克雷伯氏菌。
实施例10噬菌体vB_KpnM_he1控制NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌对饲料的污染
将过夜培养的NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌调整浓度为105CFU/mL，用小型喷雾器(瓶)将1mL菌液均匀喷洒在摊开的100g青贮饲料(上海金盟饲料有限公司)表面，摊开面积约1m2,然后将纯化的噬菌体vB_KpnM_he1以108PFU/mL的浓度实施喷杀，喷施量1mL，2h后开始检测饲料中NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌的数量。
检测结果显示，在以108PFU/mL浓度实施喷杀2h后，青贮饲料中宿主菌的数量降到10CFU/g以下，说明该噬菌体可以有效杀灭奶牛饲料中污染的NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌。
实施例11噬菌体vB_KpnM_he1的安全性实验
6-8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠，平均体重27±2g，共40只，购自扬州大学比较医学中心。将小鼠随机分为2组，每组20只；其中一组口服噬菌体vB_KpnM_he1 108PFU/0.25mL/只(实施例2提供)；对照组口服等体积PBS。连续口服14d后，每组脱颈致死5只小鼠，观察内脏、消化道及黏膜变化情况；每组剩余的15只继续饲喂，每天取其粪便检测噬菌体数量变化。
结果显示，此剂量噬菌体对小鼠健康及日常行为没有影响，解剖检查未见任何异常，且在口服噬菌体结束7天后，在小鼠粪便中检测不到噬菌体。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，如上述实施例提供的噬菌体vB_KpnM_he1还可以用于杀灭养殖环境(料槽、地面、墙壁、垫料、饲料或饮水等环境)或医疗环境中的NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌，这些依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_he1（klebsiella peneumoniae phage vB_KpnM_he1），所述噬菌体保藏号为CCTCC No: M2015760，所述噬菌体为双链DNA噬菌体，其头部为正二十面体，有可伸缩性尾部，属于肌尾病毒科。
2.如权利要求1所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体在裂解NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌株中的应用。
3.如权利要求1所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体在制备防治肺炎克雷伯氏菌感染的药物中的应用。
4.如权利要求1所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体在杀灭环境中肺炎克雷伯氏菌中的应用。
5.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述药物剂型为粉剂或液体剂型。
6.如权利要求3或5所述应用，其特征在于所述在制备防治肺炎克雷伯氏菌感染的药物中的应用是指，所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体在制备防止奶牛乳房炎药物中的应用。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述环境包括养殖环境和医疗环境。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、垫料、饲料或饮水。
9.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体在杀灭环境中肺炎克雷伯氏菌中的应用是指，将浓度为108PFU/mL的肺炎克雷伯氏菌噬菌体液喷施于环境中，施用量为1mL/m2。
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