CN110438091B - 一株新的肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株新的肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5，所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体(Klebsiella pneumoniae phage)vB_KpnM_Bp5于2019年06月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 2019452。该噬菌体不仅对分离于猪场污水的宿主多重耐药肺炎克雷伯氏菌具有较好的消杀效果，对另外2株分离于医院的多重耐药肺炎克雷伯氏菌也有很强的消杀效果，抗菌谱较广，可应用于制备防治多重耐药肺炎克雷伯氏菌的药物。

Description

一株新的肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株新的肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用。
背景技术
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)是革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯菌属(Klebsiella)。肺炎克雷伯杆菌是一种常见的人畜共患病病原，可引起人和动物的肺炎、脑膜炎、肝脓肿、伤口感染、败血症等疾病，是人医临床上常见的条件致病菌之一，也给养殖业造成了不小的经济损失。
β-内酰胺类、四环素类、磺胺类、喹诺酮类等抗生素是兽医临床上防治细菌感染最主要的药物，由于长期的药物选择性压力，病原菌表现出了对这些药物严重的耐药性，甚至出现了对多种抗生素耐药的多重耐药菌株，这给临床治疗增加了不小的难度。
1986年，中国台湾学者发现并报道了毒力更强、易产生转移性感染、对大多数抗生素敏感、高黏性外观的高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKP)，随后美国、欧洲、非洲等相继报道了该菌。雪上加霜的是近年来广谱抗生素的大量使用，高毒力肺炎克雷伯菌耐药菌分离率逐年增多，甚至出现全耐药菌株，这给该菌感染的治疗带来更大的困难，给人类的生命安全和经济效益带来了极大的威胁，因此迫切需要寻找一种新的抗菌药物。
噬菌体(bacteriophage，phage)能感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物并引起宿主菌的裂解，是天然的杀菌物质，曾广泛应用于耳喉科、口腔科、眼科、皮肤科、儿科及肺部疾病等的治疗。噬菌体因其高效的、特异性的杀菌作用在治疗或预防疾病具有极大的潜力，尤其随着细菌抗生素耐药性的广泛存在，在许多领域使用噬菌体能很好的控制致病菌的生长和扩增。
噬菌体制剂无疑是克制耐药菌的有利武器，美国、欧洲等国已经批准某些噬菌体制剂用于疾病治疗和食品杀菌并取得了显著成果，如Ryland Young 教授利用3株噬菌体治愈了感染“超级细菌”——多重耐药鲍曼不动杆菌的患者，Dedrick RM教授利用噬菌体成功治愈了双肺移植后耐药结核分枝杆菌感染的患者。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提供一株新的肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用，旨为多重耐药肺炎克雷伯氏菌的感染提供新的治疗方案，以及为多重耐药肺炎克雷伯氏菌造成的环境和饲料等污染提供新型的消毒手段。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一株新的肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5，所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体(Klebsiella pneumoniae phage)vB_KpnM_Bp5于2019年06月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2019452。
包含如上所述的肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5的制剂；其中，所述的制剂为喷洒剂或注射剂。
其中，肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5在制备防治多重耐药肺炎克雷伯氏菌感染的制剂中的应用。
其中，如上所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5在杀灭养殖环境或医疗环境中的肺炎克雷伯氏菌的应用。采用所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体 vB_KpnM_Bp5对多重耐药肺炎克雷伯氏菌污染的环境进行消毒，可有效的杀灭医疗环境(如地面、器械、墙壁等)和养殖环境(食槽、围栏、饲料、饮水、粪便等)中的多重耐药肺炎克雷伯氏菌。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5是一株新发现的噬菌体，该噬菌体不仅对分离于猪场污水的宿主多重耐药肺炎克雷伯氏菌具有较好的消杀效果，对另外2株分离于医院的多重耐药肺炎克雷伯氏菌也有很强的消杀效果，抗菌谱较广，可应用于制备防治多重耐药肺炎克雷伯氏菌的药物；
(2)肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5潜伏期短，能快速杀死培养基中的宿主菌，且毒副作用小，安全性高，温度、酸碱耐受范围比较广且具有良好的亲水性，易制成喷洒剂和注射剂，对感染多重耐药肺炎克雷伯氏菌的动物和被多重耐药肺炎克雷伯氏菌污染的环境均有很好的治疗、杀灭作用。
附图说明
图1是本发明肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5噬菌斑图片。
图2是本发明肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5扫描电镜图。
图3是本发明肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5一步生长曲线图。
图4是温度对本发明肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5活性影响示意图。
图5是pH对本申请肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5活性影响示意图。
图6是本发明肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5培养基中杀菌示意图。
图7是本发明肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5小鼠治疗效果示意图。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例涉及的菌株、试剂及培养基：
实验所用宿主菌为多重耐药肺炎克雷伯氏菌临床株，分离于广西武鸣某猪场污水病猪腹泻粪便中分离得到，与本发明肺炎克雷伯氏菌噬菌体 vB_KpnM_Bp5同时保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2019452。
LB(Luria broth)液体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加 ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。
0.6％LB半固体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉6 g，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。
1.2％LB固体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂粉12g，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌后，冷却至50℃，倾倒平板，冷却凝固后，倒置备用。
SM缓冲液(1L)：称取6.055gTris-HCI(pH为7.5)定容至100ml，加入5. 800g NaCl，2.000g MgSO4后，加入ddH2O定容至1L。
1mol/L无菌CaCl2溶液(1L)：用天平称量Ca Cl2固体111g，倒入烧杯加水溶解，将溶液倒入1L容量瓶并用蒸馏水润洗烧杯3次，润洗液一并倒入容量瓶，再定容，高压灭菌备用。
DNaseI、RNase A、PEG8000、磷钨酸(PTA，2％w/v)为市售所得。
实施例1
肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5的分离
样品采自广西武鸣某猪场化粪池中污水，样品4℃、12000rpm离心20min，上清分别用0.45μm和0.25μm滤膜过滤。取5mL滤液，加入保藏于中国典型培养物保藏中心的宿主菌0.1mL，加入无菌CaCl2母液至终浓度1mM混匀后，再加入2×LB液体培养基5mL，放置于37℃培养12～16h。次日，4℃、12000rpm 离心上述培养物10min，上清用0.25μm滤膜过滤除菌，形成含有噬菌体的原液也即噬菌体悬液。
取保藏于中国典型培养物保藏中心的宿主菌划线接种于琼脂培养基上，培养过夜后，挑取单克隆接种于5mL液体培养基中，37℃振荡培养8h后作为宿主菌培养物备用。
将琼脂平板分为2个区域，吸取上述备用的宿主菌培养物滴于平板正中央，用涂布棒将菌液均匀地涂开，待其晾干后取上述噬菌体悬液10μL滴于其中一个区域待自然晾干后，置于37℃培养箱培养后，观察滴加噬菌体区域有无空斑形成。若有空斑形成，证明有噬菌体存在。
重新另取一份上述噬菌体悬液0.1ml连续10倍稀释，分别取10-2、10-4、 10-6稀释液0.1ml加入0.1ml保藏于中国典型培养物保藏中心的宿主菌，静置 15min，加入45℃左右的0.6％半固体LB培养基3.5ml，均匀铺在预先制备好的固体LB平板上，37℃培养12h后观察噬菌斑生长情况。挑取单个透亮无晕环、大小均一的噬菌斑到装有SM稀释液的EP管中，4℃过夜。第二天取0.1ml 上述溶液10倍稀释，与0.1ml宿主菌做双层。如此重复10次左右即可获得噬菌斑大小均一的噬菌体，4℃保存，备用。
用双层平板法检测上述备用的噬菌体，结果如图1所示，该噬菌体在琼脂培养基中可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径约为4-5mm，为典型的裂解性噬菌体。
实施例2
肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5的扩增纯化
取实施例1备用的噬菌体0.1ml和实施例1备用的宿主菌培养物0.1ml于试管中作用15min，加入10ml LB液体培养基，37℃培养6h，4℃、12000rpm 离心20min，取上清，0.25μm滤膜过滤，滤液即为噬菌体裂解液。
PEG纯化：在噬菌体裂解液中加入DNaseI、RNase A至终浓度均为1μg/ml， 37℃温育30min，加入终浓度为1M的NaCl冰浴1h，4℃、12000rpm离心10min，取上清加入终浓度为10％的PEG8000，4℃过夜，然后4℃、12000rpm离心 10min，弃上清，倒置5min，加入SM缓冲液重悬，加入等体积的氯仿温和震荡30s，4℃、5000rpm离心15min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获纯化的噬菌体悬液。
双层平板法检测噬菌体效价：上述噬菌体悬液进行10倍梯度稀释，取各梯度的噬菌体稀释液0.1ml与宿主菌液0.1ml充分混匀，铺双层琼脂平板，37℃恒温培养左右12h，对每个琼脂平皿进行噬菌斑计数，选择出现30-300左右噬菌斑的平皿，根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度即得噬菌体效价，噬菌体的效价(PFU/ml)＝稀释倍数×噬菌斑个数×10，噬菌体效价为 7×109PFU/ml。
实施例3
肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5的透射电镜观察
实施例2纯化后的噬菌体悬液做电镜观察，将实施例2纯化后的噬菌体悬液滴在铜片上，自然沉淀2～3min，用滤纸吸去多余的液体，滴一滴2％的磷钨酸(PTA，2％w/v)染色，室温干燥后使用透射电子显微镜观察；观察结果如图2所示，该噬菌体有呈正二十面体的头部和可伸缩的尾部，头部直径约为53nm，尾部长约56nm，可见少量尾丝，根据国际病毒分类委员会(ICTV) 2015年发表的《病毒分类一国际病毒分类委员会第八次报告》，该噬菌体属于肌尾病毒科(Myoviridae)。
申请人将该噬菌体自命名为vB_KpnM_BP5，于2019年06月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 2019452，保藏地址是中国湖北省武汉市武昌区八一路229号武汉大学。
实施例4
肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5最佳感染复数的测定(感染复数为感染初期噬菌体的数与宿主菌数的比)
取实施例1中备用的宿主菌培养物，调整浓度到1×109cfu/mL，按照感染复数分别为1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001的比例分别加入实施例1 备用的噬菌体和实施例1中备用的宿主菌培养物，加入LB液体培养基使培养体系的总体积相同。在37℃静止培养5h，于10000rpm离心10min，收集上清稀释到适当浓度，用双层法测定效价，结果如表1所示，肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5的最佳感染复数为0.001。
表1.肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5的最佳感染复数
Figure BDA0002128859540000061
实施例5
肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5一步生长曲线的测定
将实施例1中备用的宿主菌培养物与过量的实施例1备用的噬菌体混合 (MOI>10)，37℃温浴15min后12000rpm离心1min，弃上清，LB液体培养基洗涤沉淀1次。用10ml预热的LB液体培养基重悬沉淀，迅速置于37℃摇床中振荡培养，从0min开始，每隔10min取120μl培养物，4℃、10000rpm离心2min去除细菌，取上清稀释至适当浓度(适当浓度即在平板上形成30-300 个噬菌斑的浓度)，双层法测定噬菌体效价，测90min，共取样10次。以取样时间为横坐标，噬菌体的效价的对数为纵坐标，绘制一步生长曲线得出噬菌体的潜伏期、暴发期、爆发量。一步生长曲线结果如图3所示，其感染宿主菌潜伏期为5min，暴发期为40min，爆发量为24。
实施例6
肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5的温度、酸碱度耐受实验
取10个无菌EP管，各加入0.5ml实施例1备用的噬菌体，分别在30℃、 40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下作用30min、60min，作用时间结束后立即置于水浴中冷却，然后测定噬菌体的效价。检测结果如图4所示：该噬菌体能耐受50℃高温，60min内效价基本稳定，大于60℃时噬菌体效价明显下降，80℃环境中噬菌体迅速失活。
取11份0.1ml实施例1备用的噬菌体分别放入pH为2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12的SM缓冲液(0.9ml)中，37℃作用2h，然后用双层法测定反应后噬菌体的效价。检测结果如图5所示：肺炎克雷伯氏菌噬菌体 vB_KpnM_Bp5在pH值为4～10的环境中效价变化较小，活性基本不变。当环境pH>10或pH<4时，噬菌体的效价随酸、碱性的增强急剧下降。pH>11 或pH<2时，噬菌体效价为0，全部失活，因此可知该噬菌体的最适pH为4～10。
实施例7
肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5宿主谱分析
将实施例1备用的噬菌体效价调整为109PFU/ml备用，用分离于广西中医药大学附属瑞康医院的20株多重耐药肺炎克雷伯氏菌对噬菌体的宿主谱进行分析，具体操作如下：分别取20株多重耐药肺炎克雷伯氏菌的过夜培养物 0.1ml，加入45℃左右的0.6％LB半固体培养基3.5ml，均匀铺在预先制备好的固体1.2％LB固体培养基上，然后将每个平板平均分成两个区域，其中一个区域取10μL效价调整为109PFU/ml上述备用的噬菌体滴加在表面，另一个区域滴加即生理盐水作对照，待液滴干燥后倒置于37℃培养12h，观察结果，如有噬菌斑产生则记为“+”，否则为“-”。结果如表2所示：肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5能裂解宿主菌外还能裂解另外两株分离于广西中医药大学附属瑞康医院的多重耐药肺炎克雷伯氏菌。
表2.肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5的宿主谱
序列号 细菌 菌株来源 裂解谱
1 GX L15 广西南宁 -
2 GX L40 广西南宁 -
3 GX L44-1 广西南宁 -
4 GX L27 广西南宁 -
5 GX L13 广西南宁 -
6 GX SL39 广西南宁 -
7 GX 08 广西南宁 -
8 GX L63 广西南宁 +
9 GX SL26 广西南宁 -
10 GX L18 广西南宁 -
11 GX L28 广西南宁 +
12 GX 13 广西南宁 -
13 GX 49 广西南宁 -
14 GX L01 广西南宁 -
15 GX 06-1 广西南宁 -
16 GX L56 广西南宁 -
17 GX 20-2 广西南宁 -
18 GX 54-2 广西南宁 -
19 GX 20-1 广西南宁 -
20 GX RS3 广西南宁 -
实施例8
肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5在培养基中的杀菌效果
实施例1备用的宿主菌培养物稀释到1×109CFU/ml，取无菌试管18根，对照组加入1.5mlLB液体培养基，实验组按照MOI＝1、0.001分别加入1.5ml 上述宿主菌培养物和1.5ml不同浓度的实施例1备用的噬菌体，每组做3个重复。用分光光度计测宿主菌与噬菌体的共培养液的OD600，每1h测一次，测 5h。噬菌体杀菌实验结果如图6所示，MOI＝0即培养液中仅有宿主菌没有噬菌体，在5h内OD600呈上升趋势，并维持在一个较高水平。在培养液中加入噬菌体，感染复数MOI＝1时，OD600迅速下降且保持在极低水平(OD600<0.1) 说明培养液中细菌几乎被全部杀死；MOI＝0.001时，OD600先上升再下降最后维持在极低水平，可能是噬菌体的初始浓度较低且细菌繁殖速度较噬菌体更快，噬菌体不能很好的抑制细菌增长，一段时间后，噬菌体浓度升高，杀菌作用明显提高，细菌几乎被全部杀死，说明噬菌体浓度不占优势时也能很好的抑制细菌的增长。综上所述，肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5在防控和治疗肺炎克雷伯杆菌感染方面具有较好的应用前景。
实施例9
肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5控制环境中多重耐药肺炎克雷伯氏菌污染
以动物房作为试验地点，将实施例1备用的宿主菌培养物稀释到 1×104CFU/ml并均匀喷洒在地面上(ml/m2)，然后将实施例1备用的噬菌体调整浓度至109CFU/ml，用所得浓度为109CFU/ml噬菌体对地面实施喷杀 (ml/m2)，1h后，使用平板计数法检测地面宿主菌的数量。
结果显示，1h后地面肺炎克雷伯氏菌的数量下降到102CFU，2h后地面的肺炎克雷伯氏菌的数量下降到10CFU，3h后在地面上已经检测不到肺炎克雷伯氏菌，说明本发明肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5可以有效杀灭养殖环境(地面)中的肺炎克雷伯氏菌。
实施例10
肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5的安全性实验
6周龄SPF级小鼠，雌雄各半，共20只，购自广西医科大学实验动物中心。随机分为两组，每组10只(5只雌性、5只雄性)，其中一组腹腔注射噬菌体109PFU/mL/0.25mL/只(将实施例1备用的噬菌体调整浓度至109CFU/ml 后所得)，对照组腹腔注射等体积PBS，连续观察14天，脱劲致死小鼠，观察内脏、消化道及黏膜变化情况。
结果显示，此计量的噬菌体对小鼠日常行为没有影响，解剖检查各组织器官均无异常。
实施例11
肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5控制多重耐药肺炎克雷伯氏菌感染实验
实验选在广西大学动物房进行，实验对象是购自广西医科大学实验动物中心的SPF级昆明小鼠。取30只6周龄SPF级昆明小鼠，随机分成6组，每组5只，给予充足的食物和饮水饲养1周。1周后，各实验组小鼠分别腹腔注射不同剂量的菌液实施例1备用的宿主菌培养物(3.2×108、1.6×108、8×107、 4×107、2×107cfu/只)，对照组腹腔注射等量的无菌PBS，观察实验小鼠的死亡情况，引起一组小鼠全部死亡的最小剂量即为最小致死量(MLD)。结果显示如表3所示，最小致死量(MLD)为4×107cfu/只。
表3.肺炎克雷伯杆菌最小致死量确定
小组编号 活菌数/只 死亡率
1 3.2×10<sup>8</sup> 5/5
2 1.6×10<sup>8</sup> 5/5
3 8×10<sup>7</sup> 5/5
4 4×10<sup>7</sup> 5/5
5 2×10<sup>7</sup> 3/5
对照组 PBS 0/5
取25只6周龄SPF级昆明小鼠，随机分成5组，每组5只，给予充足的食物和饮水饲养1周。1周后，以最小致死量(MLD)作为小鼠的感染计量，对第1～4组小鼠进行腹腔注射实施例1备用的宿主菌培养物，第5组注射等量的PBS，然后分别于腹腔注射宿主菌培养物前1h、注射时、注射后1h对1～3 组小鼠腹腔注射2×108pfu/只实施例1备用的噬菌体进行治疗，第4组不进行任何治疗，连续观察7天小鼠的死亡情况：
结果如图7所示：提前治疗组和同时治疗组噬菌体对小鼠的保护率达 100％，延后治疗组噬菌体对小鼠的保护率为60％，不治疗组小鼠全部死亡，阴性对照组没有死亡。说明肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5能很好的控制多重耐药肺炎克雷伯菌对小鼠的感染，降低死亡率。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (2)

1.一株肺炎克雷伯氏菌噬菌体（Klebsiella pneumoniae phage）vB_KpnM_Bp5，其特征在于，所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体（Klebsiella pneumoniae phage）vB_KpnM_Bp5于2019年06月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2019452。
2.一种包含如权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_Bp5的制剂。
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