CN113980913B - 一株奇异变形杆菌噬菌体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)vB_PmiP_pPm05，所述奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05在用于抑制或者杀灭食品中的奇异变形杆菌中的应用。本发明奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05扩增效率高，能在较短时间内大量扩增，对温度、酸碱耐受范围广，能有效防控由奇异变形杆菌引起的食品污染，同时对食品的质地和风味不产生影响。
Description
技术领域
本发明涉及奇异变形杆菌噬菌体的技术领域，特别涉及一株奇异变形杆菌噬菌体及其应用。
背景技术
变形杆菌属包括普通变形杆菌、奇异变形杆菌、莫根变形杆菌、雷极变形杆菌和无恒变形杆菌。其中以普通变形杆菌和奇异变形杆菌与临床关系较密切，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis，P.mirabilis)是兼性厌氧的革兰氏阴性致腐败菌，无荚膜和芽孢，有菌毛和鞭毛，具有较强的运动能力。奇异变形杆菌的耐热性较差，55℃下持续加热1h即可将其灭杀，但在4-7℃的低温下亦可繁殖。奇异变形杆菌广泛分布于自然界中，主要存在于水源、土壤、人和动物的呼吸道、消化道及排泄物中，对有机物分解具有重要作用。人类正面临着内、外环境的挑战，微生态环境作为一种重要的内环境对人体健康影响巨大。生命活动的本质是生物与内外环境形成的生态系统的平衡过程，而疾病多由各种干扰宿主的因素过度作用导致生态失调引起。奇异变形杆菌是条件性致病菌，可引发机体出现多种疾病，如肠炎、肺炎、腹膜炎、脑膜炎、尿路感染等。
噬菌体(bacteriophage，phage)能感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物并引起宿主菌的裂解，是天然的杀菌物质，噬菌体因其高效的、特异性的杀菌作用在治疗或预防疾病具有极大的潜力。噬菌体制剂无疑是克制耐药菌的有利武器，美国、欧洲等国已经批准某些噬菌体制剂用于疾病治疗和食品杀菌并取得了显著成果，如Ryland Young教授利用3株噬菌体治愈了感染“超级细菌”——多重耐药鲍曼不动杆菌的患者，Dedrick RM教授利用噬菌体成功治愈了双肺移植后耐药结核分枝杆菌感染的患者。
中国申请CN112831475A公开了一株裂解性大肠杆菌噬菌体，命名为FQ44，该噬菌体除对大肠杆菌具有较好的裂解作用外，噬菌体FQ44在防控烟草土传青枯病的应用，采用灌根法将噬菌体施入土壤。中国申请CN112143709A公开了一株嗜水气单胞菌噬菌体及其应用，该噬菌体除对大肠杆菌具有较好的裂解作用外，还可以用于治疗我国淡水鱼类嗜水气单胞菌感染的强效噬菌体，在水产养殖中具有广泛的应用前景。中国申请CN110317792A公开了一株副溶血弧菌噬菌体及其应用，该噬菌体除对大肠杆菌具有较好的裂解作用外，还在防治南美白对虾致病性副溶血弧菌感染中的应用的强效噬菌体，在水产养殖中具有广泛的应用前景。
关于奇异变形杆菌噬菌体的研究主要集中于环境噬菌体裂解性方面，故寻找一株能快速杀灭细菌、且稳定性高、安全性好、效价高且在食品方面防感染的新型奇异变形杆杆菌噬菌体分离物是非常有必要的。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提供一株奇异变形杆菌噬菌体及其应用，与传统的化学或者物理方法相比，噬菌体用于抑制或者杀灭食品中的奇异变形杆菌不会影响食品的质地和风味，具有特异性高、无残留和安全的特点，为污染多重耐药奇异变形杆菌的食品提供新的灭菌方案。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一株奇异变形杆菌噬菌体，所述奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilisphage)vB_PmiP_pPm05保藏号为CCTCC M 2021883，保藏日期：2021年7月14日，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心。
如上所述奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)在制备预防和治疗奇异变形杆菌感染的疾病的药物中的应用。
如上所述噬菌体在用于抑制或者杀灭食品中的奇异变形杆菌中的应用。
所述奇异变形杆菌噬菌体(Proteus mirabilis phage)能够裂解2株分离自不同地区的猪源多重耐药奇异变形杆菌。本发明公开了该噬菌体在食品中的应用，可应用于制备杀灭多重耐药奇异变形杆菌保障食品安全的生物制剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05扩增效率高，能在较短时间内大量扩增，对温度、酸碱耐受范围广，易制成喷洒剂，不携带耐药和毒力基因，且毒副作用小，安全性高，对被奇异变形杆菌污染的食物具有较好的抑制或杀灭效果；进一步的本发明奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05可作为抑菌剂在食品中应用，能有效防控由奇异变形杆菌引起的食品污染，同时对食品的质地和风味不产生影响。
保藏信息说明
奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05于2021年7月14日，保藏于湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2021883。
附图说明
图1是本发明奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05噬菌斑图片。
图2是本发明奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05透射电镜图片。
图3是本发明奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05最佳感染复数图。
图4是本发明奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05生长曲线图。
图5是本发明奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05的温度耐受图。
图6是本发明奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05的pH耐受图。
图7是本发明奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05在牛奶中的杀菌结果图。
图8是本发明奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05在猪肉中的杀菌结果图。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。
实验所用宿主菌vB_PmiP_pPm05为奇异变形杆菌临床株，分离于广西河池某猪场粪便中分离得到，与本发明奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2021883。
LB液体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。
2×LB液体培养基(1L)：蛋白胨20g，酵母粉10g，NaCl 20g，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。
0.6％LB半固体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉6g，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。
1.2％LB固体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂粉12g，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌后，冷却至50℃，倾倒平板，冷却凝固后，倒置备用。
SS培养基(1L)：SS琼脂粉5g，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。
SM缓冲液(1L)：称取6.055g Tris-HCI(pH为7.5)定容至100ml，加入5.800g NaCl，2.000g MgSO4后，加入ddH2O定容至1L，20min高压灭菌后备用。
PBS缓冲液(1L)：称取磷酸氢二钠9.465g，加蒸馏水至1000ml，20min高压灭菌后备用。
生理盐水(1L)：称取NaCl 6.544g，加蒸馏水至1000mL，20min高压灭菌后备用。
1mol/L无菌CaCl2溶液(1L)：用天平称量CaCl2固体111g，倒入烧杯加水溶解，将溶液倒入1L容量瓶并用蒸馏水润洗烧杯3次，润洗液一并倒入容量瓶，再定容，高压灭菌备用。
DNase I、RNase A、PEG8000、磷钨酸(PTA，2％w/v)为市售所得。
实施例1
从广西壮族自治区多个市县牛场收集污水样品，猪场收集粪便拭子，污水自然静置沉淀后取上层液体，4℃5000r/min离心10min后取上清液，重复三次，上清液用0.45μm无菌滤器过滤，然后用0.22μm无菌滤器过滤，将污水滤液保存于4℃冰箱备用；粪便样品用SS固体培养基分离奇异变形杆菌Pm05，即为宿主菌菌液，冻存于-80℃，备用。
把分离得到的猪源奇异变形杆菌接种于LB液体培养基中，于恒温摇床中37℃培养6h，将培养后所得菌液保存备份，并与上述保存于4℃冰箱备用的污水滤液混合，加入等体积的2×LB液体培养基，于恒温摇床中37℃180r/min振荡培养8-12h，以扩增污水滤液中的噬菌体；然后将培养物4℃8000r/min离心10min，用0.22μm无菌滤器过滤上清液，得噬菌体原液，备用；
采用点样法分离噬菌体：将3mL预冷至40℃的0.6％LB半固体培养基加入5mL离心管中，再加入100μL冻存于-80℃的菌液，充分混匀，倒入1.2％LB固体培养基中，待其凝固；取2μL上述备用的噬菌体原液点样在凝固的1.2％LB固体培养基，多次点样，放置恒温培养箱中37℃培养8-10h，观察滴加区域有无透亮噬菌斑，若有透亮噬菌斑形成，证明有噬菌体存在；
将透亮噬菌斑用无菌枪头挑取后放入SM缓冲液中，温和振荡1h后，用0.22μm无菌滤器过滤得滤液，10倍梯度稀释；采用双层平板法进行验证，取合适的梯度稀释液(10-4)和宿主菌菌液Pm05各100μ，与3mL预冷至40℃的0.6％LB培养基充分混匀后倒入1.2％LB固体培养基中，凝固后，放置于恒温培养箱中37℃培养8-10h，观察有无透亮噬菌斑，若出现噬菌斑，则挑取单个噬菌斑重复本步骤，重复8-10次进行纯化，至噬菌斑大小均匀一致。
以奇异变形杆菌Pm05为宿主菌分离得1株噬菌体，结果如图1所示：该噬菌体在琼脂培养基中可以形成清晰透亮无光晕，直径约为1mm的噬菌斑，为典型的裂解性噬菌体。
实施例2
奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05的浓缩
在5mL LB液体培养基中加入新鲜的实施例1中备用的宿主菌菌液2mL与实施例1中备用的噬菌体原液，放入恒温摇床37℃、180r/min培养只培养基清亮，6h，4℃、8000rpm离心5min，取上清，0.22μm无菌滤器过滤，滤液即为噬菌体裂解液。在噬菌体裂解液中加入DNaseI、RNase A至终浓度均为1μg/ml，37℃温育30min，加入终浓度为1M的NaCl冰浴1h(即加入氯化钠使混合溶中氯化钠的最终浓度为1M)，4℃、8000rpm离心10min，取上清加入体积浓度为10％的PEG 8000，4℃过夜，然后4℃、8000rpm离心10min，弃上清，倒置5min，尽可能的除去多余的水，然后向剩余的固体物质加入SM缓冲液重悬，加入等体积的氯仿温和震荡30s，4℃、5000rpm离心15min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获浓缩噬菌体悬液。
双层平板法检测噬菌体效价：上述纯化的噬菌体悬液进行10倍梯度稀释，取各梯度的噬菌体稀释液0.1ml与宿主菌液0.1ml充分混匀，与3mL预冷至40℃的0.6％LB半固体培养基充分混合后倒入1.2％LB固体培养基中铺双层琼脂平板，37℃恒温培养左右8-10h，对每个琼脂平板进行噬菌斑计数，选择出现30-300左右噬菌斑的平皿，根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度即得噬菌体效价，噬菌体的效价(PFU/ml)＝稀释倍数×噬菌斑个数×10，噬菌体效价为1010PFU/ml。
实施例3
奇异变形杆菌噬菌体的透射电镜观察
实施例2所得浓缩噬菌体悬液做电镜观察，取10μL浓缩后的噬菌体液滴于铜网上吸附10min，用滤纸从铜网周边吸干噬菌体液，将铜网碳膜面扣在2％磷钨酸溶液(pH 6.8)液滴上染色10min，用滤纸从铜网周边吸干染液，自然晾干；然后将制备好的样品铜网用透射电镜观察，结果如图2所示：该噬菌体头部为扁平的椭圆形，头部长约145nm，尾部长约10nm，根据国际病毒分类委员会规定，该噬菌体属于短尾病毒科(Podoviridae)。将该噬菌体命名为vB_PmiP_pPm05，于2021年07月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2021883，保藏地址是中国湖北省武汉市武昌区八一路229号武汉大学。
实施例4
奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05的宿主范围筛选
将实施例2所得浓缩噬菌体悬液的效价调整为109PFU/ml备用，用另外分离于广西多个市县养猪场的20株奇异变形杆菌对噬菌体的宿主谱进行分析，具体操作如下：分别取20株多重耐药奇异变形杆菌的新鲜培养物100μL，加入至装有3mL预冷至40℃0.6％LB半固体培养基的5mL离心管中，充分混匀，倒入1.2％LB固体培养基中，待其凝固，然后将每个平板平均分成两个区域，其中一个区域取10μL效价调整为109PFU/ml上述备用的噬菌体滴加在表面，另一个区域滴加即生理盐水作对照，待液滴干燥后倒置于37℃培养8-10h，观察结果，如出现噬菌斑则记为“+”，否则为“-”；结果如表1所示：奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05除能裂解宿主菌外，还能裂解另外1株分离于广西南宁的多重耐药奇异变形杆菌。
表1.奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05的宿主范围
| 序列号 | 细菌 | 菌株来源 | 结果 |
| 1 | Pm01 | 广西南宁 | + |
| 2 | Pm02 | 广西贺州 | - |
| 3 | Pm03 | 广西来宾 | - |
| 4 | Pm04 | 广西玉林 | - |
| 5 | Pm05 | 广西河池 | + |
| 6 | Pm06 | 广西玉林 | - |
| 7 | Pm07 | 广西南宁 | - |
| 8 | Pm08 | 广西玉林 | - |
| 9 | Pm09 | 广西钦州 | - |
| 10 | Pm10 | 广西钦州 | - |
| 11 | Pm11 | 广西玉林 | - |
| 12 | Pm12 | 广西玉林 | - |
| 13 | Pm13 | 广西玉林 | - |
| 14 | Pm14 | 广西柳州 | - |
| 15 | Pm15 | 广西柳州 | - |
| 16 | Pm16 | 广西南宁 | - |
| 17 | Pm17 | 广西南宁 | - |
| 18 | Pm18 | 广西南宁 | - |
| 19 | Pm19 | 广西南宁 | - |
| 20 | Pm20 | 广西南宁 | - |
| 21 | Pm21 | 广西桂林 | - |
注：斜体+粗体为宿主菌
实施例5
奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05的最佳感染复数测定
感染复数为噬菌体与宿主菌数量的比值。将实施例2所得浓缩噬菌体悬液效价调整至1.0×108PFU/mL加入宿主菌，按照感染复数为0.001、0.01、0.1、1、10、100进行混匀后调整至相同体积，置于恒温摇床37℃180r/min振荡培养6h后，采用双层平板法测定不同感染复数培养物中噬菌体效价，其中效价最高的为最佳感染复数；结果如图3所示：奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05的最佳感染复数为0.001。
实施例6
奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05的生长曲线的测定
取实施例1备用的宿主菌菌液1mL，浓度调整为1.0×108CFU/mL，以MOI＞1的比例加入实施例2所得浓缩噬菌体悬液，37℃恒温水浴20min，10000r/min离心1min去上清，用37℃预热的LB液体培养基重悬后，再次离心重悬至10mL，置于恒温摇床37℃180r/min培养；立即计时，0-120min每隔10min取样一次，梯度稀释后对噬菌体效价进行测量，计算噬菌体裂解量(裂解量＝裂解末期噬菌体效价/初始宿主菌浓度)，结果如图4所示：感染宿主菌后的10min，噬菌体效价变化较小，表示潜伏期为10min。随时间增长，噬菌体效价不断上升，至100min后趋于稳定，表示裂解期为90min，裂解量为44PFU/cell。
实施例7
奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05的温度耐受试验
将实施例2所得浓缩噬菌体悬液调整至1.0×108PFU/mL，各取1mL加入离心管置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下水浴30min和60min，10倍梯度稀释测量噬菌体效价；结果如图5所示：该噬菌体vB_PmiP_pPm05在30℃和40℃水浴30min和60min，噬菌体效价基本保持不变；当温度超过50℃时，噬菌体效价逐步降低，且水浴时间越长噬菌体效价下降程度越高；当温度达到80℃，水浴30min时，噬菌体效价为3.13×104PFU/mL，60min后降为效价0。
实施例8
奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05的酸碱耐受试验
将实施例2所得浓缩噬菌体悬液的效价调整为1.0×108PFU/mL，各取100μL加入pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的SM缓冲液(900μL)中，置于水浴锅中37℃孵育2h，梯度稀释测量噬菌体效价；结果如图6所示：噬菌体vB_PmiP_pPm05在pH 4.0-9.0时能够保持较高效价，变化幅度小；当pH＜4.0和pH＞9.0时，噬菌体效价急剧下降，在pH 2.0或10.0时，效价降为0。
实施例9
奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05的安全性试验
4周龄SPF级雌性昆明鼠，共10只，购自广西医科大学实验动物中心；随机分为两组，每组5只，试验组每只昆明鼠腹腔注射0.1mL效价为1.0×1010PFU/mL的(实施例2所得浓缩噬菌体悬液)，对照组每只昆明鼠腹腔注射0.1mL SM缓冲液；相同条件下饲养，观察是否出现临床症状，2周后颈椎脱臼处死昆明鼠，剖检观察器官变化。
结果显示：2周内，小鼠未出现异常行为和临床症状，精神状态良好。处死昆明鼠后，剖检观察各组织器官，观察器官未出现病变。
实施例10
奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05在牛奶中的杀菌效果
将实施例1中备用的宿主菌菌液Pm05浓度调整至1.0×106PFU/mL，对照组加入100μL实施例1中备用的宿主菌菌液Pm05，试验组加入实施例1中备用的宿主菌菌液Pm05和实施例2所得浓缩噬菌体悬液液各100μL，在对照组和试验组中加入无菌取出的牛奶(蒙牛全脂纯牛奶)，使终体积为10mL，充分振荡混匀；在4℃冰箱和25℃恒温培养箱中均放置处理好的对照组和试验组样品；在2、4、6、24h分别取样1mL，4℃8000r/min离心5min，弃上清去除噬菌体，加入灭菌生理盐水重悬至1mL，梯度稀释到合适的浓度，用SS培养基涂布计数。
结果如图7显示：4℃下，对照组中的活菌数极显著上升(P＜0.01)，相对初始浓度上升1.11个数量级，而噬菌体处理后的试验组细菌数极显著下降(P＜0.01)，相对初始浓度下降1.82个数量级。在4h时试验组细菌量下降至最低，相对初始浓度极显著下降2.80个数量级(P＜0.01)，4h后细菌量开始出现增长，至24h显著上升0.73个数量级(P＜0.05)；25℃下，对照组细菌量极显著上升(P＜0.01)，相对初始浓度上升4.85个数量级；4h时试验组细菌量显著下降至最低(P＜0.01)，相对初始浓度下降2.04个数量级，随后开始出现增长，至24h时极显著上升2.93个数量级(P＜0.01)；24h时，试验组细菌量相对初始浓度显著上升0.89个数量级(P＜0.05)。
实施例11
奇异变形杆菌噬菌体vB_PmiP_pPm05在猪肉中的杀菌效果
在超净台中将新鲜猪肉置于无菌托盘上用无菌刀切成表面积1.5×1.5cm2的肉块，尽量保持试验表面平整，肉样重约1g，用无菌培养皿装置肉样，紫外灯下照射1h，期间翻面1次，制得无菌肉样；在无菌肉样的平整表面均匀滴加25μL实施例1中的宿主菌菌液Pm05(宿主菌菌液Pm05浓度调整为4×105CFU/mL)，使得肉样污染宿主菌(1.0×104CFU/sample)，并在超净台中风干20min。
试验组滴加50μL噬菌体(2×109PFU/mL)，使得肉样上噬菌体为1.0×108PFU/sample，噬菌体尽量覆盖在滴加过宿主菌的位置。对照组滴加50μL无菌SM缓冲液。在4℃冰箱和25℃恒温培养箱中均放置处理好的对照组和试验组样品。
在2、4、6、24h分别取肉样1块，加入5mL PBS缓冲液用研磨机无菌研磨，取1mL匀浆4℃8000r/min离心5min，弃上清去除噬菌体，加入PBS缓冲液重悬至1mL，梯度稀释到合适的浓度，用SS培养基涂布计数。
结果如图8显示：4℃下，对照组中的活菌数极显著上升(P＜0.01)，相对初始浓度上升1.65个数量级，而噬菌体处理后的试验组细菌数下降0.83个数量级。4h时试验组细菌量下降最大，极显著下降(P＜0.01)，相对初始浓度下降1.5个数量级，4h后细菌量开始出现增长，至24h上升了0.67个数量级。25℃下，对照组与试验组细菌量均出现极显著上升(P＜0.01)。6h时，对照组与试验组细菌量差距最大，对照组细菌数极显著上升(P＜0.01)，相对初始浓度上升1.74个数量级；试验组细菌数相对初始浓度上升0.80个数量级。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (1)
1.一株奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）噬菌体（phage），其特征在于：所述奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）噬菌体（phage）vB_PmiP_pPm05，保藏号为CCTCC M 2021883。
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