CN108642018B - 一株具有防控番茄青枯病的裂解性噬菌体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株具有防控番茄青枯病的裂解性噬菌体NJ‑P3，分类命名为Podoviridae phage，于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2018099。本发明还公开了所述的噬菌体NJ‑P3在防治番茄土传青枯病的用途和在制备防治番茄土传青枯病噬菌体制剂的用途。本发明噬菌体能够特异性裂解青枯病病原菌，在温度20～40℃、pH＝5～9范围内噬菌体活性最高，裂解能力最强，均表现出杀菌能力，室内抑菌试验显示其抑菌率达到了72.4％，可用于番茄土传青枯病的防治。将本发明噬菌体用于防治番茄图传青枯病，盆栽防病率达到60％，大田生防率可达85.19％。

Description

一株具有防控番茄青枯病的裂解性噬菌体及其用途
技术领域
本发明属于番茄青枯病的防控领域，涉及一株具有防控番茄青枯病的裂解性噬菌体NJ-P3及其用途。
背景技术
番茄青枯病是由茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum(简称青枯菌)引起的一种毁灭性土传细菌病害，严重制约着我国番茄产业的发展。青枯菌通过植物根尖伸长区细胞或次生根生长点的伤口处进入番茄根部，由维管束向地上部分迁移使植株萎蔫，直至死亡。由于青枯菌在环境中有较强的变异性，侵染不同植物的种型不同，产生不同的青枯专化型，加之青枯菌传播途径复杂，寄主范围较广，从而造成了防治上的困难。目前，主要从物理防治、化学防治、生物防治三个方面来防控病害，虽然在一定程度上能够减少青枯病引起的损失，但都无法从根本上有效控制该病的发生。由于各种耐药性病原菌不断出现，筛选高效防控青枯病的细菌越来越困难，寻找一种安全有效的方法迫在眉睫。
噬菌体作为一种病毒，主要以细菌为宿主，在自然界中普遍存在。噬菌体侵入会导致细菌细胞的裂解，破坏细菌的新陈代谢，并导致细菌自毁，通过噬菌体裂解细菌治疗病原菌感染的治疗手段称为噬菌体疗法。噬菌体还具有特异性、高效性等其他抗菌剂无法比拟的优点，逐渐成为新型药物开发的研究热点之一。通过国内外医学家的不懈努力，噬菌体在医学上发挥了重要作用，然而，对于噬菌体防控土传病害方面研究比较单一，大多数局限于研究烟草青枯病防治，对于防控番茄青枯病方面的研究尚少，因此，用噬菌体裂解病原菌来防控番茄青枯病害具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一株具有防控番茄青枯病的裂解性噬菌体NJ-P3，分析其各项生物学特性，探讨其对番茄青枯病的防治效果，利用病原菌特异性噬菌体对番茄青枯病进行生物防治，高效裂解细菌使其死亡，且对环境没有毒性；特异性强，不会破坏其他正常菌群，可保持土壤微生物平衡。
本发明的另一目的在于提供一种新型、高效的抗番茄青枯病噬菌体制剂。
本发明的另一目的在于提供利用该噬菌体防治番茄青枯菌的用途。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一株茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanancearum)专性噬菌体NJ-P3，分类命名为Podoviridae phage，于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M 2018099。
该茄科劳尔氏菌专性噬菌体NJ-P3分离自青枯病发病严重的根际土壤中，为有尾噬菌体目短尾噬菌体科。
该茄科劳尔氏菌专性噬菌体NJ-P3在防治番茄土传青枯病或制备防治番茄土传青枯病噬菌体制剂的应用。
一种防治土传青枯病的噬菌体制剂，该噬菌体制剂中包含上述的茄科劳尔氏菌专性噬菌体NJ-P3。作为进一步优选技术方案，该噬菌体制剂中噬菌体NJ-P3的含量≥108PFU/mL。
所述的噬菌体制剂的制备方法，包括：取本发明噬菌体溶液按照感染复数接入到对数生长期的青枯菌R.solanacearum菌液中，混匀，置于20～40℃、优选为30℃，170r/min摇床中振荡培养10h～24h使噬菌体增殖，将增殖培养后的共培养悬液离心，取上清液经0.22μm滤膜过滤，过滤得到噬菌体悬液，无菌水调节噬菌体浓度，得到噬菌体制剂。
所述的对数生长期的青枯菌R.solanacearum菌液中青枯菌的浓度为108CFU/mL。所述的青枯菌R.solanacearum菌液为QL-Rs1115菌液，通过以下方法制得：青枯菌QL-Rs1115菌液在SMSA选择性培养基上划线活化，30℃恒温培养箱中培养48h；挑取SMSA平板上形成的单菌落转接到50mL NA液体培养基中，30℃、170r/min摇床中培养24h，获得对数生长期的QL-Rs1115菌液。
所述的感染复数为0.01～0.1，优选为最佳感染复数0.1。
所述的共培养液12000r/min高速离心5min。
上述的噬菌体制剂在防治番茄土传青枯病的应用中效果显著。
一种防治番茄土传青枯病的方法，噬菌体制剂直接以灌根的方式接种到番茄植株根际，噬菌体的添加量为≥5×108PFU/株，优选为5×108PFU/株。
本发明的有益效果：
本发明的噬菌体能够特异性裂解青枯病病原菌，在温度20℃～40℃、pH＝5～9范围内噬菌体活性最高，裂解能力最强，均表现出较强的杀菌能力，室内抑菌试验显示其抑菌率达到了72.4％，可用于番茄土传青枯病的防治。将本发明噬菌体用于防治番茄土传青枯病，盆栽防病率达到60％，大田生防率可达85.19％，从根本上有效控制该病的发生。
附图说明
图1为噬菌体在双层平板上形成的噬菌斑；其中，6、7、8、9分别表示将噬菌体悬浮液用无菌水梯度稀释到106、107、108、109。
图2为噬菌体NJ-P3在电镜下的形态。
图3为噬菌体NJ-P3的系统发育树。
图4为噬菌体NJ-P3一步生长曲线。
图5为噬菌体NJ-P3对温度的耐受能力。
图6为噬菌体NJ-P3对酸碱的耐受能力。
图7为噬菌体NJ-P3的抑菌性能。
生物保藏信息：
噬菌体NJ-P3，分类命名为Podoviridae phage，于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M 2018099。
具体实施方式
实施例1青枯菌专性噬菌体的筛选
在江苏省南京市麒麟镇后村番茄大棚中青枯病发病区域采集得到番茄植株根际土壤样品，通过双层平板法筛选出一株具有高效裂解能力的青枯菌专性噬菌体NJ-P3。
1.1配制所需培养基：
NA液体培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、酵母粉0.5g、去离子水1000mL，pH 7.2～7.4，115℃高压灭菌30min。
NA半固体培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、酵母粉0.5g、10g琼脂粉、去离子水1000mL，pH 7.2～7.4，115℃高压灭菌30min。
NA固体培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、酵母粉0.5g、20g琼脂粉、去离子水1000mL，pH 7.2～7.4，115℃高压灭菌30min。
青枯菌选择性培养基(SMSA选择性培养基)：在1000mL NA固体培养基中依次加入TTC 50mg、结晶紫50mg、多粘菌素100mg、杆菌肽20mg、氯霉素5mg、放线菌酮50mg、青霉素5mg。
SM缓冲液：Mg SO4·7H2O 2.0g，NaCl 5.8g，1mol/L Tris-HCl(pH7.5)50mL，2％明胶5mL，加去离子水，定容至1000mL，分装后于121℃高压灭菌20min，4℃保存。SM缓冲液用于噬菌体的稀释及保存。
1.2青枯菌QL-Rs1115菌液制备
将-80℃超低温冰箱中保存的青枯菌QL-Rs1115[1](从江苏省南京市麒麟镇发病区的番茄植株根际中分离获得的具有强致病力的青枯菌)菌液在SMSA选择性培养基上划线活化，30℃恒温培养箱中培养48h。挑取单菌落转接到50mL NA液体培养基中，在30℃、170r/min摇床中培养24h，获得对数生长期的QL-Rs1115菌液，备用。
1.3青枯菌专性噬菌体的分离纯化
称取采集的番茄植株根际土壤样品10g于已灭菌三角瓶中，加入90mL无菌水混匀，放置于30℃、170r/min摇床中振荡培养12h，取出后静置2h。将富集好的土壤悬浮液转装到已灭菌的2mL离心管中，12000r/min高速离心5min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液即为噬菌体原液。取10mL对数生长期的QL-Rs1115菌液与150mL冷却至室温的NA半固体培养基混匀，立即倒入已凝固的NA固体培养基平板上制成双层平板(NA固体培养基平板厚度约占双层平板的1/3)，待上层培养基凝固后将平板分区，分别点接20μL的梯度稀释(101，102，103，104，105，106，107，108)的噬菌体原液，28℃倒置培养24h～48h，观察有无噬菌斑(图1)。当有噬菌斑出现后，分别挑取单个最大的噬菌斑接入到对数生长期的QL-Rs1115菌液中，摇匀并静置30min后放入摇床，在28℃条件下，170r/min振荡培养12h使噬菌体增殖，增殖培养后将共培养液12000r/min高速离心5min，取上清液经0.22μm滤膜过滤，所得滤液通过双层平板法进行操作，重复3～5次即可得到较纯的噬菌体溶液，并将此噬菌体命名为噬菌体NJ-P3，保存于4℃冰箱，备用。
挑取双层平板上单个较大噬菌斑加入至100mL对数生长时期的QL-Rs1115菌液中，将混合液中加DNasel及RNaseA至终浓度均为1μg/mL，37℃、170r/min摇床中振荡培养30min，取出，加入NaCl(5.84g/100mL)，振荡至完全溶解后，冰浴l h，在12000r/min下离心5min，去除菌体及杂质，收集上清液，加入固体PEG8000至终浓度10％(w/v)，轻揉振荡至完全溶解，继续冰浴l h，使噬菌体颗粒形成沉淀，4℃、12000r/min离心10min，弃尽上清液，按照每100mL QL-Rs1115菌液加2mL SM缓冲液混悬此沉淀，最后得到的即为噬菌体粗制颗粒，备用。取20μL噬菌体粗制颗粒用无菌水溶解滴在铜网上，静置使其自然沉淀15min，用滤纸在侧面将多余的液体吸去，然后滴一滴2％的PTA(磷钨酸)在铜网上对噬菌体颗粒进行染色，继续静置10min后用滤纸在侧面将多余的染色液吸走，继续静置大概5min左右使样品干燥。通过电子显微镜观察噬菌体的形态，如图2所示，噬菌体NJ-P3头部呈正六面体结构，且具有伸缩性短尾，属于短尾噬菌体科。
利用试剂盒(λ噬菌体DNA提取试剂盒，Abigen)按操作步骤提取噬菌体基因组DNA，利用NanoDrop 2000超微量分光光度计(美国NanoDrop公司)检测基因组DNA的纯度和浓度，送至上海美吉生物公司进行测序。
测序结果表明：噬菌体NJ-P3共有50个基因，总长42.5kb，G+C＝62.26％，A+T＝37.74％，国际病毒分类委员会(international committee on taxonomy of viruses，ICTV)召开的第九次报告中提出短尾噬菌体的基因组大小在16～78kb之间。将噬菌体NJ-P3的基因组序列与选定的一些标准噬菌体进行BLAST分析并构建系统发育树。如图3所示，噬菌体NJ-P3与NC022915.1Ralstonia phage RSK1的同源性最高，由基因组大小和同源性可以确定噬菌体NJ-P3属于有尾噬菌体目(Caudovirales)，短尾噬菌体科(Podoviridae)。
噬菌体NJ-P3，分类命名为Podoviridae phage，于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M 2018099。
实施例2青枯菌专性噬菌体NJ-P3的生物学特性测定
2.1噬菌体滴度测定
用无菌水作为稀释液，将纯化后的噬菌体NJ-P3溶液(实施例1)做连续10倍稀释。取10mL对数生长期的QL-Rs1115菌液与150mL冷却至30℃左右的NA半固体培养基混匀，立即倒入已凝固的NA固体培养基平板上制成双层平板，待上层培养基凝固后将平板分区，分别点接20μL的梯度稀释(101，102，103，104，105，106，107，108，109，1010)的噬菌体原液，28℃培养箱中倒置培养24h～48h，观察噬菌斑的形成情况并计数，上述各个稀释梯度分别做3个平行重复。计算噬菌体的滴度时，选取的平板上的噬菌斑的个数介于30～300之间，从适当稀释度中选择3个平行重复计算出平均数，即为噬菌体的滴度。噬菌体的滴度PFU/mL)＝平均噬菌斑数×50×稀释倍数。得出噬菌体滴度为2×1011PFU/mL。
2.2噬菌体最佳感染复数测定
感染复数(Multiplicity of infection，MOI)是指在噬菌体吸附并感染宿主菌之前，噬菌体同宿主菌之间数量的比值。最佳感染复数就是可以在最后得到最高产量的子代噬菌体的MOI。
取培养至对数生长时期的QL-Rs1115菌液，测定此时菌液OD600值并记录，将菌液依次加入48孔板中，然后按照0.001、0.01、0.1、1、10、100的MOI加入实施例1中纯化得到的噬菌体溶液，将混合液振荡混匀，放入30℃、170r/min摇床中振荡培养12h，抽取48孔板中的共培养悬液至已灭菌的2mL离心管中，13000r/min离心5min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，将离心并过滤后的噬菌体悬液用双层平板法进行滴度测定并记录，即可得出最佳感染复数。由表1可以看出，噬菌体NJ-P3的最佳感染复数为0.1。
表1噬菌体最佳感染复数考察结果
Figure BDA0001642269530000051
Figure BDA0001642269530000061
2.3噬菌体一步生长曲线测定
噬菌体制剂制备：实施例1纯化得到的噬菌体溶液按照最佳感染复数接入到对数生长期的青枯菌QL-Rs1115菌液(浓度为108CFU/mL)中，混匀，置于30℃，170r/min摇床中振荡培养12h使噬菌体增殖，将增殖培养后的共培养悬液12000r/min高速离心5min，取上清液经0.22μm滤膜过滤，过滤得到噬菌体悬液，无菌水调节噬菌体浓度为108PFU/mL。
培养QL-Rs1115至对数生长时期，依次加入到2mL已灭菌离心管中，并按照最佳感染复数加入噬菌体制剂，30℃水育30min，取出，13000r/min离心1min，弃上清液，用NA液体培养基洗涤3～5次，再用30℃预热的NA液体培养基重悬沉淀，置于30℃、170r/min的摇床中振荡培养，从0min开始，每间隔15min取出100μL，用无菌水做连续的10倍稀释之后用双层平板法测定滴度，将计算结果以噬菌体滴度对数值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制出噬菌体的一步生长曲线，如图4所示，噬菌体NJ-P3的潜伏期为30min，爆发期大约持续90min，裂解量为256。
2.4噬菌体热稳定性测定
取培养至对数生长时期的QL-Rs1115菌液150mL，依次加入700μL至无菌48孔板中，测量此时OD600值，并将此处OD600值命名为前期OD600值(0H，OD600值＝0.5)，备用。取8份噬菌体制剂，每份2mL，分别放在0℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅中水浴2h，将处理后的噬菌体制剂按照最佳感染复数加入到48孔板中，并做好标记，每个温度处理下设有三个平行重复，以不加噬菌体制剂为对照。置于30℃，170r/min摇床中振荡培养12h，用酶标仪测量此时OD600值，记为后期OD600值(12H)。由图5可以看出：噬菌体在0℃～50℃温度处理下均有较强的活性，在20℃～40℃时，噬菌体NJ-P3的活性最高，裂解能力最强。当处理温度达到60℃后菌液OD600值和对照基本持平，说明在60℃及以上温度处理下的噬菌体活性丧失。
2.5噬菌体对酸碱敏感性测定
取培养至对数生长时期的QL-Rs1115菌液150mL，依次加入700μL到无菌48孔板中，分别标记后测OD600值，并将此处OD600值命名为前期OD600值(0H)，备用。将噬菌体制剂分别加入到pH为3、4、5、6、7、8、9、10的已灭菌NA液体培养基(采用盐酸和氢氧化钠调节pH)中，28℃水浴2h，将处理后的噬菌体制剂按照最佳感染复数加入到48孔板中，并做好标记，对照处理不加入噬菌体制剂，每个pH处理下设有3个平行重复。置于30℃，170r/min摇床中振荡培养12h，用酶标仪测量此时OD600值，记为后期OD600值(12H)。由图6可以看出，pH在5～9范围内噬菌体均有杀菌能力，并且其在pH为7的环境下活性最高且最适合其生长。
实施例3室内抑菌试验
取培养至对数生长时期的青枯菌QL-Rs1115菌液50mL，用生理盐水调OD600至0.5，依次加入190μL到无菌96孔板中，按照噬菌体最佳感染复数依次加入噬菌体制剂(实施例2)，以不加入噬菌体制剂为对照(CK)，每个处理下设有3个平行重复。置于30℃、170r/min摇床中振荡培养36h，每隔4h用酶标仪测量OD600值，并记录。根据青枯菌的一步生长曲线来表征噬菌体的抑菌效果。由图7可以看出：加入噬菌体NJ-P3之后，青枯菌OD600值出现先上升后下降直至平稳的趋势，而未加入噬菌体的青枯菌OD600一直呈现上升趋势。与CK相比，噬菌体NJ-P3对青枯菌有较好的抑制效果，其抑菌率达到了72.4％。
实施例4盆栽防控试验
在江苏省宜兴南京农业大学重点实验室科研基地温室大棚中进行，采用盆钵试验检测噬菌体防控番茄青枯病的能力。
供试土壤为宜兴水稻土，番茄品种为上海合作903。
实验设置2个处理：对照(CK)：不加噬菌体；处理(NJ-P3)：灌根噬菌体。每个处理设有10～15个生物学重复。
具体如下：首先将新鲜番茄种子放置于温水中浸泡15min，然后用75％乙醇浸泡3min，用无菌水清洗3次，其次用5％次氯酸钠表面消毒5min，无菌水清洗5次。将消毒后的番茄种子均匀的平铺在含有滤纸的空白平板中(滤纸及平板均已灭菌)，加入适量无菌水，放入30℃恒温培养箱培养2～3天，期间随时向滤纸补充水分，使其保持湿润，直至种子发芽。然后在54孔育苗盘中装入适量育苗基质，每孔播种1～2粒发芽的番茄种子，用水浇透，30℃左右温室培养，期间适当浇水使基质保持湿润。待番茄幼苗长出3～4片真叶时，将育苗盘中的幼苗移栽至装有5kg宜兴水稻土的盆钵中，移栽过程中避免损伤幼苗根系，一周后接种QL-Rs1115菌液，接种浓度为108CFU/g土，待病原菌侵染4～5天后，沿着番茄幼苗根部缓慢浇灌浓度为108PFU/mL的噬菌体制剂5mL，对照未接种噬菌体。移栽30天后番茄发病率如表2所示，对照处理的番茄苗发病率达到83.33％，接种噬菌体的番茄苗发病率仅为33.34％，其对番茄青枯病的防控率达到60％，防控效果显著。
表2不同处理对番茄青枯病的防治效果
Figure BDA0001642269530000081
实施例5田间防控试验
在江苏省南京市麒麟镇后村农户塑料大棚中考察噬菌体防治番茄青枯病的能力。
供试土壤为大棚内番茄青枯病发病土壤。番茄品种为上海合作903，番茄苗由农户提供。
实验设置2个处理：对照(CK)：不加噬菌体；处理(NJ-P3)：灌根噬菌体。
具体如下：将农户移栽成活的番茄苗随机分成8个小区，每个处理4个小区，每个小区16棵番茄苗。待番茄苗移栽一周后，沿着番茄幼苗根部缓慢浇灌浓度为108PFU/mL的噬菌体制剂5mL，对照不做任何处理。移栽50天统计番茄发病率。
发病率(Disease Incidence，DI)的计算公式：
Figure BDA0001642269530000082
其中i为发病等级代表数值，imax为发病最高等级代表值，ni为发病等级为i的株数，N为某处理考察总株数。
生防率＝100×(对照发病率-处理发病率)/对照发病率。
如表3所示，未接种噬菌体的番茄苗发病率达到75％，接种噬菌体的番茄苗仅为11.11％，其对番茄青枯病的生防率达到85.19％，防控效果显著。
表3不同处理对番茄青枯病的防治效果
Figure BDA0001642269530000083
注：番茄青枯病发病等级分5级：0级表示植株正常；1级表示植株叶片萎蔫比例≤25％；2级表示26％≤植株叶片萎蔫比例≤50％；3级表示51％植株叶片萎蔫比例≤75％；4级表示76％≤植株叶片萎蔫比例，植株全部萎蔫或死亡。
参考文献：
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Claims (11)

1.一株具有防控番茄青枯病的裂解性噬菌体NJ-P3，分类命名为Podoviridae phage，于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2018099。
2.权利要求1所述的噬菌体NJ-P3在防治番茄土传青枯病的用途。
3.权利要求1所述的噬菌体NJ-P3在制备防治番茄土传青枯病噬菌体制剂的用途。
4.一种防治土传青枯病的噬菌体制剂，其特征在于噬菌体制剂中包含权利要求1所述的具有防控番茄青枯病的裂解性噬菌体NJ-P3。
5.根据权利要求4所述的防治土传青枯病的噬菌体制剂，其特征在于噬菌体制剂中噬菌体NJ-P3的含量≥108PFU/mL。
6.权利要求4或5所述的防治土传青枯病的噬菌体制剂的制备方法，其特征在于包括：噬菌体按照感染复数接入到对数生长期的青枯菌R.solanacearum菌液中，混匀，置于20～40℃、170r/min摇床中振荡培养12h使噬菌体增殖，将增殖培养后的共培养悬液离心，取上清液经0.22μm滤膜过滤，过滤得到的噬菌体悬液，无菌水调节噬菌体浓度，得到噬菌体制剂。
7.根据权利要求6所述的防治土传青枯病的噬菌体制剂的制备方法，其特征在于所述的对数生长期的青枯菌R.solanacearum菌液中青枯菌的浓度为108CFU/mL。
8.根据权利要求6所述的防治土传青枯病的噬菌体制剂的制备方法，其特征在于所述的感染复数为0.01～0.1。
9.根据权利要求8所述的防治土传青枯病的噬菌体制剂的制备方法，其特征在于所述的感染复数为0.1。
10.权利要求4或5所述的噬菌体制剂在防治番茄土传青枯病中的应用。
11.一种防治作物番茄土传青枯病的方法，其特征在于将权利要求4或5所述的噬菌体制剂接种到番茄植株根际，噬菌体的添加量为≥5×108PFU/株。
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