CN104560891A

CN104560891A - 一种烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法

Info

Publication number: CN104560891A
Application number: CN201510008306.6A
Authority: CN
Inventors: 蔡刘体; 陆宁; 石俊雄
Original assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Current assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Priority date: 2015-01-08
Filing date: 2015-01-08
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明公开了一种烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，它采用以下步骤：第一，取土样及样品处理，经滤膜过滤得滤液；第二，青枯菌株系培养获得青枯菌液；第三，将步骤一中的滤液与步骤二中的青枯菌液进行共培养；第四，噬菌体斑的挑选和保存；所用材料为无菌水、青枯菌株系、CPG培养基、琼脂粉、低熔点琼脂，其中CPG培养基包括CPG固体培养基和CPG液体培养基。该方法可以应用于从植烟土壤、青枯病病土土壤和污水中筛选青枯菌噬菌体资源，为研究利用青枯菌噬菌体防控烟草青枯病提供和收集青枯菌噬菌体资源。

Description

一种烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法

技术领域

本发明属于作物细菌性病害防控技术领域，具体涉及一种烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法。

背景技术

烟草青枯病是由革兰阴性细菌青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum，简称青枯菌）引起,是危害烟草的主要病害之一。青枯菌分布广泛，种性复杂，宿主众多，遗传多样性富丰，它能侵染50多个科中的200多种植物包括烤烟、马铃薯、西红柿、辣椒和香蕉等重要的农作物。在烟叶生产中，尽管选择种植抗性烟草品种，采用化学药剂防治，改善土壤结构以及合理轮作等综合措施加以防治，能够在一定程度上能减少烟草青枯病危害引起的损失，但仍无法有效控制烟草青枯病的发生，因此人们期望发展更安全和有效的方法和策略来防控青枯病。随着人们对环境安全和农产品安全要求的提高，随着抗生素的广泛使用以及耐药性或抗药性的出现，采用生物防控的方法引起了人们的关注，噬菌体疗法作为传统药物疗法的替代方法来防控细菌性病害被寄予厚望。噬菌体能在敏感宿主菌内快速增殖并使之裂解，这一特性赋予噬菌体作为病害细菌的天然“杀手”的能力，也在生物防控利用中具有应用潜力。因此建立快速有效的筛选青枯菌噬菌体资源的方法对于研究利用噬菌体防控烟草青枯病的新策略和手段有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，该方法应用于从植烟土壤、青枯病病土土壤和污水中筛选青枯菌噬菌体资源，为研究利用青枯菌噬菌体防控烟草青枯病提供和收集青枯菌噬菌体资源。

本发明的技术方案为：它采用以下步骤：第一，取土样及样品处理，经滤膜过滤得滤液；第二，青枯菌株系培养获得青枯菌液；第三，将步骤一中的滤液与步骤二中的青枯菌液进行共培养；第四，噬菌体斑的挑选和保存；所用材料为无菌水、青枯菌株系、CPG培养基、琼脂粉、低熔点琼脂，其中CPG培养基包括CPG固体培养基和CPG液体培养基。

在第一步骤中，所述的取土样及样品处理是指取植烟地块中发生烟草青枯病的病株和健康株之间的新鲜土壤，用0.5mm的筛子过筛，去除土壤中的石块、植物根细和残体等杂物；取过筛后的土壤小颗粒2.0g，用5.0ml无菌水浸泡过夜，以8000r/min的转速离心10min后，取上清液，用0.22μm的滤膜过滤，取滤液备用。

在第二步骤中，所述的青枯菌株系培养是指将青枯菌株系在CPG固体培养基上28℃培养20-24h，用无菌接种环把青枯菌菌体收集到装有10ml无菌水的试管中，充分混匀，用测定OD₆₀₀吸光值的方法控制青枯菌的浓度，把青枯菌浓度调节到1×10⁴cfu/ml备用。

在第三步骤中，所述的将步骤一中的滤液与步骤二中的青枯菌液进行共培养是指，在灭菌后的500ml三角瓶中，加入300mlCPG液体培养基，加入100μl步骤一制备的过滤液，然后加入300μl步骤二制备的青枯菌液，在28℃震荡培养2-3h。取120μl培养液，均匀涂布于预先准备好的CPG固体培养基上；同时，取20ml培养液，在4℃以8000rpm的转速离心10min后，取上清液，用0.22μm的滤膜过滤，取20μl、10μl、2μl、0μl分别与步骤二制备的100μl青枯菌液混匀，然后倒入事先灭菌好的浓度为0.7%[该百分比浓度指的是0.7%（m/v）]的3ml低熔点琼脂液中，混匀后倒入预先准备好的CPG固体培养基上。

在第四步骤中，所述的噬菌体斑的挑选和保存是指，将步骤三制备好的共培养培养皿，用保鲜膜或封口膜封好，在28℃培养箱中培养24-48h；以步骤三中制备的0μl加步骤二制备的100μl青枯菌液混匀的处理为对照，观察细菌斑，挑选单细菌斑，用灭过菌的10μl的枪头垂直接触目标噬菌斑，然后放入400μl的无菌水中，室温或4℃冰箱中保存1-2周；用灭过菌的10μl的枪头垂直接触目标噬菌斑，然后放入甘油终浓度为20%的400μl无菌甘油水溶液中，-80℃冰箱中保存。

CPG固体培养基采用以下方法制作：水解酪蛋白：1g；蛋白胨：10g；葡萄糖：5g；蒸馏水：1000ml；酸度调节到约pH7.0，加入琼脂粉，使之终浓度为1.5%(该百分比浓度为m/v)的，在121℃下灭菌30min；冷却至55℃左右，分装到培养皿中备用；CPG液体培养基采用以下方法制作：水解酪蛋白：1g；蛋白胨：10g；葡萄糖：5g；蒸馏水：1000ml；酸度调节到约pH7.0，在121℃下灭菌30min；冷却至55℃左右，分装到培养皿中备用。一般保存1-3年。

本发明的方法，需要的设备和资源简单，能快速有效的从土壤样品中分离到烟草青枯菌噬菌体，便于大量的筛选青枯菌噬菌体资源，构建青枯菌噬菌体库，弥补现有青枯菌噬菌体保存资源缺乏，克服现有技术中因培养、筛选噬菌体资源较慢，从而影响规模化、产业化将菌体资源用于生物防控领域的不足。

附图说明

图1为本发明的植烟土壤样品取样点示意图（照片）；

图2为本发明的培养基上形成的噬菌斑示意图（照片）。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进一步详细的说明，但实例不是对本发明的限定。

1 材料。

无菌水、青枯菌株系、CPG培养基、琼脂粉、低熔点琼脂、直径9cm的培养皿、控温培养箱、保鲜膜、吸水纸、接种坏、移液器、分光光度计、手术刀、酒精灯、打火机、超净工作台、高压灭菌锅等。青枯菌株系来源和宿主信息参见表1。

2 本发明的实施步骤如下：

第一，取土样及样品处理。植烟土壤从贵州省烟草科学研究院的福泉基地采获，取发生烟草青枯病的植烟土壤（病株于健康株之间）2.0g（见图1），用10ml浸泡，离心取上清液，用0.22μm的滤膜过滤法获得滤液，备用。0.22μm的滤膜过滤购自波尔公司（PALL corporation）。

表1 青枯菌的来源与宿主信息

第二，青枯菌培养。青枯菌的培养采用CPG培养基（10 g/L 蛋白胨，5g/L 蔗糖，1g/L 水解酪蛋白；固体培养基加1.6%的琼脂），28℃下培养。

第三，共培养，筛选噬菌体与扩繁。采用共培养的方法筛选青枯菌噬菌体，在28℃下共同培养，观察噬菌斑，筛选专一性噬菌体，无菌水室温保存，备用。

采用以青枯菌RsZP株系宿主供给的方式扩繁噬菌体ϕPB2。挑取ϕPB2单个噬菌斑，用青枯菌Rs ZP作为宿主，在平板上通过共培养方式扩增，然后用无菌水（3ml /平板）洗涤后，以8000r/min的转速离心培养液10min，取上清液，用0.22μm的滤膜过滤，获得高浓度的噬菌体。扩繁后的噬菌体ϕPB2滴度的测定采用10倍梯度稀释法结合噬菌斑计数法测定。

噬菌体ϕPB2与宿主的相互作用。采用CPG培养基，28℃下转速为120rmp条件下，培养宿主青枯菌4-6h，OD₆₀₀值约为0.1-0.2左右，吸取青枯菌液150μl与均匀涂布在CPG固体培养基上（重复3个平板），静置1h后，滴入收集好的噬菌体ϕPB2溶液，共培养30-48h，观察噬菌体。

第四，噬菌体斑的挑选和保存。所述的噬菌体斑的挑选和保存是指，将步骤三制备好的共培养培养皿，用保鲜膜或封口膜封好，在28℃培养箱中培养24-48h；以步骤三中制备的0μl加步骤二制备的100μl青枯菌液混匀的处理位对照，观察细菌斑，挑选单细菌斑，用灭过菌的10μl的枪头垂直接触目标噬菌斑，然后放入400μl的无菌水中，室温或4℃冰箱中保存1-2周；用灭过菌的10μl的枪头垂直接触目标噬菌斑，然后放入400μl终浓度含20%的甘油的无菌水中，-20℃冰箱中保存。

噬菌体在水体中存活情况的检测。滴度为105pfu/ml的噬菌体ϕPB2水溶液放置在室温中，10d，20d，30d，40d，50d后，采用上面描述的噬菌体斑检测法，确定噬菌体ϕPB2是否仍然有裂解宿主青枯菌RsZP等株系的特性。

结果与分析如下：

1）噬菌体ϕPB2裂解青枯菌形成的透明噬菌斑。

从病株和健康株之间取土样（图2 左），作为筛选噬菌体的土壤样品，从烟草青枯病地块的典型病株叶柄组织中分离和纯化青枯菌（代号为Rs ZP，图2 中），并作为筛选噬菌体的青枯菌宿主菌株。从土壤样品中筛选到青枯菌噬菌体（命名为ϕPB2），它具有侵染和裂解青枯菌Rs ZP，在平板上形成明显的透明噬菌体斑（图2）。

2）噬菌体ϕPB2侵染多个青枯菌株系。

表 2 噬菌体-宿主裂解性检测

注：表中“+”表示能形成透明的噬菌斑，“-”表示未出现透明的噬菌斑。

噬菌体-宿主相互作用实验检测显示，噬菌体ϕPB2能侵蚀裂解全部5株来自烤烟病株上的青枯菌株系（表1），能侵蚀裂解分辨来自花生和马铃薯的青枯菌株系Rs1.70和Rs1.74，但不能侵蚀分离自西红柿的青枯菌株系Rs1.71。

3）以RsZP为宿主，噬菌体斑检测结果表明，滴度为10⁵pfu/ml的噬菌体ϕPB2水溶液在室温中放置50d后，噬菌体ϕPB2仍然有裂解宿主青枯菌RsZP株系特性，平板上能观察到明显的透明斑，说明在常温下噬菌体ϕPB2在水体中能在较长时间段中保持裂解宿主青枯菌的特性。

Claims

1.一种烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，其特征在于：它采用以下步骤：第一，取土样及样品处理，经滤膜过滤得滤液；第二，青枯菌株系培养获得青枯菌液；第三，将步骤一中的滤液与步骤二中的青枯菌液进行共培养；第四，噬菌体斑的挑选和保存；所用材料为无菌水、青枯菌株系、CPG培养基、琼脂粉、低熔点琼脂，其中CPG培养基包括CPG固体培养基和CPG液体培养基。

2.根据权利要求1所述的烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，其特征在于：在第一步骤中，所述的取土样及样品处理是指取植烟地块中发生烟草青枯病的病株和健康株之间的新鲜土壤，用0.5mm的筛子过筛，去除土壤中的石块、植物根细和残体等杂物；取过筛后的土壤小颗粒2.0g，用5.0ml无菌水浸泡过夜，以8000r/min的转速离心10min后，取上清液，用0.22μm的滤膜过滤，取滤液备用。

3.根据权利要求1所述的烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，其特征在于：在第二步骤中，所述的青枯菌株系培养是指将青枯菌株系在CPG固体培养基上28℃培养20-24h，用无菌接种环把青枯菌菌体收集到装有10ml无菌水的试管中，充分混匀，用测定OD₆₀₀吸光值的得方法控制青枯菌的浓度，把青枯菌浓度调节到1×10⁴cfu/ml备用。

4.根据权利要求1所述的烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，其特征在于：在第三步骤中，所述的将步骤一中的滤液与步骤二中的青枯菌液进行共培养是指，在灭菌后的500ml三角瓶中，加入300mlCPG液体培养基，加入100μl步骤一制备的过滤液，然后加入300μl步骤二制备的青枯菌液，在28℃震荡培养2-3h；取120μl培养液，均匀涂布于预先准备好的CPG固体培养基上；同时，取20ml培养液，在4℃以8000rpm的转速离心10min后，取上清液，用0.22μm的滤膜过滤，取20μl、10μl、2μl、0μl分别与步骤二制备的100μl青枯菌液混匀，然后倒入事先灭菌好的浓度为0.7%的3ml低熔点琼脂液中，混匀后倒入预先准备好的CPG固体培养基上。

5.根据权利要求1所述的烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，其特征在于：在第四步骤中，所述的噬菌体斑的挑选和保存是指，将步骤三制备好的共培养培养皿，用保鲜膜或封口膜封好，在28℃培养箱中培养24-48h；以步骤三中制备的0μl加步骤二制备的100μl青枯菌液混匀的处理为对照，观察细菌斑，挑选单细菌斑，用灭过菌的10μl的枪头垂直接触目标噬菌斑，然后放入400μl的无菌水中，室温或4℃冰箱中保存1-2周；用灭过菌的10μl的枪头垂直接触目标噬菌斑，然后放入甘油终浓度为20%的400μl无菌甘油水溶液中，-80℃冰箱中保存。

6.根据权利要求1所述的烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法，其特征在于：CPG固体培养基采用以下方法制作：水解酪蛋白：1g；蛋白胨：10g；葡萄糖：5g；蒸馏水：1000ml；酸度调节到约pH7.0，加入琼脂粉，使之终浓度为1.5%，在121℃下灭菌30min；冷却至55℃左右，分装到培养皿中备用；CPG液体培养基采用以下方法制作：水解酪蛋白：1g；蛋白胨：10g；葡萄糖：5g；蒸馏水：1000ml；酸度调节到约pH7.0，在121℃下灭菌30min；冷却至55℃左右，分装到培养皿中备用。