CN103468646A - 一种高效筛选低温噬菌体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于从环境中高效筛选低温噬菌体的经济适用方法，可反复利用六孔细胞培养板，通过双层平板法筛选低温噬菌体，其采用的改良的PYGV底层培养基为组分含量为常规PYGV培养基组分含量1/10的培养基或者为缺少2×维生素和/或25%D-葡萄糖的1/10PYGV培养基，该方法所用培养基含量仅为普通方法的1/30，不但节约成本、经济，而且效率很高，在同样的培养时间和空间内，可提高效率近2.5倍，适用于实验室和现代生物工程中环境中低温噬菌体的分离等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于筛选低温噬菌体的高效、经济的方法，特别涉及一种以六孔细胞板替代双层平板培养平皿以及利用改良的贫营养培养基筛选低温噬菌体的方法。
背景技术
噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称。噬菌体分布极广，凡是有细菌的场所，就可能有相应噬菌体的存在，其总量达1031单位，对生物尤其是其他微生物的进化影响深刻。噬菌体由于结构简单、基因组小、便于操作等优点，常常被用作生物基因复制及表达调控研究的模型，对近现代生物化学与分子生物学的发展做出了突出的贡献。
从自然环境温度来看，低温环境分布最广，生物圈约80%以上为常年低于5℃的低温地区，而噬菌体在低温生物圈包括极地水环境、海洋、高原湖泊以及冰雪冰川等生境中的丰度非常高，通常能达到105-108ml-1。低温噬菌体是指在小于等于4℃的条件下能侵染宿主并增殖的细菌病毒。在这些低温环境中，低温噬菌起着非常重要的生态作用。近年来，由于气候变暖，给全球水生生物圈如海洋、湖泊、冰川、湿地等带来了非常显著的影响，而低温噬菌体作为这类环境中的一个重要的动态组成部分，就其多样性研究及其在生态系统中的作用受到了科学家的高度重视，也是目前现代微生物学和微生物生态学的研究热点之一。因此，分离和鉴定有价值的低温噬菌体及其功能基因已成为当代国际微生物研究领域的重要工作。
传统的常温及高温噬菌体分离筛选通常是利用直径为9 cm的平板，通过双层琼脂平板法分离噬菌体：底层平板为固体培养基，上层半固体培养基以琼脂作为凝固剂。双层平板法又叫双层琼脂平板法，先在直径为9 cm的培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后待用。融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入敏感指示菌菌液，待检样品液或上述噬菌体增殖液，混合后立即倒入上层平板铺平。培养一段时间后，如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑---噬菌斑，计算噬菌斑的数量。双层平板法需要分别制作两次平板，大量使用时需要耗费大量时间来制备。
目前报道的低温噬菌体的分离培养基为LB培养基、PYGV培养基等，本发明利用改良的PYGV培养基分离得到的低温噬菌体多于PYGV培养基分离到的低温噬菌体，而且节约成本；同时，六孔细胞培养板具有良好的透明度，适用于观察噬菌斑。以六孔细胞培养板分离噬菌体经济、适用、提高效率。
发明内容
本发明旨在于提供一种经济、适用、大量快速筛选低温噬菌体的方法，该方法上层半固体平板是以琼脂糖而不是琼脂作为培养基的组分配制而成；二是分离培养基采用贫营养的1/10含量PYGV固体培养基或者为缺少2×维生素和/或25% D-葡萄糖的1/10含量PYGV培养基。
本发明方法的具体步骤如下：
（1）低温宿主菌的分离将采集的土样或水样，通过常规稀释平板法在改良的PYGV培养基上、15-28℃条件下分离纯化得到不同种类的低温宿主菌，将分离得到的低温宿主菌分别接种到改良的液体PYGV培养基中，10-28℃下150rpm培养10-18h，直到宿主菌的浓度达到107-109CFU/ml；
（2）噬菌体富集液的制备
将采集的土样或水样加入到改良的液体PYGV培养基中，置于4-15℃静置培养1-2周，吸取富集液，离心去除菌体，然后通过0.22μm的滤膜过滤，滤液即为噬菌体富集液，用于噬菌体的分离，其中样品和液体培养基混合的比列为5-10g土样或5-10ml水样加入到100ml培养基；
（3）双层平板法分离低温噬菌体
采用六孔细胞培养板作为培养皿，先在六孔细胞培养板中倒入改良的PYGV底层培养基，凝固后待用；
上层半固体培养基采用3-5g/L的琼脂糖作为凝固剂，其余成分同改良的PYGV底层培养基；
分离低温噬菌体：将100-300μl噬菌体富集液分别与200-400μl不同宿主菌菌液混合，10-28℃静置10-30min，然后加入2-3mL加热融化并冷却至20-30℃上层半固体培养基，混匀，倒入改良的PYGV底层培养基上，形成双层平板，10-28℃培养2-3d，观察噬菌斑产生情况；
（4）低温噬菌体纯化
用牙签挑取单个噬菌斑，接种于液体PYGV培养基中，经稀释后重复噬菌斑实验，直至噬菌斑的大小和形态特征保持均匀和一致，即得到纯化的低温噬菌体；
其中所述改良的PYGV底层培养基为1/10PYGV培养基，即组分含量为常规PYGV培养基组分含量1/10的培养基（不包括琼脂，琼脂的量为15-20g/L），或者为缺少2×维生素和/或25% D-葡萄糖的1/10PYGV培养基。
1/10 PYGV培养基即为除琼脂外的组分含量为常规PYGV培养基组分含量1/10的培养基，固体培养基琼脂的使用量为15-20g/L，液体培养基不添加琼脂。
本发明中所述噬菌体富集液的滴度为105-107PFU/ml。
本发明中所述常规PYGV培养基的成分包括如下：
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，Hutner’ basal 20mL/L，25% D-葡萄糖 10mL/L，2×维生素 5m/L；
其中：Hutner’ basal营养离子盐溶液为：MgSO4·7H2O 29.7g/L，氮三乙酸 10g/L，CaCl2·2H2O 3.35g/L，FeSO4·7H2O 99mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 9.25mg/L，Metals 44 50ml/L；
Metals 44 溶液成份为：ZnSO4·7H2O 10.95g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，Sodium EDTA 2.5g/L，MnSO4·H2O 1.54g/L，CuSO4·5H2O 392mg/L，Co(NO3)2·6H2O 248mg/L，Na2B4O7·10H2O 177mg/L；
2×维生素溶液配方如下：盐酸维生素B6 20mg/L，p-对氨基苯甲酸 10mg/L，泛酸钙 10mg/L，烟酰胺 10mg/L，维生素B2 10mg/L，盐酸硫胺素10mg/L，生物素 4mg/L，叶酸4mg/L，维生素B12 0.2mg/L。
本发明的优点和技术效果如下：
传统双层平板的缺陷，以直径为9cm的培养皿来分离低温噬菌体，制作下层平板时需要一块一块的制作平板。操作麻烦，花费时间较多，同时增加了培养基染菌的风险。而用六孔细胞培养板来分离低温噬菌体制板时一次可以得到相当于6个9cm的培养皿所得的平板，大大增加了效率；在倒上层平板时，不能让半固体培养基温度过低，否则琼脂糖凝固会造成实验失败，使用六孔细胞培养板时，速度提升了，由于琼脂糖凝固而造成实验失败的风险就会大大降低。
在分离低温噬菌体的过程中，往往需要对样品进行稀释，使其中的病毒达到一个合适的丰度，以便形成清晰的噬菌斑，进行后续的分离鉴定。在分离之初，对原始样品中的病毒丰度难以精确估计，不好确定稀释梯度，所以一次要用很多的平板来做平行梯度。利用六孔细胞培养板来做分离，可以在一块板上做六个梯度，并且便于同一组稀释梯度之间的比较。在初期盲筛低温噬菌体的过程中，这种高通量的筛选办法大大减少了工作量，提高了效率。
低温环境通常为贫（寡）营养的，因此本发明采用改良的贫营养培养基PYGV来分离低温噬菌体，而在实际操作中仅使用1/10含量改良的培养基即可达到较好的分离效果，本发明利用培养细胞的六孔板来分离低温噬菌体，细胞培养板不但提供细胞体外培养环境，还具有更好的透明度，适用于观察噬菌斑。该方法所用培养基含量较少，不但节约成本、经济，而且节省培养空间，在相同的培养时间和空间中，可提高效率近2.5倍。
本发明中用0.3-0.5%的琼脂糖代替琼脂作为凝固剂，作为胶凝剂的琼脂糖是不含硫酸酯（盐）的非离子型多糖，是形成凝胶的组分。琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35℃左右时形成良好的半固体状的凝胶，低熔点琼脂糖的凝固温度可以低到8-17℃。因此相对于琼脂而言，琼脂糖的凝固温度更低，适合低温噬菌体的分离；而分离常温及高温噬菌体采用的琼脂，其形成凝胶的温度在40℃以上，不适合分离低温噬菌体。
附图说明
图1 为本发明采用六孔细胞培养板分离低温噬菌体结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图，用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：改良的PYGV培养基筛选分离低温噬菌体的方法，具体内容如下：
（1）低温宿主菌的分离：将采集自云南省纳帕海湿地的土样或水样，采用固体改良的PYGV培养基通过稀释平板法在15℃下分离不同的低温细菌，划线得到单菌落，作为可能的宿主菌，用无菌接种环挑取一环单菌落，接种于改良的液体PYGV培养基中，15℃，150rpm培养16h，直到宿主菌的浓度达到约108CFU/ml；
（2）噬菌体富集液的制备
将采集自云南省纳帕海湿地的土样或水样加入到改良的液体PYGV培养基中（其中10g土样加入到100ml培养基中，10ml水样加入到100ml培养基中），置于15℃静置培养1-2周，吸取富集液，5000rpm离心5min以去除菌体，然后通过0.22μm的滤膜过滤，滤液即为噬菌体富集液，用于噬菌体的分离；
（3）双层平板法分离低温噬菌体
采用六孔细胞培养板作为培养皿，先在六孔细胞培养板中倒入改良的PYGV底层培养基，凝固后待用；
上层半固体培养基采用4g/L的琼脂糖作为凝固剂，其余成分同改良的PYGV底层培养基；
分离噬菌体：将100μl噬菌体滤液（滴度107PFU/ml）分别与200μl不同宿主菌菌液（浓度108CFU/ml）混合，15℃静置10min，然后加入2mL左右加热融化并冷却至30℃上层半固体培养基，混匀，倒入改良的PYGV底层培养基上，形成双层平板，15℃培养2-3d，观察噬菌斑产生情况；
（4）噬菌体纯化
用牙签挑取单个噬菌斑，浸泡于改良的液体PYGV培养基中，经稀释后重复噬菌斑实验，直至噬菌斑的大小和形态特征保持均匀和一致，即得到纯化的噬菌体；
其中改良的PYGV培养基为除琼脂外组分含量为常规PYGV培养基组分含量1/10的培养基；固体培养基琼脂的使用量为15g/L，液体培养基不添加琼脂。
分离到的低温噬菌体种类结果见表1和表5，从表1和表5可以看到采用改良后的培养基分离效果优于完全培养基，筛选得到16种低温噬菌体，大多为肌尾科噬菌体，也分离到少量的长尾、复层及短尾科噬菌体；其宿主菌分别属于假单胞菌属、黄杆菌属、微小杆菌属、芽孢杆菌属及节杆菌属的菌株。
表1：改良的PYGV培养基1分离到的低温细菌及低温噬菌体
实施例2：改良的PYGV培养基筛选分离低温噬菌体的方法，具体内容如下：
（1）低温宿主菌的分离：将采集自云南省纳帕海湿地的土样或水样，采用固体改良的PYGV培养基通过稀释平板法在20℃下分离不同的低温细菌，划线得到单菌落，作为可能的宿主菌，用无菌接种环挑取一环菌落，接种于液体PYGV培养基中，10℃，150rpm培养18h，直到宿主菌的浓度达到约107CFU/ml；
（2）噬菌体富集液的制备
将采集自云南省纳帕海湿地的土样或水样加入到改良的液体PYGV培养基中（其中8g土样加入到100ml培养基中，8ml水样加入到100ml培养基中），置于4℃静置培养1-2周，吸取富集液，5000rpm离心5min以去除菌体，然后通过0.22μm的滤膜过滤，滤液即为噬菌体富集液，用于噬菌体的分离；
（3）双层平板法分离低温噬菌体
采用六孔细胞培养板作为培养皿，先在六孔细胞培养板中倒入改良的PYGV底层培养基，凝固后待用；
上层半固体培养基采用3g/L的琼脂糖作为凝固剂，其余成分同改良的PYGV底层培养基；
分离噬菌体：将300μl噬菌体滤液（滴度106PFU/ml）分别与300μl不同宿主菌菌液（浓度107CFU/ml）混合，10℃静置30min，然后加入2.5mL左右加热融化并冷却至20℃上层半固体培养基，混匀，倒入改良的PYGV底层培养基上，形成双层平板，10℃培养2-3d，观察噬菌斑产生情况；
（4）噬菌体纯化
用牙签挑取单个噬菌斑，浸泡于液体PYGV培养基中，经稀释后重复噬菌斑实验，直至噬菌斑的大小和形态特征保持均匀和一致，即得到纯化的噬菌体（见表1）；
其中改良的PYGV培养基为缺少2×维生素的1/10PYGV培养基，1/10PYGV培养基为除琼脂外组分含量为常规PYGV培养基组分含量1/10的培养基；固体培养基琼脂的使用量为20g/L，液体培养基不添加琼脂。
分离到的低温噬菌体种类结果见表2和表5，从表2和表5可以看到采用改良后的培养基分离效果优于完全培养基，筛选到14种低温噬菌体，其宿主菌分别属于芽孢杆菌属、假单胞菌属及黄杆菌属的菌株；分离到的低温噬菌体为大多为肌尾科噬菌体，也分离到少量的长尾科及短尾科噬菌体。
表2：改良的PYGV培养基2分离到的低温细菌及低温噬菌体 
实施例3：改良的PYGV培养基筛选分离低温噬菌体的方法，具体内容如下：
（1）低温宿主菌的分离：将采集自云南省纳帕海湿地的土样或水样，采用固体改良的PYGV培养基通过稀释平板法在28℃下分离不同的低温细菌，作为可能的宿主菌，用无菌接种环挑取一环菌落，接种于改良的液体PYGV培养基中，20℃，150rpm培养12h，直到宿主菌浓度达到约108CFU/ml；
（2）噬菌体富集液的制备
将采集自云南省纳帕海湿地的土样或水样加入到液体PYGV培养基中（其中10g土样加入到100ml培养基中，10ml水样加入到100ml培养基中），置于10℃静置培养1-2周，吸取富集液，5000rpm离心5min以去除菌体，然后通过0.22μm的滤膜过滤，滤液即为噬菌体富集液，用于噬菌体的分离；
（3）双层平板法分离低温噬菌体
采用六孔细胞培养板作为培养皿，先在六孔细胞培养板中倒入改良的PYGV底层培养基，凝固后待用；
上层半固体培养基采用5g/L的琼脂糖作为凝固剂，其余成分同改良的PYGV底层培养基；
分离噬菌体：将200μl噬菌体滤液（滴度105 PFU/ml）分别与400μl不同宿主菌菌液（浓度108/ml）混合，28℃静置20min，然后加入3mL左右加热融化并冷却至25℃上层半固体培养基，混匀，倒入改良的PYGV底层培养基上，形成双层平板，28℃培养2-3d，观察噬菌斑产生情况；
（4）噬菌体纯化
用牙签挑取单个噬菌斑，浸泡于液体PYGV培养基中，经稀释后重复噬菌斑实验，直至噬菌斑的大小和形态特征保持均匀和一致，即得到纯化的噬菌体；
其中所述改良的PYGV培养基为缺少25% D-葡萄糖的1/10PYGV培养基，1/10PYGV培养基为除琼脂外组分含量为常规PYGV培养基组分含量1/10的培养基；固体培养基琼脂的使用量为18g/L，液体培养基不添加琼脂。
分离到的低温噬菌体种类结果见表3和表5，从表3和表5可以看到采用改良后的培养基分离效果优于完全培养基，筛选到15种低温噬菌体，大多为肌尾科噬菌体，也分离到少量的长尾科及短尾科噬菌体；其宿主菌分别属于假单胞菌属、芽孢杆菌属及黄杆菌属的菌株。
表3：改良的PYGV培养基3分离到的低温细菌及低温噬菌体
实施例4：方法同实施例1，不同在于改良的PYGV底层培养基为缺少25% D-葡萄糖和2×维生素的1/10PYGV培养基，1/10PYGV培养基为除琼脂外组分含量为常规PYGV培养基组分含量1/10的培养基；固体培养基琼脂的使用量为15g/L，液体培养基不添加琼脂。
分离到的低温噬菌体种类结果见表4和表5，从表4和表5可以看到采用改良后的培养基分离效果优于完全培养基，筛选到14种低温噬菌体，大多为肌尾科噬菌体，也分离到少量的长尾科及短尾科噬菌体；其宿主菌分别大多属于假单胞菌属和芽孢杆菌属的菌株。
表4：改良的PYGV培养基4分离到的低温细菌及低温噬菌体
表5：不同种类PYGV培养基组份及低温噬菌体分离效果
成本分析：利用直径为9 cm的培养皿制备双层平板：底层培养基约10-15ml/皿，上层半固体约3.5-4ml；而利用六孔细胞培养板制备双层平板：底层培养基约3-4ml/皿，上层半固体约1.5-3ml。因此，制备一个样品，节约培养基约3倍。由于采用1/10含量的PYGV培养基，因此节约培养基共约30倍。若采用培养基2、3或者4，更可以进一步节约培养基，节约成本，如果大量分离低温噬菌体，且不做阴性和空白对照，以100株宿主菌为例，则需要100个培养皿，至少占用培养箱9500cm3的空间；而用六孔板只需要17个即可，仅占用培养箱3800cm3的空间，节约了60%的培养空间。而且一般细胞培养板在细胞相关实验中难以重复使用，而将废弃的六孔细胞经过紫外照射处理，又可以重复作为大量分离低温噬菌体的工具，废物利用，大大节省了实验室开支。故利用六孔培养基分离低温噬菌体经济适用、节省空间，对于实验室大量分离低温噬菌体不失为一个好的方法。
Claims (2)
1.一种高效筛选低温噬菌体的方法，其特征在于具体操作步骤如下：
（1）低温宿主菌的分离
将采集的土样或水样，通过常规稀释平板法在改良的PYGV培养基上、15-28℃条件下分离纯化得到不同种类的低温宿主菌，将分离得到的低温宿主菌分别接种到改良的液体PYGV培养基中，10-28℃下150rpm培养10-18h，直到宿主菌的浓度达到107-109CFU/ml；
（2）噬菌体富集液的制备
将采集的土样或水样加入到改良的液体PYGV培养基中，置于4-15℃静置培养1-2周，吸取富集液，离心去除菌体，然后通过0.22μm的滤膜过滤，滤液即为噬菌体富集液，用于噬菌体的分离，其中样品和液体培养基混合的比例为5-10g土样或5-10ml水样加入到100ml培养基；
（3）双层平板法分离低温噬菌体
采用六孔细胞培养板作为培养皿，先在六孔细胞培养板中倒入改良的PYGV底层培养基，凝固后待用；
上层半固体培养基采用3-5 g/L的琼脂糖作为凝固剂，其余成分同改良的PYGV底层培养基；
分离低温噬菌体：将100-300μl噬菌体富集液分别与200-400μl不同宿主菌菌液混合，10-28℃静置10-30 min，然后加入2-3mL加热融化并冷却至20-30℃上层半固体培养基，混匀，倒入改良的PYGV底层培养基上，形成双层平板，10-28℃培养2-3d，观察噬菌斑产生情况；
（4）低温噬菌体纯化
挑取单个噬菌斑，接种于改良的液体PYGV培养基中，经稀释后重复噬菌斑实验，直至噬菌斑的大小和形态特征保持均匀和一致，即得到纯化的低温噬菌体；
其中所述改良的PYGV底层培养基为组分含量为常规PYGV培养基组分含量1/10的培养基或者为缺少2×维生素和/或25% D-葡萄糖的1/10PYGV培养基。
2.根据权利要求1所述高效筛选低温噬菌体的方法，其特征在于：噬菌体富集液的滴度为105-107PFU/ml。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104560891A (zh) * | 2015-01-08 | 2015-04-29 | 贵州省烟草科学研究院 | 一种烟草青枯菌噬菌体资源的筛选方法 |
| CN110129279A (zh) * | 2019-04-24 | 2019-08-16 | 昆明理工大学 | 一种粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用 |
| CN110172451A (zh) * | 2019-05-05 | 2019-08-27 | 昆明理工大学 | 一种高通量分离噬菌体的方法 |
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