CN110129279A - 一种粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用，属于生物工程领域。该噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为:CCTCC NO:M 2019276，保藏日期为2019年4月19日，该噬菌体对粪肠球菌有强的裂解作用。在本发明中，该噬菌体从电镜形态上分析，属于典型的有尾噬菌体，肌尾科噬菌体，将其命名为粪肠球菌噬菌体PEf771；噬菌体PEf771感染温度范围在20～42℃；噬菌体PEf771在pH 4～8均有70％以上活性，噬菌体PEf771热稳定性不佳，不能耐受60℃以上长时间高温。采用本发明的噬菌体能特异性裂解粪肠球菌。在应用实例也证实，该噬菌体可用于由粪肠球菌引起的细菌感染，作为抗生素的替代品，安全有效的维护口腔微生态。

Description

一种粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用，尤其涉及一种难治性根尖周炎粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用。
背景技术
噬菌体是一类以原核微生物为宿主的病毒，被发现广泛存在于自然环境中，种类复杂多样，地球上约有1030～1032个噬菌体，其数量相当于细菌的十几倍甚至几十倍。几乎每一个细菌都有其对应的噬菌体。噬菌体结构简单，仅由衣壳蛋白和其内部的遗传物质组成，缺乏独立代谢能力，依靠宿主细胞的核糖体、蛋白质来合成自身生长和增殖所需的各种因子、各种氨基酸和能量。一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制，进入静止期。
口腔疾病中牙髓炎和根尖周炎发病率高，根管治疗术是治疗根管内感染的首选的方法。通过根管预备、消毒和充填等步骤能有效清除根管内的感染源，阻止病变的发生发展，促进根尖周病灶的愈合。但是临床上有部分患者经过反复多次规范根管治疗后仍出现根尖周脓肿和进行性骨质破坏，导致牙槽骨缺损和牙齿丧失，即难治性根尖周炎。严重影响患者的生存质量，是牙髓病临床治疗的新难点，也是口腔医师面临的棘手问题。研究表明，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是根管治疗后再感染和难治性根尖周炎的主要病原菌，甚至是唯一检出细菌，因此，控制粪肠球菌感染在根管治疗中十分重要，彻底清除粪肠球菌感染是提高难治性根尖炎治愈率的关键。噬菌体能特异性与宿主细菌结合，而且只感染原核细胞，不感染真核细胞，对人和动物无害，为控制难治性根尖周炎粪肠球菌感染提供了一种有效快捷的解决方法。噬菌体因其高效的杀菌能力及高度的宿主专一性而成为新一代抗菌制剂的候选。具有潜在的开发价值。
发明内容
本发明提供了一种粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用，旨在口腔疾病中牙髓炎和根尖周炎发病率高，以及粪肠球菌面临的耐药性问题。
本发明的目的在于提供一种粪肠球菌噬菌体，该噬菌体保藏于：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏号为:CCTCC NO:M2019276，保藏日期为2019年4月19日，该噬菌体对粪肠球菌有强的裂解作用。在本发明中，该噬菌体从电镜形态上分析，属于典型的有尾噬菌体，肌尾噬菌体科(Myoviridae)，将其命名为粪肠球菌噬菌体PEf771；噬菌体PEf771感染温度范围在20～42℃；噬菌体PEf771在pH4～8均有70％以上活性，噬菌体PEf771热稳定性不佳，不能耐受60℃以上长时间高温。
一种粪肠球菌噬菌体的分离、纯化以及富集方法，其特征在于，该方法步骤如下：
1、宿主菌的准备：以粪肠球菌E.faecalisYN771作为分离噬菌体的宿主菌，该菌株于2019年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC NO:M 2019275，将粪肠球菌YN771，在BHI固体培养基上划线，32～40℃恒温孵育20～30h，然后挑取单菌落接种于5mL BHI液体培养基中，培养至对数生长早期OD为0.3，供分离粪肠球菌噬菌体用；
2、噬菌体的分离：以分离的培养至对数生长早期OD为0.3的粪肠球菌YN771为宿主菌，从昆明医科大学附属延安医院口腔科污水口取回的未经氯水处理的污水为样本，两者富集培养，2～8℃，8000～11,000rpm离心9～12min，收集上清液，用0.40～0.48μm无菌滤膜抽滤，再用0.20～0.24μm无菌滤膜过滤，收集滤液。将过滤液7倍稀释，从每个稀释梯度中分别取80～130μL与280～320μL宿主菌液混合，放置32～40℃恒温箱中静止吸附12～15min，然后加入冷却至40℃、琼脂浓度为0.75％的BHI半固体培养基4～8mL，混匀后快速的倾倒于普通BHI固体培养基上，形成双层平板。超净工作台下静置12～18min，使其充分凝固，倒置于37℃恒温箱静置培养。10～13h后，观察到BHI双层平板上长出边缘清晰的噬菌斑；
3、噬菌体的纯化：以分离的培养至对数生长早期OD为0.3的粪肠球菌YN771为宿主菌，用无菌棒挑取噬菌体单个噬菌斑，接种到宿主菌液中，32～40℃120～170rpm，培养10～24h。取混合物8000～11,000rpm离心9～12min，收集上清液，先用0.40～0.48μm微孔滤膜抽滤，再用0.20～0.24μm无菌微孔滤膜过滤。采用双层琼脂平板法分离噬菌体，将过滤液十倍稀释，从每个稀释梯度中分别取80～130μL与280～320μL宿主菌液混合，放置32～40℃恒温箱中静止吸附12～15min，然后加入冷却至40℃、琼脂浓度为0.75％的BHI半固体培养基4～8mL，混匀后快速的倾倒于新鲜BHI固体培养基上，形成双层平板。实验重复三次以上纯化，当看到双层平板上形成形态大小均一的噬菌斑时，将最后一次得到的单个噬菌斑取出，接种到处于宿主菌液中，32～40℃120～170rpm过夜振荡培养。取混合物8000～11,000rpm离心9～12min，收集上清液，先用0.40～0.48μm微孔滤膜抽滤，再用0.20～0.24μm无菌微孔滤膜过滤，得到的即为噬菌体原液，4℃保存备用。
4、噬菌体的富集
以分离的培养至对数生长早期OD为0.3的粪肠球菌YN771为宿主菌，加入效价为108pfu/mL的噬菌体原液12～18mL，放置32～40℃恒温箱中静止吸附9～12min，32～40℃，120～170rpm，培养10～24h，将混合液8000～11,000rpm离心9～12min，收集上清液，除菌。十倍稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7备用。
在超净工作台中取出4mL高温灭菌后的EP管，加入各个稀释梯度的噬菌体80～130μL，每管中分别加入280～320μL的对数生长早期OD为0.3的粪肠球菌YN771，做好编号标记，在37℃恒温箱中静止吸附9～12min，得到的即为噬菌体富集液。
本发明还有一个目的将一种粪肠球菌噬菌体用于抑制粪肠球菌。
本发明还有一个目的将一种粪肠球菌噬菌体用于制备一种控制粪肠球菌感染的抗生素替代品。
本发明还有一个目的将一种粪肠球菌噬菌体作为安全的生物消毒剂用于维护口腔微生态。
本发明还有一个目的将一种粪肠球菌噬菌体作为一种药物治疗由粪肠球菌感染引起的疾病。
进一步，本发明将一种粪肠球菌噬菌体用于抑制粪肠球菌YN771。
进一步，本发明将一种粪肠球菌噬菌体用于制备一种控制粪肠球菌YN771感染的抗生素替代品。
进一步，本发明将一种粪肠球菌噬菌体作为一种药物治疗由粪肠球菌YN771感染引起的难治性根尖周炎。
本发明提供了一种粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用，该噬菌体对粪肠球菌具有强的裂解作用，为大量生产噬菌体用于抑制粪肠球菌提供了噬菌体来源；该噬菌体还可以作为抗生素的替代品，减少抗生素的使用；该噬菌体还可作为安全的生物消毒剂用于维护口腔微生态，从而减少口腔疾病的发生；该噬菌体还可作为药物治疗由粪肠球菌引起的细菌感染，预防和治疗粪肠球菌引起的细菌感染的疾病。
附图说明
图1为双层平板中噬菌斑形态
图2透射电子显微镜下噬菌体PEf771形态
图3噬菌体PEf771一步生长曲线
图4噬菌体PEf771的温度耐受性
图5噬菌体PEf771的pH值耐受性
图6滇南小耳猪颌骨标本
图7各组牙颌骨组织HE染色，其中，A：空白组：开髓+消毒；B：实验组:开髓+消毒+接种病原菌YN771+噬菌体PEf771；C：对照组-2：开髓+根管治疗+接种病原菌YN771；D：对照组-1：开髓+消毒+接种病原菌YN771
图8各组牙颌骨组织CT，其中，1表示空白组(消毒组)：开髓+消毒。CT未发现根尖暗影，无根尖周炎形成；2表示对照组-1(消毒后感染组)：开髓+消毒+接种粪肠球菌。CT发现根尖暗影，根尖周炎形成；3表示对照组-2(根管治疗后感染组)：开髓+根管治疗+接种粪肠球菌。CT发现根尖暗影，根尖周炎形成。4表示实验组(消毒后感染+噬菌体):开髓+消毒+接种粪肠球菌+噬菌体。CT未发现根尖暗影，无根尖周炎形成。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
本发明试验涉及的菌株：一株粪肠球菌Enterococcusfaecalis YN771，于2019年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC NO:M 2019275。
本噬菌体，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏号为:CCTCC NO:M 2019276，保藏日期为2019年4月19日，分类名称为：粪肠球菌噬菌体PEf771(Enterococcusfaecalis bacteriophage PEf771)。
心脑培养基(Brain Heart Infusion)：简称BHI培养基，OXOID，英国贝星斯托克。按照说明书，称取37g培养基，加入800mL纯水，充分搅拌至全部溶解，定容至1L，完成BHI液体培养基的制备。
BHI固体培养基：在BHI液体培养基中加入1.5％琼脂粉；制备BHI半固体培养基：在BHI液体培养基时加入0.75％琼脂粉。121℃高压灭菌20min后备用。
实验例1粪肠球菌噬菌体的分离、纯化
1、宿主菌的准备：以粪肠球菌E.faecalis YN771作为分离噬菌体的宿主菌，该菌株于2019年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2019275，将粪肠球菌YN771，在BHI固体培养基上划线，37℃恒温孵育24h，然后挑取单菌落接种于5mLBHI液体培养基中，培养至对数生长早期OD600为0.3，供分离粪肠球菌噬菌体用。
2、噬菌体的分离：以分离的培养至对数生长早期OD600为0.3的粪肠球菌YN771为宿主菌，从昆明医科大学附属延安医院口腔科污水口取回的未经氯水处理的污水为样本，两者富集培养，4℃，10,000rpm离心10min，收集上清液，用0.45μm无菌滤膜抽滤，再用0.22μm无菌滤膜过滤，收集滤液。将过滤液7倍稀释，从每个稀释梯度中分别取100μL与300μL宿主菌液混合，放置37℃恒温箱中静止吸附10min，然后加入冷却至40℃、琼脂浓度为0.75％的BHI半固体培养基5mL，混匀后快速的倾倒于普通BHI固体培养基上，形成双层平板。超净工作台下静置15min，使其充分凝固，倒置于37℃恒温箱静置培养。12h后，观察到BHI双层平板上长出边缘清晰的噬菌斑，见图1。
3、噬菌体的纯化：以分离的培养至对数生长早期OD600为0.3的粪肠球菌YN771为宿主菌，用无菌棒挑取噬菌体单个噬菌斑，接种到处于宿主菌液中，37℃，150rpm。取混合物10,000rpm离心10min，收集上清液，先用0.45μm微孔滤膜抽滤，再用0.22μm无菌微孔滤膜过滤。采用双层琼脂平板法分离噬菌体，将过滤液十倍稀释，从每个稀释梯度中分别取100μL与300μL宿主菌液混合，放置37℃恒温箱中静止吸附10min，然后加入冷却至40℃、琼脂浓度为0.75％的BHI半固体培养基5mL，混匀后快速的倾倒于新鲜BHI固体培养基上，形成双层平板。实验重复三次以上纯化，当看到双层平板上形成形态大小均一的噬菌斑时，将最后一次得到的单个噬菌斑取出，接种到宿主菌液中，37℃，150rpm过夜振荡培养。取混合物10,000rpm离心10min，收集上清液，先用0.45μm微孔滤膜抽滤，再用0.22μm无菌微孔滤膜过滤，得到的即为噬菌体原液，4℃保存备用。
4、噬菌体的富集
以分离的培养至对数生长期OD600为0.3的粪肠球菌E.faecalisYN771为宿主菌，加入效价为108pfu/mL的噬菌体原液15mL，放置37℃恒温箱中静止吸附10min，37℃，150rpm，培养24h，将混合液10,000rpm离心10min，收集上清液，除菌。十倍稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7备用。
在超净工作台中取出4mL高温灭菌后的EP管，加入各个稀释梯度的噬菌体100μL，每管中分别加入300μL的对数生长期OD600为0.3的E.faecalis YN771，做好编号标记，在37℃恒温箱中静止吸附10min，得到的即为噬菌体富集液。
实验例2噬菌体的形态观察
取噬菌体纯培养液25μL加入50μL浓度为0.5％的戊二醛，取混合液滴在一枚有碳膜的铜网中间，静止30min，用吸水纸吸取多余液体，小心不要弄破铜网，取2％磷钨酸滴在铜网上，室温下对混合液进行染色2min，后用吸水纸吸取多余染液，室温下待铜网晾干，然后进行透射电镜观察。
噬菌体分类的一个重要依据是形态，由于噬菌体结构简单，个体微小，需要噬菌体纯培养颗粒经过负染后在电子显微镜下才能观察到它们的形态结构，实验分离得到的噬菌体PEf771依据国际病毒分类标准，该噬菌体属于典型的有尾噬菌体，肌尾噬菌体科(Myoviridae)。其头部为二十面体，头部与尾部被一个颈圈隔开，测定头部直径约为98.4nm，收缩性尾长约228.5nm，尾管直径约为17.3nm，见图2。
实验例3噬菌体PEf771生物学特性研究
1、噬菌体PEf771感染温度范围及最适生长温度
取效价1010pfu/mL的噬菌体PEf771纯培养液100μL和300μL对数生长期的粪肠球菌YN771悬液混匀，37℃静置吸附10min，取出加入4mL大约40℃、琼脂浓度为0.75％的BHI半固体培养基，混匀后均匀快速的倾倒于BHI固体培养基上，分别倒置于4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、37℃、42℃和55℃不同温度的恒温培养箱中1～3d，观察噬菌斑形成情况，实验重复三次。
噬菌体PEf771感染温度范围见表1，可以看出，噬菌体PEf771在20℃～42℃均能形成透明的、边缘清晰的噬菌斑，但在37℃时活性最强。
表1噬菌体侵染温度范围
注：－：不可生长或不可侵染；+：可生长或能侵染；*表示生长不好。
2、噬菌体PEf771的一步生长曲线
取5mL对数生长期的粪肠球菌YN771(OD600＝0.6～0.8)菌悬液10倍比浓度稀释后涂平板，以确定此状态下的细菌浓度；当细菌浓度为108pfu/mL时，以最佳感染复数为0.1加入噬菌体PEf771(效价1010pfu/mL)，静置吸附后，37℃150rpm摇床培养25min，11,000rpm离心10min，弃上清，沉淀用5mL新鲜BHI液体培养基重悬，洗涤2～3次，尽量洗净未吸附的的噬菌体PEf771颗粒，再用5mL BHI液体培养基液将沉淀重悬，37℃，150rpm恒温摇床培养，每隔5min取样一次，样品离心取100μL上清做梯度稀释，稀释液和宿主菌以1:3比例混合均匀铺双层平板，测定不同时间噬菌体PEf771的效价。
噬菌体PEf771一步生长曲线见图3，噬菌体PEf771在前10min为潜伏期，噬菌斑数目几乎没有增加，说明尚未进行复制及组装，10～40min为爆发期，噬菌斑数目急剧增加，45min后噬菌体PEf771生长进入平稳期，爆发量为78。说明其裂解周期短，爆发量大。具有较强的裂解能力，最佳感染复数为0.1。
3、噬菌体PEf771的温度耐受性
将效价1010pfu/mL的噬菌体PEf771纯培养液分别静置于不同温度(40℃、50℃、60℃和70℃)的恒温培养箱中，每10min取样100μL，梯度稀释后与300μL宿主菌混合，37℃恒温箱中静止吸附10min后双层平板法测定不同温度下放置不同时间后噬菌体PEf771的效价，实验平行重复三次。
噬菌体PEf771的温度耐受性见表2，图4，可以看出，噬菌体PEf771经25℃处理1h，还有约90％的噬菌体存活；经40℃处理1h，还有83％的噬菌体存活；50℃处理1h后有约68％的噬菌体存活；60℃处理50min噬菌体无活性；70℃处理30min噬菌体完全失活。表明噬菌体PEf771热稳定性不佳，不能耐受60℃以上长时间高温。
表2噬菌体PEf771的温度耐受性
4、噬菌体PEf771的pH耐受性
配制缓冲液：pH 3.0～5.0柠檬酸缓冲液；pH 6.0～8.0磷酸盐缓冲液；pH9.0Tris-HCl缓冲液；pH 10.0～11.0碳酸钠缓冲液。
将效价1010pfu/mL的噬菌体PEf771纯培养液分别与100mM pH 3.0～11.0的缓冲液(pH 3.0～5.0柠檬酸缓冲液；pH 6.0～8.0磷酸盐缓冲液；pH 9.0Tris-HCL缓冲液；pH 10.0～11.0碳酸钠缓冲液)按1/10(v/v)混合，室温处理1h，取样测定不同pH条件下噬菌体PEf771的效价。
噬菌体PEf771的pH耐受性见表3和图5，可以看出噬菌体PEf771在pH3.0～11.0之间均有活性，且在pH 4.0～8.0时有70％左右的存活率，最适pH值为6.0，这表明该噬菌体PEF771具有较广的pH适应范围，且微嗜酸环境。
表3噬菌体PEf771的pH值耐受性
5、噬菌体PEf771的裂解谱
测定不同受试菌对噬菌体PEf771的敏感性，步骤如下：
(1)将受试菌按1％接菌量分别接种于5mL新鲜BHI液体培养基中，做好标记，置于37℃、150rpm振荡培养直至受试菌株达到对数生长早期OD600为0.3，取出备用。
(2)通过实验例1的噬菌体富集方法，得到噬菌体PEf771的裂解液。将裂解液在10,000g离心10min，取上清，用0.45μm无菌滤膜抽滤，再用0.22μm无菌滤膜过滤，所得滤液即是本实验需要的噬菌体PEf771的新鲜原液。
(3)将31株受试菌与噬菌体PEf771分别做噬斑实验，24h观察平板上有无噬菌斑长出。如果有斑长出，认为噬菌体PEf771对该受试菌具有裂解能力；如果没有斑长出，则认为噬菌体PEf771对它没有裂解性。
噬菌体有严格的宿主特异性，但是仍有一部分噬菌体对同一种属内的不同菌株具有感染或裂解性。利用15株粪肠球菌(E.faecalis)、8株屎肠球菌(E.faecium)、1株铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、1株大肠杆菌(E.coli)、1株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、1株金黄色葡萄球菌(S.aureus)，2株嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和2株变异链球菌(S.mutans)共31株受试菌对噬菌体PEf771的敏感性。结果显示包括指示菌株在内的受试菌株中共有4株粪肠球菌(E.faecalis YN771，E.faecalis 10，E.faecalis 13，E.faecalis CGMCC1.2135)和2株屎肠球菌(E.faecium 03，E.faecium 04)被侵染，见表4。这5株在双层平板上出现清晰的噬菌斑，其他受试菌株对噬菌体PEf771不敏感，表明噬菌体PEf771较强的宿主专一性。
表4噬菌体PEf771宿主谱一览表
S表示敏感，可以被侵染；R表示不敏感，不能被侵染
实验例4噬菌体PEf771与抗生素抑菌效果研究
菌种：粪肠球菌YN771，实验前期已分离。
粪肠球菌噬菌体PEf771，实验前期已分离，效价为1.3×1010pfu/mL。
1、实验分组
(1)对照组：粪肠球菌YN771加入试管中后不更换BHI培养基计0d，1d，3d活菌数。
(2)氨苄西林组：按药物配置浓度取100μL加入含有粪肠球菌YN771试管中计0d，1d，3d活菌数。称取200mg氨苄西林溶解到1mL无菌蒸馏水中，配置为浓度20mg/mL，然后取100μL稀释到10mL无菌蒸馏水中，得到最终浓度为2mg/mL。
(3)万古霉素组：按药物配置浓度取100μL加入含有粪肠球菌YN771试管中计0d，1d，3d活菌数。称取500mg万古霉素溶解到10mL无菌蒸馏水中，配置为浓度50mg/mL，然后取100μL稀释到10mL无菌蒸馏水中，得到最终浓度为0.5mg/mL。
(4)莫西沙星组：按药物配置浓度取100μL加入含有粪肠球菌YN771试管中计0d，1d，3d活菌数。称取250mg莫西沙星溶解到10mL无菌蒸馏水中，配置为浓度25mg/mL，然后取100μL稀释到10mL无菌蒸馏水中，得到最终浓度为0.25mg/mL。
(5)环丙沙星组：按药物配置浓度取100μL加入含有粪肠球菌YN771试管中计0d，1d，3d活菌数。称取称取500mg环丙沙星溶解到10mL无菌蒸馏水中，配置为浓度50mg/mL，然后取100μL稀释到10mL无菌蒸馏水中，得到最终浓度为0.5mg/mL。
(6)青霉素组：按药物配置浓度取100μL加入含有粪肠球菌YN771试管中计0d，1d，3d活菌数。称取250mg青霉素G溶解到10mL无菌蒸馏水中，配置为浓度25mg/mL，然后取100μL稀释到10mL无菌蒸馏水中，得到最终浓度为0.25mg/mL。
(7)四环素组：按药物配置浓度取100μL加入含有粪肠球菌YN771试管中计0d，1d，3d活菌数。称取10mg四环素溶解到10mL无菌蒸馏水中，配置为浓度1mg/mL。
(8)左氧氟沙星组：按药物配置浓度取100μL加入含有粪肠球菌YN771试管中计0d，1d，3d活菌数。称取500mg左氧氟沙星溶解到10mL无菌蒸馏水中，配置为浓度50mg/mL，然后取100μL稀释到10mL无菌蒸馏水中，得到最终浓度为0.5mg/mL。
(9)替加环素组：按药物配置浓度取100μL加入含有粪肠球菌YN771试管中计0d，1d，3d活菌数。称取120mg替加环素溶解到10mL无菌蒸馏水中，配置为浓度12mg/mL，然后取100μL稀释到10mL无菌蒸馏水中，得到最终浓度为0.12mg/mL。
(10)红霉素组：按药物配置浓度取100μL加入含有粪肠球菌YN771试管中计0d，1d，3d活菌数。称取250mg红霉素溶解到10mL无菌蒸馏水中，配置为浓度25mg/mL，然后取100μL稀释到10mL无菌蒸馏水中，得到最终浓度为0.25mg/mL。
(11)利奈唑胺组：按药物配置浓度取100μL加入含有粪肠球菌YN771试管中计0d，1d，3d活菌数。称取20mg利奈唑胺溶解到10mL无菌蒸馏水中，配置为浓度1mg/mL。
(12)噬菌体PEf771组：按感染复数MOI＝0.1加入含有粪肠球菌YN771试管中计0d，1d，3d活菌数。
2、挑取YN771菌落于5mL BHI新鲜培养基中，37℃，150rpm，过夜培养后，按1％接菌量转接至新鲜培养基中，37℃，150rpm培养3.5h后，分装于1试管中，每管5mL。
3、抗生素组均配成母液，每管添加5μL到菌液中，噬菌体PEf771组每管添加500μL(MOI＝0.1)。
4、所有组均于37℃，150rpm继续培养，分别于0d、1d、3d三个时间点进行活菌计数，具体方法为：取100μL该菌液，进行10倍梯度稀释，稀释至10-6，每个梯度取100μL混合倒平板，37℃倒置培养，过夜进行活菌数计数，每个梯度倒三个平板。
5、计算各个时间点各组的活菌数进行比较分析。
从表5中可以看出，1d时噬菌体组的YN771活菌数迅速降到0.4×108cfu/mL，明显少于其他10种抗生素组(P＜0.05)；3d时噬菌体组的活菌数与1d时无明显改变，与3d时替加环素组、四环素组、氨苄西林组、利奈唑胺组活菌数无明显差异(P>0.05)，而明显少于环丙沙星组、万古霉素组、左氧氟沙星组、青霉素组、莫西沙星组、红霉素组YN771活菌数(P＜0.05)，见表5。说明噬菌体PEf771能够短时间内达到抑菌效果。
表5噬菌体PEf771与抗生素抑菌比较
*，与对照组比较，P＜0.05；#，与噬菌体组比较，P＜0.05
*，contrast withblank group,P＜0.05，#，contrast withbacteriophagegroup,P＜0.05
实验例5噬菌体PEf771抗滇南小耳猪根尖周炎研究
1、滇南小耳猪牙分组
取同一头猪的不同部位的牙作为各实验组牙。
(1)空白组(消毒组)(n＝2)：开髓+消毒。
(2)对照组(n＝4):
对照组-1(消毒后感染组)(n＝2)：开髓+消毒+接种病原菌YN771。
对照组-2(根管治疗后感染组)(n＝2)：开髓+根管治疗+接种病原菌YN771。
(3)实验组(消毒后感染+噬菌体)(n＝2):开髓+消毒+接种病原菌YN771+噬菌体PEf771。
2、手术前准备
(1)滇南小耳猪准备：
滇南小耳猪购买后，先喂养1月，同时观察猪的精神状态及生理状态，如饮食、大小便、毛发、皮肤巩膜等。手术器械常规高温消毒。
(2)病原菌YN771菌悬液和病原菌YN771菌悬液+噬菌体混合液的准备：
1)取保存在4℃的YN771菌悬液按1％的接种量接种至5ml的新鲜BHI液体培养基中，3管，150rpm，37℃，过夜培养。
2)次日在1200mL BHI培养基中加入1％的接种量，150rpm，37℃，培养2h左右，测OD600＝0.3时，停止培养，分成两份，每份600mL，取出600mL YN771菌悬液，按最佳感染复数(噬菌体：菌＝1)加入2.4mL效价为1.3×1010pfu/mL噬菌体PEf771，混匀。
3)将600mL液1(菌悬液)和600mL液2(菌悬液+噬菌体混合液)37℃恒温箱内静置培养10min后取出，将两瓶液体10,000g离心15min后弃上清，用新鲜BHI液体洗涤2遍后用新鲜BHI液体重悬使得终体积为每瓶3mL。重悬浓缩后YN771浓菌为9.6×1011cfu/mL。
4)对照组每颗牙根内注射0.1mL液1(菌悬液)，实验组每颗牙根内注射0.1mL液2(菌悬液+噬菌体混合液)。
3、滇南小耳猪E.faecalis YN771感染根尖周炎模型的建立
体内建立模型
第一步：建立空白组模型(开髓+消毒)
滇南小耳猪，体重20～30Kg，4～5月龄，无龋齿及牙周病。1％丙泊酚静脉麻醉耳静脉，手术过程中可根据麻醉效果及时间适量加量。麻醉满意后，取卧位，根据所开髓的牙齿取不同的体位，上颌牙取仰卧位，下颌牙取俯卧位。四肢固定于手术台上，助手协助抬起上颌，呈最大张口状，用球钻行开髓术，拔髓针拔除牙髓，次氯酸钠、双氧水交替冲洗根管，根管内放置Ca(OH)2糊剂消毒根管，氧化锌封闭洞口，整个过程保持无菌操作。动物清醒后正常喂养2周，建立空白组模型。
第二步：建立对照组模型
(1)建立对照组-1(消毒后感染组)模型：开髓+消毒+接种E.faecalis YN771。
方法：在空白组基础上，选择2颗牙齿，空白组模型建立2周后，再次麻醉固定小耳猪，碘伏消毒开髓牙，去除开髓口的氧化锌暂封物，行根管预备。先取出根管内的消毒糊剂，根管锉去除残余牙髓，次氯酸钠、双氧水交替冲洗，最后用生理盐水冲洗根管，并用无菌纸尖干燥根管，注射器注入0.1mL病原菌YN771菌悬液，窝洞用光固化松风玻璃离子充填。
(2)建立对照组-2(根管治疗后感染组)模型：开髓+根管治疗+接种E.faecalisYN771。
方法：在空白组基础上，选择2颗牙齿，空白组模型建立2周后，再次麻醉固定小耳猪，碘伏消毒开髓牙，去除开髓口的氧化锌暂封物，行根管预备。先取出根管内的消毒糊剂，根管锉去除残余牙髓，次氯酸钠、双氧水交替冲洗，最后用生理盐水冲洗根管，并用无菌纸尖干燥根管，根管预备后用牙胶尖严密填充根管，注射器注入0.1mL病原菌YN771菌悬液，窝洞用光固化松风玻璃离子充填。
第三步：建立实验组模型消毒后再感染+噬菌体)：开髓+消毒+接种E.faecalisYN771+噬菌体
方法：在空白组基础上，选择2颗牙齿，空白组模型建立2周后，再次麻醉固定小耳猪，碘伏消毒开髓牙，去除开髓口的氧化锌暂封物，取出根管内的消毒糊剂，根管锉去除残余牙髓，次氯酸钠、双氧水交替冲洗，最后用生理盐水冲洗根管，并用无菌纸尖干燥根管，注射器注入0.1mL液2(菌悬液+噬菌体混合液)，窝洞用光固化松风玻璃离子充填。
术后SD大鼠正常饮食、饮水。密切观察大鼠饮食、饮水量、精神状态、毛发色泽。
4、标本的收集
术后4周处死滇南小耳猪。切取含牙颌骨组织，剔除软组织，见图6。
5、病理切片的制备
(1)固定将取下的含牙颌骨组织浸泡于4％多聚甲醛中固定。
(2)脱钙采用脱钙液进行脱钙
(3)组织块修整
(4)水洗水洗的目的是洗去渗入组织中的固定液，终止固定。以免影响对组织内结构的观察、分析和研究。
(5)脱水采用多个浓度的酒精进行脱水。
乙醇脱水过程如下：
(6)透明采用二甲苯透明。
第一次透明约15min
第二次时间根据第一次透明效果而定
(7)浸蜡浸蜡的目的是置换组织中的透明剂，为包埋做准备。
在60℃恒温蜡箱中放置3个蜡杯，取透明好的组织块放入蜡中各1h。
(8)包埋
在金属框中倒入蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，置好方向。
待蜡块完全凝固以后，便可拆卸包埋框架取出蜡块。
(9)石蜡切片制备
将切片刀装在切片机的刀架上并固定紧，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，然后切片。
(10)烤片
切片在室温下稍微干燥后，放在60℃恒温烤箱中，烤干备用。
6、HE染色
含牙颌骨组织HE染色
(1)切片常规脱蜡至水，65℃烤片2h。
(2)二甲苯脱蜡处理2次，每次10min。
(3)分别在95％、80％、70％乙醇脱水5min。
(4)蒸馏水洗3min。
(5)苏木素染色6min。
(6)蒸馏水洗3min。
(7)促染液2min。
(8)蒸馏水洗3min。
(9)伊红染色20s。
(10)95％酒精洗3次，每次3min。
(11)100％酒精洗3次，每次3min。
(12)二甲苯洗2次，每次1min。
(13)中性树胶封片。
7、影像学检测
滇南小耳猪送昆明医科大学附属延安医院放射科CT室扫描头部结构，观察牙根尖周结构。
8、各组HE染色结果
空白组(开髓+消毒组)与实验组(开髓+消毒+接种病原菌YN771+噬菌体PEf771组)显示牙及牙周组织基本正常，未见有明显的炎症细胞浸润，牙骨质未见破坏，牙骨质细胞排列整齐，牙骨质与牙周膜紧密结合。对照组-1(开髓+消毒+接种病原菌YN771组)见牙周膜与牙骨质之间的裂隙明显增宽，牙骨质吸收破坏，吸收区域牙骨质细胞增多，牙骨质局部增厚。对照组-2(开髓+根管治疗+接种病原菌YN771组)仅见到牙周膜与牙骨质之间的裂隙明显增宽，牙骨质完整，牙骨质细胞排列整齐，未见明显炎性细胞浸润，见图7。
9、各组CT结果
在对照组-1(消毒后感染组)和对照组-2(根管治疗后感染组)中，CT根尖处可见暗影，有根尖周炎形成；空白组(消毒组)、实验组(消毒后感染+噬菌体)CT未发现根尖暗影，无根尖周炎形成，见图8。

Claims (9)

1.一种粪肠球菌噬菌体，其特征在于：该噬菌体被命名为PEf771，于2019年4月19日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为:CCTCC NO:M 2019276，分类名称Enterococcusfaecalis bacteriophage，该噬菌体对粪肠球菌有强的裂解作用。
2.一种如权利要求1所述的一种粪肠球菌噬菌体，其分离、纯化以及富集的方法，其特征包括以下步骤：(1)宿主菌的准备：以粪肠球菌E.faecalisYN771作为分离噬菌体的宿主菌，该菌株于2019年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC NO:M 2019275，将粪肠球菌YN771，在BHI固体培养基上划线，32～40℃恒温孵育20～30h，然后挑取单菌落接种于5mL BHI液体培养基中，培养至对数生长早期OD为0.3，供分离粪肠球菌噬菌体用；
(2)噬菌体的分离：以分离的培养至对数生长早期OD为0.3的粪肠球菌YN771为宿主菌，从昆明医科大学附属延安医院口腔科污水口取回的未经氯水处理的污水为样本，两者富集培养，2～8℃，8000～11,000rpm离心9～12min，收集上清液，用0.40～0.48μm无菌滤膜抽滤，再用0.20～0.24μm无菌滤膜过滤，收集滤液，将过滤液7倍稀释，从每个稀释梯度中分别取80～130μL与280～320μL宿主菌液混合，放置32～40℃恒温箱中静止吸附12～15min，然后加入冷却至40℃、琼脂浓度为0.75％的BHI半固体培养基4～8mL，混匀后快速的倾倒于普通BHI固体培养基上，形成双层平板，超净工作台下静置12～18min，使其充分凝固，倒置于37℃恒温箱静置培养，10～13h后，观察到BHI双层平板上长出边缘清晰的噬菌斑；
(3)噬菌体的纯化：以分离的培养至对数生长早期OD为0.3的粪肠球菌YN771为宿主菌，用无菌棒挑取噬菌体单个噬菌斑，接种到宿主菌液，32～40℃，120～170rpm，培养10～24h，取混合物8000～11,000rpm离心9～12min，收集上清液，先用0.40～0.48μm微孔滤膜抽滤，再用0.20～0.24μm无菌微孔滤膜过滤，采用双层琼脂平板法分离噬菌体，将过滤液7倍稀释，从每个稀释梯度中分别取80～130μL与280～320μL宿主菌液混合，放置32～40℃恒温箱中静止吸附12～15min，然后加入冷却至40℃、琼脂浓度为0.75％的BHI半固体培养基4～8mL，混匀后快速的倾倒于新鲜BHI固体培养基上，形成双层平板，实验重复三次以上纯化，当看到双层平板上形成形态大小均一的噬菌斑时，将最后一次得到的单个噬菌斑取出，接种到宿主菌液中，于32～40℃，120～170rpm过夜振荡培养，取混合物8000～11,000rpm离心9～12min，收集上清液，先用0.40～0.48μm微孔滤膜抽滤，再用0.20～0.24μm无菌微孔滤膜过滤，得到的即为噬菌体原液，4℃保存备用；
(4)噬菌体的富集：以分离的培养至对数生长早期OD为0.3的粪肠球菌YN771为宿主菌，加入效价为108pfu/mL的噬菌体原液12～18mL，放置32～40℃恒温箱中静止吸附9～12min，32～40℃120～170rpm，培养10～24h，将混合液8000～11,000rpm离心9～12min，收集上清液，除菌。十倍稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7备用，在超净工作台中取出4mL高温灭菌后的EP管，加入各个稀释梯度的噬菌体80～130μL，每管中分别加入280～320μL的对数生长早期OD为0.3的粪肠球菌YN771，做好编号标记，在37℃恒温箱中静止吸附9～12min，得到的即为噬菌体富集液。
3.一种粪肠球菌噬菌体用于抑制粪肠球菌。
4.一种粪肠球菌噬菌体用于制备一种控制粪肠球菌感染的抗生素替代品。
5.一种粪肠球菌噬菌体作为安全的生物消毒剂用于维护口腔微生态。
6.一种粪肠球菌噬菌体作为一种药物治疗由粪肠球菌感染引起的疾病。
7.一种如权利要求3所述的一种粪肠球菌噬菌体用于抑制粪肠球菌，其特征在于，将该噬菌体用于抑制粪肠球菌YN771。
8.一种如权利要求4所述的一种粪肠球菌噬菌体用于制备一种控制粪肠球菌感染的抗生素替代品，其特征在于，将该噬菌体用于制备一种控制粪肠球菌YN771感染的抗生素替代品。
9.一种如权利要求6所述的一种粪肠球菌噬菌体作为一种药物治疗由粪肠球菌感染引起的疾病，其特征在于，将该噬菌体作为一种药物治疗由粪肠球菌YN771感染引起的难治性根尖周炎。
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