KR101875565B1 - 신규한 에로모나스 살모니시다 박테리오파지 Ａｅｒ-ＳＡＰ-2 및 이의 에로모나스 살모니시다 균 증식 억제 용도 - Google Patents
신규한 에로모나스 살모니시다 박테리오파지 Ａｅｒ-ＳＡＰ-2 및 이의 에로모나스 살모니시다 균 증식 억제 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 에로모나스 살모니시다 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대 박테리오파지 Aer-SAP-2(수탁번호 KCTC 12909BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 에로모나스 살모니시다 균에 감염하여 에로모나스 살모니시다 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리한 박테리오파지 및 이를 유효성분으로 포함한 조성물을 이용한 에로모나스 살모니시다 균에 의해서 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 에로모나스 살모니시다 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대 박테리오파지 Aer-SAP-2(수탁번호 KCTC 12909BP), 및 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
에로모나스 과(Aeromonadaceae)에 속하는 에로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)는 통성혐기성 그람 음성균이며, 비운동성인 단간균으로서 주로 연어 및 무지개 송어 등의 연어과(Salmonid) 어류나 잉어과 어류 등에 심각한 질병을 야기하는 원인균으로 잘 알려져 있다. 에로모나스 살모니시다 균은 동질(Homogeneous)한 혈청형을 갖고 있으며, 열 안정성 균체항원(Thermo-stable, O antigen)을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 열 안정성 균체항원을 갖고 있는 에로모나스 살모니시다 균은 패혈증 등과 관련된 병원성을 보이며, 특히 항원그룹 O3을 갖고 있는 경우에는 전신 감염(Systemic infection)을 유발하는 것으로 알려져 있다.
에로모나스 살모니시다 균은 어류에서 광범위하게 세균성 패혈증(Septicemia)이나 절창병(Furunculosis)을 유발하기도 하며, 정도가 심각한 경우에는 집단 폐사를 야기 시킬 수 있어서 어류의 양식 산업에서 중요한 경제적 손실의 원인이 되고 있다. 따라서 에로모나스 살모니시다 균 감염을 예방하고 나아가 감염 처치에까지 활용될 수 있는 방안의 개발이 절실한 실정이다.
에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환의 예방이나 치료 목적으로 다양한 항생제들이 사용되어 왔으나 최근 이들 항생제들에 대한 내성균의 발생이 증가함에 따라 항생제 외의 다른 방안의 확보가 시급한 실정이다.
최근 세균성 감염질환의 대처 방안으로 박테리오파지(Bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 항생제 내성균에 대한 우수한 항균력 때문에 더욱 큰 관심을 받고 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(Phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 세균에 감염(Infection)한 후에 세균의 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 세균 밖으로 나올 때 숙주인 세균의 세포벽을 파괴하는 방식으로 세균을 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 세균 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 세균에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 세균에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 항균효과를 제공할 수 있다. 이러한 박테리오파지의 세균 특이성으로 인하여 박테리오파지는 대상으로 하는 세균에 대해서만 항균효과를 제공하고 환경이나 동물 내의 상재균들에는 영향을 초래하지 않는다. 통상적으로 세균 처치에 널리 활용되던 기존의 항생제들은 여러 종류의 세균들에 대하여 동시에 영향을 끼쳤다. 이로 인하여 환경오염이나 동물의 정상 세균총 교란 등의 문제를 초래하였다. 이와는 달리 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 작동하므로 박테리오파지 사용에 의해서 체내 정상균총 교란 등이 발생하지 않는다. 따라서 박테리오파지 사용이 항생제 사용에 비교하여 매우 안전하다고 할 수 있고, 그 만큼 사용에 의한 부작용 초래 가능성이 상대적으로 크게 낮다.
박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구를 수행하면서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella dysenteriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원성 세균에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다.
세균을 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후부터 세균 감염에 대응하는 효과적 방안으로 기대를 모았으며 관련하여 많은 연구들이 있었다. 그러나 Fleming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 발생 증가로 인하여 기존 항생제의 한계성이 나타나고, 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-세균제로 주목을 받고 있다.
앞에서 설명했듯이 박테리오파지는 세균에 대한 특이성이 매우 높다. 이러한 박테리오파지의 세균에 대한 높은 특이성으로 인하여 박테리오파지는 동일 종(Species)에 속하는 세균들이라 할지라도 그 일부 주(Strain)에 대해서만 항균효과를 발휘하는 경우가 많다. 또한 대상 세균 주에 따라 발휘되는 박테리오파지의 항균력 세기 자체도 다를 수 있다. 이러한 이유로 특정 종류의 세균에 대하여 효과적 제어법을 확보하려면 다양한 종류의 유용 박테리오파지들의 확보가 필요하다. 에로모나스 살모니시다 균에 대응하여 효과적인 박테리오파지 활용법을 개발하기 위해서도 당연히 에로모나스 살모니시다 균에 대하여 항균효과를 제공할 수 있는 여러 종류의 다양한 박테리오파지들의 확보가 필요하고, 더 나아가 확보한 다양한 유용 박테리오파지들 중에서 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 비교우위에 있는 박테리오파지의 선발 활용도 필요하다.
이에, 본 발명자들은 에로모나스 살모니시다 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 이용하여 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 데에 활용될 수 있는 조성물을 개발하고, 또 이 조성물을 이용하여 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 개발하고자 노력한 끝에, 이에 적합한 박테리오파지를 자연으로부터 분리하고, 이 분리된 박테리오파지를 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있도록 유전체(Genome)의 서열 정보를 확보한 후에 상기 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 개발한 다음에 이 조성물이 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 에로모나스 살모니시다 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대(Myoviridae) 박테리오파지 Aer-SAP-2(수탁번호 KCTC 12909BP)를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 에로모나스 살모니시다 균에 감염하여 에로모나스 살모니시다 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Aer-SAP-2(수탁번호 KCTC 12909BP)를 유효성분으로 포함하는 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 활용 가능한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 에로모나스 살모니시다 균에 감염하여 에로모나스 살모니시다 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Aer-SAP-2(수탁번호 KCTC 12909BP)를 유효성분으로 포함하는 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 활용 가능한 조성물을 이용한 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 사용되는 약욕제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료를 통한 사양 효과 제공 목적의 사료첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명은 에로모나스 살모니시다 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대 박테리오파지 Aer-SAP-2(수탁번호 KCTC 12909BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
박테리오파지 Aer-SAP-2는 본 발명자들에 의해 분리된 후에 2015년 9월 22일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 12909BP).
또한, 본 발명은 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 데에 활용될 수 있는 박테리오파지 Aer-SAP-2를 유효성분으로 포함하는 약욕제 및 사료첨가제를 제공한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지 Aer-SAP-2는 에로모나스 살모니시다 균을 효과적으로 사멸시키므로 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환의 예방(감염 방지)이나 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 또는 치료 목적으로 활용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 “방지” 또는 “예방”이라는 용어는 (i) 에로모나스 살모니시다 균의 감염 방지; 및 (ii) 에로모나스 살모니시다 균 감염에 의한 질병으로의 발전을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 (i) 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ii) 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발된 질환의 병적상태를 경감시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서의 “분리”, “분리한” 또는 “분리된”은 자연 상태로부터 여러 실험 기법을 활용하여 박테리오파지를 분리하는 것과 타 박테리오파지와 구별하여 본 발명의 박테리오파지를 특정 지을 수 있는 특징을 확보하는 일을 지칭하며, 이에 더하여 생물공학기술로 본 발명의 박테리오파지를 산업적으로 활용할 수 있게끔 증식시키는 것도 포함한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 박테리오파지 Aer-SAP-2가 유효성분으로 포함된다. 이때 포함되는 박테리오파지 Aer-SAP-2는 1× 101 pfu/㎖ 내지 1× 1030 pfu/㎖ 또는 1× 101 pfu/g 내지 1× 1030 pfu/g로 포함되며, 바람직하게는 1× 104 pfu/㎖ 내지 1× 1015 pfu/㎖ 또는 1× 104 pfu/g 내지 1× 1015 pfu/g로 포함된다.
본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만 약욕제 및 사료첨가제로 구현될 수 있다. 이러한 활용 목적에서의 효율성을 높이기 위하여 다른 세균종에 대하여 항균활성을 제공할 수 있는 박테리오파지들이 본 발명의 조성물에 추가될 수 있다. 또한, 에로모나스 살모니시다 균에 대하여 항균활성을 갖는 다른 종류의 박테리오파지들도 추가될 수 있다. 에로모나스 살모니시다 균에 대하여 항균활성을 갖는 박테리오파지라 하더라도 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 서로 간에 차이가 있으므로 이들의 적절한 조합은 그 효과를 극대화 할 수 있다.
본 발명의 박테리오파지 Aer-SAP-2를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법은 기존의 항생제 등에 기반을 둔 방식에 비하여 에로모나스 살모니시다 균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 사용할 수 있음을 의미하며, 이의 사용에 따른 부작용이 매우 적다는 것을 의미한다. 통상적으로 항생제 등을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 동물의 면역력 저하 등을 초래시켜 사용에 따른 다양한 부작용이 나타난다. 한편, 박테리오파지는 항균활성을 발휘할 수 있는 세균종이 같다 하더라도 항균효과 발휘에 있어 항균력의 세기나 항균범위[에로모나스 살모니시다 균종에 속하는 여러 세균 주(Strain)의 측면에서 개별 세균 주에 대하여 박테리오파지의 항균활성이 발휘되는 범위. 통상적으로 박테리오파지는 같은 세균 종(Species)에 속하는 일부 세균 주(Strain)에 대하여 항균활성을 발휘할 수 있음. 즉, 같은 세균 종에 속한다 하더라도 개별 세균 주에 따라 박테리오파지에 대한 감수성에서 차이가 있을 수 있음] 측면에서 차이가 있으므로 본 발명은 에로모나스 살모니시다 균에 대한 항균력을 갖는 타 박테리오파지에 비교하여 차별적 항균효과를 제공할 수 있다. 이는 산업현장 활용 시에 그 효과에 있어 큰 차이를 제공한다.
도 1은 박테리오파지 Aer-SAP-2의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 Aer-SAP-2의 에로모나스 살모니시다 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다. 평판배지의 가운데 선을 기준으로 왼쪽은 박테리오파지 Aer-SAP-2가 포함되지 않은 완충액(Buffer)만을 점적한 것이고, 오른쪽은 박테리오파지 Aer-SAP-2가 포함된 액을 점적한 것이다. 오른쪽에서 관찰되는 투명한 부분은 시험대상 세균이 박테리오파지 Aer-SAP-2의 작용에 의하여 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.
도 2는 박테리오파지 Aer-SAP-2의 에로모나스 살모니시다 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다. 평판배지의 가운데 선을 기준으로 왼쪽은 박테리오파지 Aer-SAP-2가 포함되지 않은 완충액(Buffer)만을 점적한 것이고, 오른쪽은 박테리오파지 Aer-SAP-2가 포함된 액을 점적한 것이다. 오른쪽에서 관찰되는 투명한 부분은 시험대상 세균이 박테리오파지 Aer-SAP-2의 작용에 의하여 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1:
에로모나스
살모니시다
균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리
에로모나스 살모니시다 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리에는 자연 환경으로부터 확보된 시료들을 이용하였다. 한편, 박테리오파지 분리에 사용된 에로모나스 살모니시다 균은 환경미생물은행으로부터 분양받아 사용하였다(분양번호 KEMB4-337).
박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 에로모나스 살모니시다 균을 1/1,000 비율로 접종한 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/L; 소이빈 다이제스트, 3 g/L; 덱스트로스, 2.5 g/L; NaCl, 5 g/L; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/L)에 수집된 시료를 함께 첨가한 다음 25℃에서 3-4시간동안 진탕배양 하였다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 에로모나스 살모니시다 균을 1/1,000 비율로 접종한 다음 25℃에서 3-4시간 동안 또 다시 진탕배양 하였다. 박테리오파지가 시료에 포함되어 있었을 경우에는 박테리오파지의 수(Titer)가 충분히 증가될 수 있도록 이러한 과정을 총 5회 반복 실시하였다. 5회 반복 실시 후에 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 회수된 상등액에 대하여 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과를 실시해 주었다. 이렇게 하여 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(Spot assay)을 통하여 에로모나스 살모니시다 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사하였다.
상기 점적 실험은 다음과 같이 실시되었다. TSB 배지에 에로모나스 살모니시다 균을 1/1,000 비율로 접종한 다음 25℃에서 한밤동안 진탕배양 하였다. 이렇게 하여 준비된 에로모나스 살모니시다 균의 배양액 3 ㎖(OD600이 1.5)을 TSA(Tryptic Soy Agar) 평판배지(카제인 다이제스트, 15 g/L; 소이빈 다이제스트, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(Spreading)하였다. 도말한 평판 배지를 클린벤치(Clean bench)에서 약 30분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 하였다. 건조 후 앞에서 준비한 여과액 10 μl를 에로모나스 살모니시다 균이 도말된 평판 배지 위에 점적하였다. 이를 30분 정도 방치하여 건조시켰다. 건조 후 점적한 평판 배지를 25℃에서 하루 동안 정치 배양한 다음 여과액이 떨어진 위치에 투명환(Clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 에로모나스 살모니시다 균을 사멸 시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 에로모나스 살모니시다 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있었다.
에로모나스 살모니시다 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하였다. 순수 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(Plaque assay)을 이용하였다. 이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음에 이를 에로모나스 살모니시다 균의 배양액에 첨가해 주어 4-5시간 동안 25℃에서 함께 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 에로모나스 살모니시다 균의 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 25℃에서 4-5시간 동안 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음에 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하였다. 통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회만으로는 달성되지 않기 때문에 이때 형성된 용균반을 이용하여 앞 단계를 전체적으로 다시 반복하였다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 반복 실시하여 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보하였다. 통상적으로 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복 수행하였다. 그리고 최종적으로는 전자현미경 분석을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인하였다. 전자현미경 분석에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 설명한 과정을 반복하였다. 전자현미경 분석은 통상의 방법에 따라 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(Copper grid)에 묻히고 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(Negative staining)과 건조를 수행한 후에 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 관찰하였다. 순수 분리한 박테리오파지의 전자현미경 사진이 도 1에 제시되어 있다. 형태적 특징으로 판단할 때, 신규 확보된 박테리오파지는 미오비리대(Myoviridae) 박테리오파지에 속함을 확인할 수 있었다.
이런 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제 과정을 거쳤다. 순수 박테리오파지를 포함한 용액에 용액 전체 부피의 50분의 1의 부피로 에로모나스 살모니시다 균의 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 4-5시간 동안 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 충분한 수의 박테리오파지가 포함된 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과한 다음에 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol; PEG) 침전 과정을 실시하였다. 구체적으로, 여과액 100 ㎖에 10% PEG 8000/0.5 M NaCl이 되게 PEG와 NaCl을 첨가한 다음에 4℃에서 2-3시간 동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0) 5 ㎖로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.
상기 과정을 통하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 Aer-SAP-2로 명명한 뒤, 2015년 9월 22일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 12909BP).
실시예
2: 박테리오파지
Aer
-
SAP
-2의 유전체 분리 및 유전체 서열 분석
박테리오파지 Aer-SAP-2의 유전체를 다음과 같이 분리하였다. 유전체 분리에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 부유액을 이용하였다. 먼저 부유액에 포함되어 있을 수 있는 에로모나스 살모니시다 균의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ㎖에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음에 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 10분간 정치시켰다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음에 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K(20 ㎎/㎖) 100 μl를 첨가한 후에 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(Sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(Phenol) : 클로로포름(Chloroform) : 이소아밀알코올(Isoamylalcohol)의 혼합액 10 ㎖을 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음에 분리된 층들 중에서 위층을 취하여 여기에 1.5 부피비의 아이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol)을 첨가한 다음에 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 유전체를 침전시켰다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(Ethanol)을 첨가한 다음에 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물의 세척을 실시하였다. 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음에 이를 100 μl의 물에 녹였다. 상기 과정을 반복하여 박테리오파지 Aer-SAP-2의 유전체를 다량 확보하였다.
이렇게 얻어진 유전체는 마크로젠에서 illumina Mi-Seq 기기를 이용하여 차세대염기서열 분석(Next generation sequencing analysis)을 수행한 다음 박테리오파지 Aer-SAP-2의 유전체 서열 정보를 확보하였다. 최종적으로 분석된 박테리오파지 Aer-SAP-2 유전체는 53,870 bp의 크기를 가지며, 전체 유전체 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다.
확보된 박테리오파지 Aer-SAP-2의 유전체 서열 정보를 기반으로 Web상의 BLAST를 이용하여 기존에 알려진 박테리오파지 유전체 서열과의 상동성(Similarity)을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 50% 이상의 상동성을 가진 박테리오파지 서열은 확인할 수 없었다.
이러한 사실에 근거하여 박테리오파지 Aer-SAP-2는 기존 보고된 박테리오파지들과는 다른 신규한 박테리오파지라 결론지을 수 있었다. 이러한 사실과 함께 통상적으로 박테리오파지의 종류가 다르면 제공할 수 있는 항균력의 세기 및 항균범위가 다르다는 사실로부터 박테리오파지 Aer-SAP-2는 기존에 보고된 다른 박테리오파지들과는 다른 항균효과를 제공해 줄 수 있다고 판단할 수 있었다.
실시예
3: 박테리오파지
Aer
-
SAP
-2의
에로모나스
살모니시다
균에 대한
사멸능
조사
분리된 박테리오파지 Aer-SAP-2의 에로모나스 살모니시다 균에 대한 사멸능을 조사하였다. 사멸능 조사는 실시예 1에서 제시한 점적 실험을 통하여 투명환 생성 여부를 조사하는 방식으로 수행하였다. 사멸능 조사에 사용되어진 에로모나스 살모니시다 균주들은 균주은행을 통하여 분양을 받거나 본 발명자들에 의해 분리되어 에로모나스 살모니시다 균으로 동정된 것들로 총 17주였다. 박테리오파지 Aer-SAP-2는 실험에 대상이 된 에로모나스 살모니시다 17주 중에 KEMB4-337 균주(참조, KEMB: Korea Environmental Microorganisms Bank, 환경미생물은행)를 포함하여 총 15주에 대하여 사멸능을 갖고 있었다. 대표적 실험 결과가 도 2에 제시되어 있다. 한편, 박테리오파지 Aer-SAP-2의 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 비브리오 안길라룸(Vibrio anguillarum), 비브리오 익티오엔테리(Vibrio ichthyoenteri), 락토코커스 가르비에(Lactococcus garvieae), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 및 에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)에 대한 사멸능 조사도 실시하였는데, 결과로 박테리오파지 Aer-SAP-2는 이들 균종들에 대해서는 사멸능을 갖고 있지 않았다.
이상의 결과로 박테리오파지 Aer-SAP-2는 에로모나스 살모니시다 균에 대하여 우수한 사멸능을 가지며, 다수의 에로모나스 살모니시다 균주들에 대하여 항균 효과를 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 박테리오파지 Aer-SAP-2가 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 또는 치료 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 의미한다.
실시예
4: 박테리오파지
Aer
-
SAP
-2의
에로모나스
살모니시다
균 감염 예방에 대한
실험예
9 ㎖의 TSB 배지를 담은 하나의 튜브에 1× 108 pfu/㎖ 수준의 박테리오파지 Aer-SAP-2 액 100 μl를 넣어주고, 다른 하나의 9 ㎖의 TSB 배지를 담은 튜브에는 동량의 TSB 배지만을 추가로 첨가하였다. 그 다음에 각 튜브에 600 nm에서 흡광도가 약 0.5 정도가 되도록 에로모나스 살모니시다 균의 배양액을 넣어 주었다. 에로모나스 살모니시다 균을 첨가한 후 튜브들을 25℃의 배양기에 옮겨 진탕배양하면서 에로모나스 살모니시다 균의 성장 상태를 관찰하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 박테리오파지 Aer-SAP-2 액을 첨가해 준 튜브에서는 에로모나스 살모니시다 균의 성장 억제가 관찰된 반면에 박테리오파지 액을 첨가하지 않은 튜브에서는 에로모나스 살모니시다 균의 성장 억제가 관찰되지 않았다.
| 구분 | OD600 흡광도 값 | ||
| 배양 0분 | 배양후 60분 | 배양후 120분 | |
| 박테리오파지 액 미첨가 | 0.48 | 1.12 | 1.67 |
| 박테리오파지 액 첨가 | 0.48 | 0.23 | 0.14 |
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Aer-SAP-2가 에로모나스 살모니시다 균의 성장을 저해할 뿐만 아니라 에로모나스 살모니시다 균의 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 박테리오파지 Aer-SAP-2가 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방하는 목적의 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다고 결론지을 수 있었다.
실시예
5: 박테리오파지
Aer
-
SAP
-2를 이용한
에로모나스
살모니시다
균에 의해 유발되는
질환에 대한 예방 동물시험
무지개 송어(평균체중: 23.4 g, 평균체장: 15.8 cm) 20마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후 수조에서 분리 사육하면서 14일간 실험을 실시하였다. 수조의 주위환경은 통제하였고, 수조가 있는 실험실의 온도는 일정하게 유지시켰다. 실험 개시일로부터 시험 전기간 동안에 걸쳐 실험군(박테리오파지 투여군)의 무지개 송어들에게는 1× 108 pfu/g의 박테리오파지 Aer-SAP-2를 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미투여군)의 무지개 송어들에게는 박테리오파지 Aer-SAP-2가 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 시험개시일로부터 7일째가 되는 날부터 2일간 1× 108 cfu/g 수준으로 에로모나스 살모니시다 균을 급이하는 사료에 포함시켜 하루 2회씩 급이하여 에로모나스 살모니시다 균 감염을 유도하였다. 시험 개시일로부터 9일째가 되는 날부터는 매일 모든 시험동물들을 대상으로 절창병 발생 상태를 조사하였다. 절창병 발생 상태 조사는 체표의 궤양 크기를 측정하는 방식으로 실시하였다. 체표의 궤양 크기 측정은 통상 사용되는 Ulcer size(US) score{정상(궤양 없음): 0, 약한 궤양(궤양 크기: 0.5 cm 미만): 1, 강한 궤양(궤양 크기: 0.5 cm 이상): 2}를 측정하는 방식으로 실시하였다. 그 결과는 표 2와 같았다.
| US score(mean) | ||||||
| 날짜 | D9 | D10 | D11 | D12 | D13 | D14 |
| 대조군(박테리오파지 미투여) | 0.40 | 0.45 | 0.60 | 0.65 | 0.75 | 0.80 |
| 실험군(박테리오파지 투여) | 0.10 | 0.05 | 0 | 0 | 0 | 0 |
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Aer-SAP-2가 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환의 예방에 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
6: 박테리오파지
Aer
-
SAP
-2를 이용한
에로모나스
살모니시다
균에 의해 유발되는 질환에 대한
치료예
박테리오파지 Aer-SAP-2의 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환에 대한 치료 효과를 조사해 보았다. 무지개 송어(평균체중: 23.6 g, 평균체장: 15.8 cm) 40마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후 수조에서 분리 사육하면서 14일간 실험을 실시하였다. 수조의 주위환경은 통제하였고, 수조가 있는 실험실의 온도는 일정하게 유지시켰다. 실험 개시일로부터 5일째 되는 날부터 3일간 1× 108 cfu/g 수준으로 에로모나스 살모니시다 균이 오염된 사료를 하루 2회씩 통상적인 사료 급이 방식으로 급이하였다. 에로모나스 살모니시다 균이 오염된 사료 급이 마지막 날부터 절창병의 임상증상을 보이는 개체가 두 수조 모두에서 확인되었다. 3일간의 에로모나스 살모니시다 균이 오염된 사료 급이 시행 다음날(시험 개시일로부터 8일째가 되는 날)부터 실험군(박테리오파지 투여군)의 무지개 송어들에게는 박테리오파지 Aer-SAP-2를 포함(1× 108 pfu/g)하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미투여군)의 무지개 송어들에게는 박테리오파지 Aer-SAP-2가 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 에로모나스 살모니시다 균의 강제감염 후부터 3일째가 되는 날(시험 개시 8일째)부터는 매일 모든 시험동물들을 대상으로 절창병 발생 상태를 조사하였다. 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 절창병 발생 상태 조사는 실시예 5에서와 같이 체표의 궤양 크기를 측정하는 방식으로 실시하였다. 그 결과는 표 3과 같았다.
| US score(mean) | |||||||
| 날짜 | D8 | D9 | D10 | D11 | D12 | D13 | D14 |
| 대조군(박테리오파지 미투여) | 0.95 | 1.20 | 1.45 | 1.50 | 1.60 | 1.55 | 1.60 |
| 실험군(박테리오파지 투여) | 0.95 | 0.85 | 0.40 | 0.30 | 0.20 | 0.15 | 0.10 |
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Aer-SAP-2가 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환의 치료에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
7: 사료첨가제 및 사료의 제조
박테리오파지 Aer-SAP-2 액을 이용하여 사료첨가제 1 g당 1× 108 pfu의 박테리오파지 Aer-SAP-2가 포함되도록 사료첨가제를 제조하였다. 사료첨가제의 제조 방법은 박테리오파지 액에 말토덱스트린을 첨가(50%, w/v)한 다음에 동결 건조시켜 제조하였다. 최종적으로 고운 가루형태로 분쇄하였다. 상기 제조과정 중의 건조 과정에는 감압 건조, 가온 건조, 상온 건조도 대체 가능하다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 사료첨가제도 박테리오파지 액 대신에 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0)을 사용하는 방식으로 제조하였다.
이렇게 제조된 2종의 사료첨가제 각각을 중량비로 250배의 양어용 생사료와 혼합하여 최종 2종의 사료를 제조하였다.
실시예
8:
약욕제의
제조
약욕제는 다음과 같이 제조하였다. 박테리오파지 Aer-SAP-2 액을 이용하여 약욕제 1 ㎖ 당 1× 108 pfu의 박테리오파지 Aer-SAP-2가 포함되도록 약욕제를 제조하였다. 약욕제의 제조 방법은 박테리오파지 액 제조 시에 사용하는 완충액 1 ㎖ 당 1× 108 pfu의 박테리오파지 Aer-SAP-2가 포함되도록 상기 박테리오파지 Aer-SAP-2 액을 첨가하여 잘 혼합해 주는 방식으로 제조하였다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 약욕제로는 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액 자체를 그대로 사용하였다.
이렇게 제조된 2종의 약욕제는 부피비로 1,000배의 물로 희석하여 최종적인 약욕제로 사용하였다.
실시예
9: 무지개 송어 사육에서의 사양 효과 확인
실시예 7 및 실시예 8에서 제조한 사료, 및 약욕제를 이용하여 무지개 송어 사육 시의 사양 결과 개선 여부에 대하여 조사해 보았다. 특히 본 조사는 폐사율 관점에서 실시되었다. 총 200 마리의 무지개 송어를 100 마리씩 한 그룹으로 총 2개 그룹(사료로 급이한 그룹-A; 약욕제로 처치한 그룹-B)으로 나누어 4주간 시험을 실시하였다. 각 그룹은 다시 50마리씩으로 구성되는 소그룹으로 나누어지며 각 소그룹은 박테리오파지 Aer-SAP-2가 적용된 소그룹(소그룹-①) 및 박테리오파지가 적용되지 않은 소그룹(소그룹-②)으로 나누었다. 본 시험에 대상이 된 무지개 송어는 5주령의 무지개 송어(평균체중: 23.8 g, 평균체장: 15.9 cm)였으며, 각 시험 소그룹의 무지개 송어는 일정 간격을 두고 위치한 격리된 각각의 수조에서 사육되었다. 각 소그룹은 다음의 표 4와 같이 구분되고 지칭되었다.
| 적용 | 소그룹 구분 및 표시 | |
| 박테리오파지 Aer-SAP-2 적용 |
박테리오파지가 적용되지 않음 |
|
| 사료로 급이한 그룹 | A-① | A-② |
| 약욕제로 처치한 그룹 | B-① | B-② |
사료 급이의 경우에는 실시예 7에서 제조한 사료를 표 4의 구분에 따라 통상적인 사료 급이 방식을 따라 급이 하였으며, 약욕제 처치의 경우에는 실시예 8에서 설명한 약욕제 제조 방식에 따라 제조한 약욕제를 표 4의 구분에 따라 약욕제의 희석액에 어체를 담그는 방식으로 실시하는 통상적인 약욕제 처치 방식에 따라 처치하였다. 그 결과는 표 5와 같았다.
| 그룹 | 폐사개체수/시험개체수 | 폐사율(%) |
| A-① | 3/50 | 6.0 |
| A-② | 11/50 | 22.0 |
| B-① | 4/50 | 8.0 |
| B-② | 15/50 | 30.0 |
이상의 결과로 본 발명에 따라 제조된 사료의 급이와 본 발명에 따른 약욕제의 처치가 무지개 송어 사육에서의 폐사율 감소에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 조성물의 적용이 무지개 송어의 사양 결과 개선에 효과적이라는 결론을 내릴 수 있었다.
이상의 결과로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[수탁번호]
기탁기관명: KCTC
수탁번호: KCTC 12909BP
수탁일자: 20150922
SEQUENCE LISTING
<110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd.
<120> Novel Aeromonas salmonicida bacteriophage Aer-SAP-2 and its use
for preventing proliferation of Aeromonas salmonicida
<130> KP090543
<160> 1
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 53870
<212> DNA
<213> Bacteriophage Aer-SAP-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (28927)..(28927)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (39301)..(39301)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
catcatcctg aaccagacca ctccggaagg tcaggagacc gtacgtatcc gtgaaaccct 60
gccgctgcag ttcctaccgg tacagctgca tggtctggta tacgaagttc ctggccgtgg 120
ccgcttcgcc ggtctcgaag tcacctaccc gcgtgctatc gacatctggt acggcaacta 180
agaagtatca acagagggtc gcaaggccct ctataaccat ctgttggaga ataaaatgca 240
agtcaagaac acccaagatc actacgtatc ttttactgcg cgtatgaacc ctggcgctaa 300
gaccaaaggc tatgacgccc acggcaatga gatcatgaaa gagtctctgc cgcagctcaa 360
gaccgtgacc atccctccgc tggcaacagt cgagatcgat gacgcgatct ggaatgctgc 420
taccaagggt aagcccgctg aacggcagaa aatcaccctg gagaaagagg cggttcagat 480
cggcactgac aagagcggtg cagtagcaga acatttcatc tccgtaccga ccggtaacgg 540
cgtgtttacc tcgttcaacc ctgtgctgga cctggtgaag caaggtaccc tggagatcgt 600
tgagcatgct gctctgaata tcaccctgga gcagatgcgt attgcggtcg agaaggcaca 660
aggctacgcg ctgccgaagg aagtggaaga agcgaagctg gtaaacatgt accacttgct 720
ctgctcctaa ggagagccaa tgctgactta cgacggatgg ctggataagt tcccgcagtt 780
cgttgcagta tccgagcccc agtggcttga gatgcggttg gaagcagcaa cagagatggg 840
tacagatgtt gggcgatggg caggtgaaga aacctacgat atcgcccaag gctacctgat 900
gggccacttg gctgcgcttg cagaagcgta tgagtcgggt gaccactcac cgctgcaacc 960
attccgtgag aaagaggtgg acgatgttcg ggttgagtat gcagtctctc gagatatgca 1020
gaacaacctt gacccatacc tgtccacaac ttacgggcaa cagtacatca aatggcgtag 1080
gatggtattc gctggcccac gtgtaatctg aggtaattat gatttcacta caagcagcgt 1140
ttggtactca cacgaccacg aaggtgatgc taagattaga gataccggga tactacgatg 1200
atgataatcg ttgggtacct ggcggctatg gtccagcatt ccctatccag gcgacgccag 1260
taccgctcgg agacccagac tatggggact tcggtaaagc acttaaggca gaccagactg 1320
gggaaagaca acctgcccag ataaagatag cttctatatg gaagctacct aacaactcgc 1380
tgatggaata cggcactgag ctgtacaaga ttatccgaga gggcgattat catgcagcgg 1440
gattctggat ggctattggt gcaacagaca ccacagcgta cccagtgaca gctgcggact 1500
acccaagtgg tatgacgctg atgcgaggga tgaaagaagt tcccgtggct cgagcagcca 1560
gagtgaggta cagtggaagc tgatgataca atcaaagcga tgaaattggt tgacctcgcc 1620
cttggcaagc ctaagtatac ctacgagatg agggtgaaca gccctaagcc gaaaggtagc 1680
tttgccgcag tgcttctggt agaggaacac aatcctggtc gagaccgaaa cgaggtggtg 1740
gaaacgccat ctggttatgt gaacagaaca actggtgtaa ggttagtgac cttccaggtg 1800
ctattcacag aaggtatccc ggaatcctcc caattcattt cgagctttat gcgcccagac 1860
attcaagact atatggtgca gaatgatctg gcggtgatgc gccataaaag gatcaccaac 1920
aaaactctta cgttagagac caactgggaa atacgtgaga gcgtattcat cgagtgtatg 1980
gtgcgccgta cgttcgatag cgggataagt gtcattgaca atgtagaagg tactggccaa 2040
tacaatgaag gtgagcgtat agtcccgatg aacatttcaa tcaaggaacc ttgatgagcc 2100
ttccaatcac tagcgtcgtt gacgtaaata tcctcatcgc cccgaaggca aaggcactcc 2160
agagctttgg taagctggcc ttcgtaaccg atgagctgcc gaagctcgta gggctgagca 2220
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tctacaaggc cgctaccgcg ttctatgctc aaggcgccaa agacttcgtt gttgtaattg 2340
catccgcagt ggcgaccgca gctgttctgc aaggtggcgc accgaatcta gccaacttgc 2400
aagcagtaga tgctggtggc ttcaccatct ccgtaggtgg tgctgtacag aacatcactg 2460
gtctggactt cactaaaatc gctactctgg ctgacgcagt acccatcctg caagcagcaa 2520
tgaccggtgt aacagtgtct gtggcagacg acaagttcgt catgaccacc actacagtcg 2580
gtaaaggtgc gtccatcact gcagcaactg ccgacattga cggcgcagca gccgcactgg 2640
cactggcaag cactgctggg gcaacagttg tgaccgcgaa agagcccgag actccggttg 2700
aggcacttat tgcagctgct gatatcgacc cgaccttcta tggcatcgac ttgcataaga 2760
agtggcgtga ctctgctctg gccgttggcg tagccgagta cgcacaaggc agccgccgtg 2820
tagcgttcgt aacctcgaac aacactgcca tcctggatcc gacctccacc accgacattg 2880
cgtctgaact gaagagcaag tcactgcaac gtgccctggt acactacagc tcccatgcag 2940
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acaccaccat taccctgaac ctaaaggtga tgcgcggcgt gaccgtcgag aagctcaagg 3060
tgtccgaaga caatgcgatg aaggcgaaga actgcaacgc tgtagttgac atcgctggtg 3120
cattcgtgta ctccgattct cgcatggcag atggcacctg gttcgatgct gttcacggtg 3180
tggactggct ccagaaccgt atcgaaactg gcatcttcaa ccgactgtac accactgctc 3240
ggaagatccc gtacaccgat actggtgtgt ccatcatcat cgcagagatc gagcaggcac 3300
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tgccgctcgg gtaccgtatc acctacatcc cgactgcaca ggtatctcag gctgacaagg 3420
ccaaccgtgt ataccgtggt atcacctttg aagcagttgg tgctggtgca atgcatcagg 3480
taattgtctc tggcgaattt aacgagtaag gactccgatg aaacagtaca gcttttataa 3540
cgtcgacctc ctgatcgatg gtatcccagt cgaaggtttc tccgactcta acgccatcat 3600
cactgccacc cgtgacgctc cgcaacacgg caaggtgatg gatgcgcgag gcaagatggt 3660
agccatcacc tccgctgata agtcgggtac catcaccttc gacctactgc aggtctctga 3720
caccaaccag tggctgcaac tgcgtgcgat gcaaactcat gactccggta cttccggtgg 3780
cactgaaacc ttcctgcctg tccaagtcat gatgaatgac aagatgggtg gcaacatcgc 3840
taccggtgtg aatggtatca tcaccatgca gcctggcctc atccgaggta ccggtatcgc 3900
aaccgacact tgggtactgc aattcgaaca gctgtggctg gttcgtggtc agtccgagaa 3960
agtcggcgta taagtaacaa aggagtaacc gatggcgtgt cgtgacatga accggattat 4020
cgctgataat cccatgcact gtcgtcagtg gcctgcttcg attgcgttgg aaaacttaag 4080
tgaagcgttg ggacttatgg gtcccaacct ttctttcttt gttgacgggt cgtatcagtt 4140
cgctgacgtt ttgcaagtac tacattcgtg tgatcataaa aggcttactg cgctgctgaa 4200
gaaattcgta tgtgcagcaa agctgaacgg tcaagaagta aatgaaggtg ccttcaacat 4260
cgtctatggc ggtgacttgg caagagtatt cgatgtcttc gcatttgtgt gcgaggtaaa 4320
ttaccgagat tttttcgagc aaggggtaac tcctccagag caagaccaat cggaacaatc 4380
cgaagagcag ctggagccgg atctgctgat gcagagtatg accccctaga agtaaagccg 4440
aagacactcc cagagttgtt tccggatatt gacttctacc tgtatcgcgg tgtaatagca 4500
aaccctccga tgtgccaact aggtgacctt tcggatgggt ctatctcgct gtatgagctc 4560
catatcatgc acgagctgct tgacctgaaa caggaactca aacaaggaga cgacaatggc 4620
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cgactataag aaggcagtta gcagccactc atacgcagct gcgcagtttg agactccaaa 4740
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agacgcaagc ggcttctcaa tgagcactaa ccctgctgag aaactggcgt acatggcgca 5040
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tttgattgct ggggcataca ttgacccgaa caagattgag ggaggtgagt ttggtcctgg 5400
ataccaggca ctgcacagtc gcttgtcgaa gattctgtct cgacaaatcc cagcgcggat 5460
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caccgaggct atcaaaacca tcaggactgc gtatcgctca ggtaacgaag gcgggctagc 5700
gaagcctaag aacttcgagt accgtgaacg tcaatacctg ctggatgaga tggctgcatc 5760
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cgacttccgt gtaactacgg atgccagtga gttgatgaac tcggcgctga agtccctcgg 5880
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accgaaagcc gcgctgctgg agagcgttaa gacaccaata ccgtttgctc tagagccgta 6060
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accgaagaac atgaagccag gagacacaat ccagacttca gccgaggtga agcaagaggc 6180
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gcttaaggct gtagcgtctg atgatgataa gtcagaccca atgtcagctt ggcagagaca 6300
ccgtagaggt aaggtaacat cctccgctgc tggtgcgcta gctgacccag aaagccaacg 6360
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aggtagaggt agtatctgga ccaagtccgg tgatgccctt gaacctatag cgctggactg 6480
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ggctgggcag gcaacaacac cagatgcaat tgctgatggt ggtcgtcgta acgtagaggt 6600
taagtctcgt aacagattca tagacccgaa caacccgcta gacgcaaacg aggcgaagac 6660
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tgaccttatt gaaatcctgc gtgaccaaga aaacccaaat gcccctttag gtaaggctgg 6780
cctgaacgac aataacatcc gtaagagaag agttgatcgg gatgatgaac tcattagaca 6840
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tcatgcccag aagatgttcg ccaaagctgt cgaagaaggt aacatccaat ccttcgagaa 6960
gctgtccaag aagtacggta tcgaaggggc ttctgctcta ggtgcaacac tcggcttgac 7020
tgagggtggc ggcggtggag gtggtggcgg aggtggccgt aagccatacc gtggtaacta 7080
cggtggcttc ggtggtcgtg acgccccgag tactttccgt ggcggtgttc gtggtggtct 7140
agctgtcatg ggtcggccag ggaagctgct gaacgtagcg ctgtctggtg cagagatcat 7200
gtgggacttg gcaaacaacg tcaatgactc cggtctggag ctttcccagc aagcacgttc 7260
tatgggtatg cgggaagata tattccgtag gtctcggctg agcatgaccc aagggcggta 7320
cctgactgat gcagatgcta tgtcagacat gtcctccgta gcgctggcta agggtggcct 7380
tgagcttggc ttcactgacc gagctgtcaa tctggtgaca agcactcgtg gtgcgatcac 7440
tctgggtgat atccacggta ccaacctgaa tgatccagat gctatcagaa acctgatggc 7500
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ggagcagtcc ggactcaggt cgttgctaag tgcagctgac gtatcggctg ggcgtgagaa 7620
cctgaacaac accatcacca gcatcaacga caatatcctg gagctcaagc taacagcatc 7680
tgactacctt ggtgaagtag ctggctttgg tgagaagtac ttccgtgaga tgacagacgc 7740
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catgcgtgct ggaggtaagc ttgaagtgga actcacgacg aagggtatta acctgacggt 8100
gaaagaccag gacgggcgta taacatcacg tgcgttcaag ccgtaccaag cacagatgga 8160
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ttggcacagg caagtctcac catcttcaac ctgtcggagg agaactccaa ggcactgacc 8340
tttggagatc atgaggttgg gtccactggt aatgcagaag ctgtgcggaa agcagaaaag 8400
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ctaatccttg agggtatagt gatgaacgct tcggccagac gagctctacc agagcacatc 8520
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ttctcaacgg aaggcggggt aacctttgac ctcccggaca gcatattgtc ccaggatatg 8700
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gtaaagccgt tcttgttaaa ggctgcgcct actgtaggtg tagctacaat cagcttcacg 8940
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tctcgcggtg acttgtcatt gccatcgggg ggcttgccgg attacacggc gattggcgcg 9060
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aaagtaatcc ataagattga taactatcaa gacttgtggg agacttcagt agtaggcact 9180
gtaccgacga ctggtgattt tggcaaatgg gagcagtatg gctaacaaac tacgtgaatg 9240
catgatcgta tgggaggagg agcctggcag cggaaaatgg agtgtactag cgttcgatgg 9300
tgttataaac gaaggcttta gcggtgcggt gcaggttaca tcgtaccctg tagactcagg 9360
cttcatggta tccgaccatg cgatacggca gaacagaata atccagttag acacgatcac 9420
ttcgaatttc tccatgtcgg ttgctacatc gaggaagaca ttcgaagaat cgtataacga 9480
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gaagtacggg cgagcggctt acgacaatga cagcatcacc ttctctatac cgtacacgag 9660
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cgagaaggtg gacgagacgg taaacaccat cgacaggctg aacgcgttgg gtaagctagt 9780
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tataccatca ccgacgaagc acaaagtacc gcagattcgt acgctggtaa aagagctgga 41760
acacgaggca ctggaaagac tcggcctgaa ctatgaaggt ggtctaatcc aacatgaagt 41820
gctagcgctg aaaatctgcg acgtgctcga aggcctccat tacactgcga aacactacca 41880
cataaccggt ggtgtcgaag gcggacaaac gctccaggcg tgggtcgatc tagctaagaa 41940
actcccactg aacgaggcgc agctcgaatt catgcacgac tgtgtgcgca acccagaatt 42000
cgtaaaggtg cacttatgag cataactgta gtagacgtgt tccatcagaa ctacgatgct 42060
gatgacggta taccatcgca ctgggcagtc aagtactacc gtggtgcttc tgggtggccg 42120
gagtatgaat actgcgagac ctacgaagaa gcagagcagt ggattcgtaa gaacgcagac 42180
aacgcggact catttgtatg aacccatgga tcaaatccgc tgtgtgggta gtagcgatac 42240
tgctcatgat ttacgtttat gcgtacagct tcctgaacac aggtgtgacg cctgaacaag 42300
ccgcttattt cattgaggac atactgaaat gaagcaaaca gaactgagta tctcagtgca 42360
gaaggcccta catctgtaca tcgaggaaga aaagaaagcg ccgaagcatc tgggccacga 42420
gtacgccatc ttcgagaagt acgatggctg gtacatgtac gtagacttcg tcgatggcgc 42480
atggcaaggg atcaggtcga agaccggccg ccaactctac tccatgggct ggtacaacga 42540
gctgctggag aaagggccca agcctaacca gaatctgcgc atcatctttg aagctgttat 42600
ccctgggatg atcttcaagg acgccaacgg ccggtttaac cagagcaaag agcgtctgac 42660
aaacgtggta tgctgggctc acgacatcct gttcgagaaa tacccgcata ccatcttctc 42720
caaacgctac gaccgcctgg tatcggtgat caagtacctc gattacagct ggctgcgctt 42780
ggcaccgatt ctaaccgtca cctctgacac caaggcctgg tacgagcact atgagcgcat 42840
catcagcacc cgtgaccaat ttggccacac gggtgaaggc atcatcgcca agaagtggga 42900
cgagccgtac catggaggga agcgcgactt ctctctgatg aagattaagt gcgagctcac 42960
gcttgacatg gaaatcatcg gatggggtaa aggcaagcct ggtagcaaat acgaaaacac 43020
cctcggttac ctggtagtgc gagagaagtc cggccagact caccaagtgt ctggtatgga 43080
tgactggcaa cgcgacgcgt gggccaggga cttcaacctg gtacgtggtg cggtagctga 43140
aatcgatgcc atgaagcgac tgcccaatgg ctcactgcgc gaagctcggt tcaaagcaat 43200
ccgtcacgac aaaaccgtgg cagacatcga ctaggagaat cagaatgcaa agagaatcta 43260
agaaaatcgg agtggccttc aatggccctc ctggcattgg taaagataca ctggtgaaga 43320
tgatcaacga tctgattcca ggcggcgtcg aagttggaac tctggccaac atgattcgca 43380
acaaagcagc tcagtactac ggcatcacag atttcttccg gttatcaacc gaccgggaga 43440
cgaaagatgt gaaatgccca ggctttagca tgacccctcg tcagatgctg attgactaca 43500
gcgagaacgt ggtcaaacag aatcgtggtc cggattactt cgctaaattg ttcgcgaaga 43560
aaatggcacg acattcatcg ttcatgatga ccgacctcgg cttcaaagaa gaggcgcagg 43620
cactggctga tgaagttgat ctgctgatca tcgtgcagct ggagcaccct gacttcgatt 43680
tcagtcgtga cagtcgcggt tacgtcaagc tgatgcaccc caatgcagta aatatgccgt 43740
tcatcgtcaa tcgcggcgat gcagacggtg acgctcgacg cgcccttgag accatccaac 43800
ggattatcga ggtacgcttc gacctctaac aagtaggagt ccaagttgga tcttagtaaa 43860
tacatgaagc ccgagcttgc ccgagtggta atcaagcggg acggaagtca tgaagaattc 43920
gatgtccaga agattgaacg ctgggcagaa tatgcctgca agcacaatgt cgactggaaa 43980
gaagtggcaa agaatgtcat tgagcgactc ccgtctcggg taacaactgc tgaaatccat 44040
cagacaatga tcgactactg tctggcgcag gactcccttg agtacagccg tgtagcggcc 44100
cgactggtat acgcccagct gcgcaagaac atgcagcgtg agctgggtgt aactgacagg 44160
tctaagatct acgacatcgc atacgccttg tggaatgcga aactctggag cttcgaagtt 44220
ctcaaagcag taggcgacaa cgaagagctg gtccaatcct ggtatgaagc agtattccca 44280
gttcacctcg agtcctggca agtaatgcaa tgggcggata aatatgcaat caagaaagat 44340
ggtattccgg ttgaaacacc gcacgtcggt gcgatgggta tcgccattgc aatccacggt 44400
gtcaccgatg acgcgtttcg tttgtgccgt gcgattgtcg aaggaaagat caatctccct 44460
acgccagttc ttaacggttg tcggaacggg gactttgact ctatctcatg ctcagttatc 44520
actggcggag acactgtcga ctccatcggc gtagcagagc atcttgcgta taagatgact 44580
gcaaagaagg caggcattgg tatcgagatg cgaactcggt ctgctggcga tgatgtcaag 44640
aacggccgta tcaaacacct gggtaagcac ccgatttacg cagccgttga taaggctgtg 44700
aagatgttca cacaggtaag ccgtggtggt tctgccacta tgaccttctc ctgctatgac 44760
cctgaaattg tgatgctgct aaagctcaaa tcacaacgta ccccgttgga tgttcgtctg 44820
gacaagatgg attattccat ggcgtacgac gatgcgttcc tggaagcggt aatacgtgac 44880
caagaagtag agctcaagaa cgttaaaggc aagcccgccg gaaccatgaa ggctcgtgac 44940
atcctgaaag cgttcctgac tgctcgtgca gaaaccggcc gtgtgtactg cattaacctc 45000
tctgaggcca accgccacac gccgttcatt gatcagatca cactgagcaa cctgtgccaa 45060
gagatctgcc tgccgaccaa gccgttcacc aatatgctgg acctgtacaa cccgactcct 45120
gggtacgtat ctgaaggtga gattgcattc tgctctctgg ccgcaatcaa cgtgtacaag 45180
gtggacgaag ctgaatatga ggacatcgca tatctggcgg tgaagaccgt ggacaacctc 45240
atcgacaagg cccccgccct gagccccgca gtggcccata agctgcaagc gcggcgctcc 45300
ctaggcatcg gtattaccgg cctggcgggg tggttaggcg atgttcctgg tggctactcc 45360
aacacgcgcg cgattgagtc cctcgccgag gcccactact actggtgcct caaggcatcg 45420
caacgcctcg ttctggaggg tagagcgccc gtctctggca tccgtgaaga ctggctaccc 45480
atcgatactg gccaccagac cgtgccgcct acgatggact gggagagcct ccgtggcaag 45540
ccccgccgga acagcgtact ggtcgcgcac atgccgaccg agtcgagcgc ggtattcagt 45600
gacgccccaa atggcctcta ccctgtgcga gactctgtca tagccaaggc gtcgcgatac 45660
ggccttatca agtatatcgc ccctgccgtg tgcacagagc gggcctggga cgtgggcaat 45720
gatgtcctag ctcgagccta tggtgcagtg cagtcctata ctgaccaggc catctctgct 45780
gactactacg tcaccccagg tcgctaccca ggcggcaagg taccaatgtc ggtactaatt 45840
aaggagtggg tcattgctgc caaggctggt gtcaagacca tgtactactc caacactaac 45900
gatttcaatg gcggtgcgtt ctctcaacag gaaagtgagg gctgcgacgg cgcctgtaaa 45960
ctgtaaggaa gaatcatgtc agttttcaat gctgggaata ccggttacaa gacaggctac 46020
caacgcctgt ttctgggtgt aaaacaaggt ctgctggaca ccatcaacgt tcaataccct 46080
gagctggaag cgctgtatca acagcagatg tctcagatct ggaacgagtt cgaggtggac 46140
ttgtctcagg accggatgga catgctggag acagataaga gtgttactga tctgatggtg 46200
aagactatca gctggcaaca tctcgctgac tctgtagcgg cgcggtctat ctccggcctg 46260
ctgatgcctc atgtgaccaa ctctgagatg gagaacttga tcaacgcttg gtcactgttc 46320
gagactatcc atgctcggac ttatagccac atcgttaagc aaaccttcgc tgatccaggt 46380
cagatgctgg aagagaccta cgctaacaca gcggtgctca acaggtccca ggcaatcgtt 46440
gaagcattcg acgagctgga agctgcgaac aagcgtggtg atgttgatga tatcgatatt 46500
atccttacac tgacagcgct gtttgcactg gaagaaatcg gcttcatggg ttcgttcgcc 46560
gtgaccttcg gcatcgcaga acacaccggt aaattcatgg gcatcgccca gctggtgaag 46620
ctgatctgtc gtgacgaagt gctgcacacg cggttcaacg gtgcgattct caagatccat 46680
cagcgtatcc ctgagatcga catgtacctg cgccagccca tggtgaagca gcggatccag 46740
aaaatcctgg acgcagttgt agagcaagag gttgtattcc aagactacct gttctccgag 46800
ggtcgggaat gcatcggcat caacgcaagt ctgatcaagc agtatatcta cttcatggca 46860
gcaccaatgt atgaagccta tggcctggta cctggcttcg acgtgccgaa gaagaacccg 46920
ctgccctaca tggaccattg gattgatgga agcaaagtgc aagtggctcc gcaagagctg 46980
cagaacagtg cgtaccaagt tggggcagtg gctgatgaca cacacgacct cgacctggga 47040
gatttggacg gcctatgaca gaaaatccct tcgagcctat tgactcgcaa gaggacaact 47100
ttctagtcgt ttgtatggtg cagaactatg gtgacctgct gaaggtctcc agaacgaggg 47160
gtgtgttacg cacccttccg aatctgcgag agtacctgac caccaacccg tacatcctgt 47220
gggagtacaa agctgccata gaagcggagc gggacggtca gggcctaacc ggcaacgctg 47280
tcctcaattc gctcatcacc gcccagctgg ctgcgttcca gattggcgac cacaagaaca 47340
ccaagatgta ctcggatgag atcaagaagc tcatcaccga gggcgtcaag actgccactg 47400
tcgaacagac ggtgagccag atagccactg gtagttcatc gctagtggat gagattctca 47460
gtagcccgct cgatgttgat atcgatgcga taactactga agacgcgaac agggtccgcg 47520
aaattctcct agaccctgac ggaggctttg aggtatttag taagtggtgc tttgagatcc 47580
agatgggttt caaattccaa atgcaggatt tccattcgat tatattcgag ttctgccaga 47640
aggtcgtcaa cggcgaaatc gacagaggaa tcgtatgcat accaccacga cactccaaga 47700
cccaaatcct cagcatcttc cttccgctgt attccttctg tcacaacccg accagccaca 47760
atatcataac gtcctacgcg gatgacgtgg tggctgaatc gtcgggttac atccggcaaa 47820
tcatgacgga tgacctcttt cagaagatct tcccatcagt aagaatagac ccaagcaagc 47880
gctctttgga gcgttggggt actactcgct ccggtgtaat gcacgccgta gctacaggtg 47940
gcaaaatgac taaacagtct ggtcatttaa aactaagcta attcggtgga aacctccaag 48000
gaggcaatac cgagctaaat ccaacgacat gaggctggac ccatgaagct aattacaaaa 48060
ggcagattcg ctggtaagta cggagtcaca gaggacggac agatatactc agtgcgttca 48120
aagaaattcc tgaagcacga caaacagccc acatcagtgg ggaaccgtcg tgtagaatac 48180
cacagagtaa acctatttgc caacgggcat tcaaagcact atgcggtgca tagactggtg 48240
gcaatggcat ttgtccataa cgatgaccct gtgaacaaga cccaagttga ccataaggac 48300
aacgatagga gcaacaacgc ggcagccaac ctcgaatggg taacaccaga agagaatatg 48360
gcgcgttgta ttgcggagag actccatgtc agaggagaat cccactattt ggcgaagtac 48420
acagatgagc aggtaacgat ggtgcgagaa caccacgcaa tgggaatttc tcgtaaggag 48480
tccagtcgcg tgagtggagt atcggaatct gctgtaaaag atatacgtat gggcagaaca 48540
agagttggat aatgtgtaac gactagtccg ataggacgta cacccaagtg ggtggaaacg 48600
cttagccctc aacgaggtga tgatatagtc tgatctgcat agcgatatgc agctggatta 48660
actatccggg agtagattaa cgacctactc tgaacataat gggtaaaggc gcaggttcac 48720
tatcgacaat ctattccggt tgctttgtag tggatgatgc gatcaagccg aaggacgcgt 48780
actcaactcc agtacgtaaa gaaattaacg atcgattcga caacacattc atgtcccgtc 48840
ttgcaaatga cggtgtcgtg actggagaga atggtgaaca aatcgattgt gcgagaacgc 48900
cgatggtcat tatcatgcag agggttcatg atgatgatct ggtcgggcac atcttacggg 48960
gtggctcttc cgacaaatac acgttcctga acatcccagg aatcgtaacg cctgagtgcg 49020
gtaccgagaa atggtacaac acaatatgca cgaagcaagc atacactcat gctataccct 49080
atctgtacga cttaaagcgt gggccaggcg agtctgcctt gtggccaagc cgtaaaagtc 49140
tcgactctct tatcgcgatg agaaacgcga ctccgtatac ctttaactct cagtacatgg 49200
gagacccaac cgccagaggc acaggcctaa tccaagagga ttggtggaag gaatgggtgg 49260
agatacccta tgaggaggtc gttcagtcgt tcatgacggc ggatactgcg tctaccaagc 49320
aagactattc agactactca gtaatatgct ggtggttgaa gatgcgaagt gggttgctgt 49380
atctggcaga catcgaattg ggcaaatatg aaactccaga acttaaactc atggttgaag 49440
aattctggaa gaagcacacg aaattggatc tacgttatcc gatgctgctc cctactgcat 49500
tgtacctgga ggataagtct tctgggcaat tcttgaacca acagttcaca agggacggca 49560
atgtgcgagt attgccagta ccgaaagata agtcctcggg cgataagatt gctcgcttcc 49620
tcaacgtagt accttactac gcgcaaggcc gaatcattgt tccggctgag cacaaacaca 49680
aagctcatgt gatgcgagag atactcagca tgacaggcga aggctcggga actggccacg 49740
atgacgtggt tgataacttc tcagatgcaa cagtcgtagc tttcagctcg ccaggtatgg 49800
attattccaa ctggctctag gagaaatcat gggtatgaaa acccgcctgg accaacggtc 49860
cgagggcaat aaccgactgt ctatcgtaga cagcgaaacc ggcaaggtgg ttgctatcat 49920
cactgccgta tcaagcaagg ttgagattga gatcgagacc atgccgaacc tgcacatcga 49980
gaaacccaac ggattctcta gcaaacgcta aggaccaaca tgtctgatcc gaagaacgcc 50040
ttcgctgaga aagagaagga attccgtgac cgtatcaaaa tgggtgacgg gttagagaac 50100
ttcatgactg gcctcgggac cgagaaggac aagaactcat acaacgcgtg ggttcgaacc 50160
ggacgtaacc gagaccacga acaactcatc gtgcggtatc gggaagactg ggtagctcaa 50220
aaggtctgca atatccttcc tgaggacatg actcgagagt ggcggagatg tgactctcag 50280
gaagccattg atgtggacga tgagttccat ataagccagc tattccgaga ggcttatatc 50340
tgggctcgtg tgttcgggac gtctgcaatt gtcctcgacc tgaaaggcac tggacgagca 50400
gacacacctc tcgacttgtc acgactcaag aagggatgca tcagaagctt gcaggtagtt 50460
gatcgaactc gattgatgcc gactggtaca gtagagatga accccatgtc tacggagtac 50520
ggctaccctc agcactatac gctgggtggc tctacagtcc aaatccaccg gtcccgcatc 50580
ttaaggtttg agggtacgcc cttgacccga tacgagaatt ggaagaacca gtggtactca 50640
gactctgtac tgattccgct tgccaacact atcgacaact tccacaccgc agctgaatcc 50700
gccgctgcat tggttaacga agccagtgcc gacgttgttt ccatcgaagg cctgcagaac 50760
ctgctgacgc acccaaccgg tgagcagatg ctgtataagc gtttccgcat gatgaaacag 50820
atgaagtcaa tccacaatat cttattgatg gatagcaagg aagagtatgg cactaagacc 50880
attgctctga acggcgtcaa ggaccttatc tgggaatatc tgcgaatcat cgctgccgca 50940
gtaggtatcc ctgcaactcg attcctgtcc gcatcccctg atggtatgaa cgccactggt 51000
gagtctgacc tcaacaacta cgtagacctt atccggcaaa agcagaagtc tgtcttcgac 51060
aaacgactgc ggataatgga taaaattctg gctgctcatg caggtatcgc tgatttcaaa 51120
tacacctgga attgtgcctt ccctgagtct gcactccaga aagaagagcg tcgcaacaag 51180
ctagcagaca ccgtgtctat gctggtgagt gctggagtta ttactggcga tgctggtatc 51240
agtgtactcg agaatgagcg cctcttcggc gacctcaaac ttggcactgc tccggagttt 51300
gcgcctggcc aatataccaa gcgtgaaagt gacccgaagc cagatgcgtc tggtaaacct 51360
accggagaca aatctaaatg attttgaaac ccgaacatat gcacttccac gatgaggagg 51420
aactggagtc tatccgtctg gtagactttg cttttgacct cccgtcccag cgcaagttca 51480
aggatagcgg cgccatggtt gcacctgcta ccctggcccg agtgggcatc atggagtact 51540
cggctggcca gctgggtagc ctgtttgcgg acaagccgaa gaacgagatg atcaaggtca 51600
tgactcgtgc agaagacctg ttccacgcgg acgccatcga atccgctcgt agcgccccga 51660
tcaccatcgg ccaccccgcc gaagacgtca ccatcaagaa tgctgactac ctgcaaaagg 51720
ggaacctgga cggtgtacca ttcgcagatg aagacaacat ccatctgtca ggttacatcg 51780
tgctgaccca cgaagagtca ctcaacctgg tagatgctgg tgttgatcaa ttgtcttctg 51840
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cctacaagac aaacatccgt cacaaccaca tcgctatcgt gcctaaaggc cgcgccggtt 51960
ccgcccgtat caaagacgag gaagagcaag gtgacaagaa agacgaagtc aagatgtacg 52020
atcaggagta cgtctccggc ctggaagcta agctggatgc ggctgttact ctgactgact 52080
ctctgaaatg caagctggaa gctgcggaag ccaagctgac cgacgcgcat atccagtctc 52140
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ctcgtcgtga gcctgctgtc aagaccgctt ctcaggaagc acgtgagcgt atgatcgctc 52440
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cgatgcggta gaaggccaac tctacggtct gcaacagacc cgagccgaca tccagactgg 52560
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cctgcccgtc tgctctgatg gccgtgtggt cgtgaaggtg accgacgctg gtcaggcagt 52800
tcacggtgcc aaggtattcg tgcacaaggt aaatggcacc ttcgccatcg ccaccagcgc 52860
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gctaggcggc ccttatttct cagattccaa ggaatacaaa tgtcccgtaa agtaaaattc 53040
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aaagagtact ctatctctgt caaatccgta ggcgttgctt acgactacga catcgatgaa 53400
atcgccgccg ctcagatggc tggtatgccg ctggaagctc gtaagaccat ggctgctcgt 53460
cgtggctacg aagagtacat caactccgta gtatggcgtg gcgatgctga tgccggtctg 53520
aatggcctgt tcaccatcaa cgaaatccgt cgcatccccg ttgctgctgg caccggtggt 53580
aagaccacct ggaaggacaa gactcctgat gaagtcattg ccgacctgac caacgcctgt 53640
ggcgacatgt acgctggtac caagaagatt cacgctccga aagagatctg gatgtccact 53700
ctcaactgga actatatctt ctccaccccg cgtagcccga tgtctgacaa gaccatcggt 53760
gactacttct gcgagaacaa ccagttcggt atcaagaagg acaacatcaa gccgctgaac 53820
gaactggccg aaggtatccc catgggcacc ggcgctggtg ctggctgctt 53870
Claims (7)
- 에로모나스 살모니시다 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는, 자연으로부터 분리된 미오비리대 박테리오파지 Aer-SAP-2(수탁번호 KCTC 12909BP).
- 제1항의 박테리오파지 Aer-SAP-2(수탁번호 KCTC 12909BP)를 유효성분으로 포함하는, 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환 예방용 또는 치료용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 약욕제, 또는 사료첨가제 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는, 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환 예방용 또는 치료용 조성물.
- 제2항에 의한 박테리오파지 Aer-SAP-2(수탁번호 KCTC 12909BP)를 유효성분으로 포함하는 조성물에 사람을 제외한 동물을 담그는 처치를 실시하는 단계를 포함하는, 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 조성물이 약욕제 형태인 것을 특징으로 하는, 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
- 제2항에 의한 박테리오파지 Aer-SAP-2(수탁번호 KCTC 12909BP)를 유효성분으로 포함하는 조성물을 사람을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 조성물이 사료첨가제 형태인 것을 특징으로 하는, 에로모나스 살모니시다 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
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| KR1020170105842A KR101875565B1 (ko) | 2017-08-22 | 2017-08-22 | 신규한 에로모나스 살모니시다 박테리오파지 Ａｅｒ-ＳＡＰ-2 및 이의 에로모나스 살모니시다 균 증식 억제 용도 |
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| WO2019039781A3 (ko) * | 2017-08-22 | 2019-06-27 | 주식회사 인트론바이오테크놀로지 | 신규한 에로모나스 살모니시다 박테리오파지 ａｅｒ-ｓａｐ-2 및 이의 에로모나스 살모니시다 균 증식 억제 용도 |
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Citations (2)
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Patent Citations (2)
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| KR101329639B1 (ko) * | 2012-06-04 | 2013-11-14 | 주식회사 씨티씨바이오 | 신규한 파지 ａｓｐ-1 및 이의 아에로모나스 살모니시다 증식 억제 용도 |
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| WO2019039781A3 (ko) * | 2017-08-22 | 2019-06-27 | 주식회사 인트론바이오테크놀로지 | 신규한 에로모나스 살모니시다 박테리오파지 ａｅｒ-ｓａｐ-2 및 이의 에로모나스 살모니시다 균 증식 억제 용도 |
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Also Published As
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