WO2018236086A2 - 신규한 에로모나스 하이드로필라 박테리오파지 Aer-HYP-2 및 이의 에로모나스 하이드로필라 균 증식 억제 용도 - Google Patents

신규한 에로모나스 하이드로필라 박테리오파지 Aer-HYP-2 및 이의 에로모나스 하이드로필라 균 증식 억제 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for preventing or treating a disease caused by eromonas hydrofilm using a bacteriophage isolated from nature capable of killing eromonas hydrofilm by infection with eromonas hydrofilm and a composition containing the same as an effective ingredient And more particularly to a method of isolating Mio viridis versus bacteriophage Aer-HYP-2 isolated from nature, having the ability to kill eromonas hydrofilas and having the genome of SEQ ID NO: 1 No. KCTC 13258BP), and a method for preventing or treating a disease caused by eromonas hydrofilm using the composition comprising the bacteriophage as an active ingredient.
  • Aeromonas hydrophila belonging to the genus Eromonas is a motile gram-negative bacterium and widely distributed in river water and freshwater fish. It is widely used as aquatic organisms such as catfish, freshwater fish such as rainbow trout, It is well known as a cause of serious disease in fish.
  • the serotypes of eromonas hydrofilas include Thermo-stable (O antigen), Thermo-labile (K antigen), and Flagella (H antigen) And it is known that most of the pathogenic eromonas hydrofilas known to date have thermostable bacterial antigens.
  • Eromonas hydrofilas can cause aeromonas diseases such as motile aeromonas septicemia or skin ulcers in a variety of fishes and can cause massive deaths in severe cases It is a cause of significant economic loss in the aquaculture industry of freshwater fish. Therefore, it is urgent to develop a method that can be used to prevent infection of eromonas hydrofilas and further to treat infection.
  • Bacteriophage is a very small microorganism that infects bacteria, usually called phage.
  • the bacteriophage has the ability to kill bacterial cells by infecting the bacteria inside the cells after infecting the bacteria and destroying the cell wall of the host bacteria when the progeny bacteriophages come out of the bacteria after the proliferation.
  • the bacterium infection method of bacteriophage is highly specific, and the types of bacteriophages that can infect specific bacteria are limited to some.
  • certain bacteriophages can infect only a specific category of bacteria, and thus certain bacteriophages can provide an antibacterial effect only for certain bacteria. Due to the bacterium specificity of these bacteriophages, bacteriophage provides an antimicrobial effect only on the bacteria of interest and does not affect the environment or bacteria in the environment. Conventional antibiotics, which have been widely used for bacterial treatment, have simultaneously influenced several kinds of bacteria. This has caused problems such as environmental contamination and disturbance of normal flora of animals. In contrast, bacteriophages operate only on specific bacteria, so that the use of bacteriophages does not cause a total disturbance in the body. Therefore, the use of bacteriophage is very safe as compared with the use of antibiotics, and the possibility of side effects caused by use is relatively low.
  • Bacteriophage is a British bacteriologist Twort 1915 became discovered while conducting research on Staphylococcus aureus (Micrococcus) melting the colonies are transparent by any developer.
  • the French bacteriologist d'Herelle discovered that there was an effect of dissolving Shigella dysenteriae in the filtrate of heterozygous patients.
  • bacteriophage Due to the special ability to kill bacteria, bacteriophage has been expected to be effective as a countermeasure against bacterial infection since its discovery.
  • the discovery of penicillin by Fleming the spread of antibiotics has become common, and studies of bacteriophage have been limited to some Eastern European countries and the Soviet Union.
  • the limitations of existing antibiotics have appeared due to the increase of antibiotic resistant bacteria, and bacteriophages have been attracting attention as an anti - bacterial agent due to the possibility of development as a substitute for existing antibiotics.
  • bacteriophages are highly specific for bacteria. Because of the high specificity of these bacteriophages to bacteria, bacteriophages often exhibit antibacterial effects only on some strains, even if they belong to the same species (Species). In addition, the intensity of the antibacterial activity of bacteriophages exhibited according to the target bacterial strain may be different. For this reason, it is necessary to secure various kinds of useful bacteriophages in order to obtain an effective control method for a certain kind of bacteria.
  • the present inventors have developed a composition that can be used for the prevention or treatment of diseases caused by eromonas hydrofilm using bacteriophages isolated from nature capable of killing eromonas hydrofilm, and In an attempt to develop a method for preventing or treating a disease caused by eromonas hydrofilm using this composition, a suitable bacteriophage is isolated from nature, and the separated bacteriophage is distinguished from other bacteriophages to be identified. It is possible to develop a composition containing the bacteriophage as an effective ingredient after securing the sequence information of a genome and then effectively using the composition for the purpose of preventing or treating a disease caused by eromonas hydrofilm By checking, It was completed.
  • an object of the present invention is to provide a Myoviridae bacteriophage Aer-HYP-1 strain isolated from nature, which has the ability to specifically kill eromonas hydrofilm and has a genome represented by SEQ ID NO: 2 (accession number KCTC 13258BP).
  • the present invention relates to a microorganism isolated from nature, which has the ability to specifically kill eromonas hydrofilas and has a genome represented by SEQ. ID. NO. 1, ), And a method for preventing or treating a disease caused by eromonas hydrofilm using the composition containing the same as an active ingredient.
  • Bacteriophage Aer-HYP-2 was deposited with the Korean Resource Center for Biotechnology Research (KCTC 13258BP) on May 10, 2017, after being isolated by the present inventors.
  • the present invention also provides a bathing agent and a feed additive comprising bacteriophage Aer-HYP-2 as an active ingredient, which can be used for preventing or treating diseases caused by eromonas hydrofilm.
  • the composition of the present invention can be utilized for the purpose of preventing or treating diseases caused by eromonas hydrofilm.
  • &quot prevent " or " prophylaxis " refer to (i) prevention of infection of eromonas hydrofilas; And (ii) inhibiting development into diseases caused by eromonas hydrofilament infection.
  • " treatment " or " treatment " refers to (i) inhibition of a disease caused by eromonas hydrofilas; And (ii) alleviating the pathological condition of the disease caused by eromonas hydrofilas.
  • the terms “separate”, “isolated”, or “separated” refer to the separation of bacteriophages from the natural state using various experimental techniques and the securing of features that can identify the bacteriophages of the invention by distinguishing them from other bacteriophages
  • the present invention also includes propagating the bacteriophage of the present invention industrially so as to utilize it by biotechnology.
  • the pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the composition of the present invention are those conventionally used in the formulation and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, no.
  • the composition of the present invention may further contain lubricants, wetting agents, sweeteners, flavors, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc. in addition to the above components.
  • the composition of the present invention contains bacteriophage Aer-HYP-2 as an active ingredient.
  • the bacteriophage Aer-HYP-2 contained therein is contained at a concentration of 1 ⁇ 10 1 pfu / ml to 1 ⁇ 10 30 pfu / ml or 1 ⁇ 10 1 pfu / g to 1 ⁇ 10 30 pfu / g, 10 4 pfu / ml to 1 x 10 15 pfu / ml or 1 x 10 4 pfu / g to 1 x 10 15 pfu / g.
  • composition of the present invention may be prepared in a unit dose form by being formulated using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by those having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. It may be manufactured by inserting it into a multi-capacity container.
  • the formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.
  • the composition of the present invention may be embodied as a bathing agent and a feed additive, depending on the manner of application, but not limited thereto.
  • Bacteriophages capable of providing an antimicrobial activity against other bacterial species may be added to the composition of the present invention in order to increase efficiency in such a utilization purpose.
  • other kinds of bacteriophages having antimicrobial activity against eromonas hydrofilm can also be added. Even bacteriophages having antimicrobial activity against eromonas hydrofilaments are different from each other in terms of the strength of antimicrobial activity and the range of antimicrobial activity, so that a proper combination thereof can maximize the effect.
  • antibiotics when antibiotics are used, common endophytic bacteria are also harmed, resulting in a decrease in immunity of animals and various side effects due to their use.
  • bacteriophage is an antimicrobial agent that can be used for the antibacterial effect of bacteriophage against bacterial strains in terms of the strength of the antimicrobial activity or the antimicrobial range [the various strains belonging to eromonas hydro pilil species, The range in which activity is exercised.
  • bacteriophages can exhibit antibacterial activity against some bacterial strains belonging to the same species. In other words, even if belonging to the same bacterium species, there may be differences in susceptibility to bacteriophages depending on the individual bacterium. Therefore, the present invention provides a differential antibacterial effect compared to other bacteriophages having antimicrobial activity against eromonas hydro- Can be provided. This provides a big difference in its effectiveness when used in industrial settings.
  • 1 is an electron micrograph of bacteriophage Aer-HYP-2.
  • Fig. 2 shows the results of experiments showing the bacteriophage Aer-HYP-2 killing ability against eromonas hydrofilm. Based on the center line of the plate medium, only the buffer containing no bacteriophage Aer-HYP-2 is dispensed on the left side, and the solution containing the bacteriophage Aer-HYP-2 is dispensed on the right side. The transparent part observed on the right side is the result of the lysis of the bacteria to be tested by the action of bacteriophage Aer-HYP-2.
  • Example One Eromonas Hydropila Isolation of bacteriophage that can kill bacteria
  • erotic Pseudomonas dihydro pillar bacteria to 1 / 1,000 of the TSB (T ryptic S oy B roth) inoculated at a rate medium (Casein Digest, 17 g / L; Soy bean Digest, 3 g / L; deck Samples collected in a tube were added together at a concentration of 2.5 g / L; NaCl, 5 g / L; Dipotassium phosphate, 2.5 g / L), followed by shake culture at 25 DEG C for 3-4 hours. After incubation, the supernatant was recovered by centrifugation at 8,000 rpm for 20 minutes.
  • the recovered supernatant was inoculated with eromonas hydrofilm at a ratio of 1 / 1,000 and then shake-cultured again at 25 ° C for 3-4 hours.
  • this procedure was repeated five times in total so that the number of bacteriophages could be sufficiently increased.
  • the culture was centrifuged at 8,000 rpm for 20 minutes. After centrifugation, the recovered supernatant was filtered using a 0.45 ⁇ m filter. The presence of bacteriophages capable of killing eromonas hydrofilm was examined by a conventional spot assay using the thus obtained filtrate.
  • the above drop test was carried out as follows.
  • the TSB medium was inoculated with eromonas hydrofilm at a ratio of 1 / 1,000, and then cultured with shaking at 25 DEG C overnight.
  • TSA T ryptic S oy A gar
  • plate medium Casein Digest, 15 g / L; Soy bean digest, 5 g / L; NaCl, 5 g / L; agar, 15 g / L.
  • the smear medium was allowed to stand in a clean bench for about 30 minutes to allow the smear solution to dry.
  • Pure bacteriophage was isolated by using the filtrate which confirmed the existence of bacteriophage having killing ability against eromonas hydrofilas.
  • a usual plaque assay was used for the separation of pure bacteriophage. To elaborate this, one of the scavengers formed in the leavening assay was recovered using a sterilized tip, and then added to the culture medium of eromonas hydrofilm for incubation at 25 ° C. for 4-5 hours. After incubation, supernatant was obtained by centrifugation at 8,000 rpm for 20 minutes. To the obtained supernatant, a culture medium of eromonas hydrofilm was added at a volume of 1/50 and then again cultured at 25 ° C for 4-5 hours.
  • This procedure was performed at least 5 times to increase the number of bacteriophages, and finally the supernatant was obtained by centrifugation at 8,000 rpm for 20 minutes. The obtained supernatant was used for the analysis of the washing solution. Since the separation of the pure bacteriophage is not normally accomplished by only one step of the above procedure, the former step is repeated again with the use of the agitation blank formed at this time. This procedure was repeated at least five times to obtain a solution containing pure bacteriophage. The separation of pure bacteriophages was usually repeated until the size and shape of the formed lysate were all similar. Finally, it was confirmed by electron microscopic analysis whether the bacteriophage was purely isolated.
  • the solution containing pure bacteriophage identified in this way was subjected to the following purification procedure.
  • a culture medium of eromonas hydrofilm was added in a volume of one-half of the total volume of the solution, followed by culturing again for 4-5 hours. After incubation, supernatant was obtained by centrifugation at 8,000 rpm for 20 minutes. This process was repeated five times in total to obtain a solution containing a sufficient number of bacteriophages.
  • the supernatant obtained by the final centrifugation was filtered using a 0.45 ⁇ m filter, and then a conventional polyethylene glycol (PEG) precipitation process was performed.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEG and NaCl were added to 100 ml of the filtrate to make 10% PEG 8000 / 0.5 M NaCl, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for 2-3 hours, followed by centrifugation at 8,000 rpm for 30 minutes to obtain a bacteriophage precipitate .
  • precipitate bacteriophage buffer Buffer; 10 mM Tris-HCl , 10 mM MgSO 4, 0.1% Gelatin, pH 8.0
  • This is called a bacteriophage suspension or bacteriophage solution.
  • the bacteriophage thus purified was named Bacteriophage Aer-HYP-2 and deposited on May 10, 2017 at the BRC (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) (Accession No. KCTC 13258BP ).
  • Example 2 Bacteriophage Aer - HYP -2 genome sequencing and genome sequencing
  • the genomes of bacteriophage Aer-HYP-2 were isolated as follows.
  • the bacteriophage suspension obtained by the same method as in Example 1 was used.
  • 200 U of DNase I and 200 A of RNase A were added to 10 ml of the bacteriophage suspension to remove the DNA and RNA of eromonas hydrofilm, which may be contained in the supernatant, and then left at 37 ° C for 30 minutes.
  • 500 ⁇ l of 0.5 M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) was added to remove DNase I and RNase A activity, and the mixture was allowed to stand for another 10 minutes.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the upper layer was taken out of the separated layers, 1.5 parts by volume of isopropyl alcohol was added thereto, and the mixture was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes The dielectric was precipitated. After the precipitate was collected, 70% ethanol was added to the precipitate, and the precipitate was further washed by centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes. The washed precipitate was recovered, vacuum dried and dissolved in 100 ⁇ l of water. The above procedure was repeated to secure a large amount of the genome of the bacteriophage Aer-HYP-2.
  • the resulting genomes were sequenced using the illumina Mi-Seq instrument in Macrogen, and genome sequence information of bacteriophage Aer-HYP-2 was obtained.
  • the final analyzed bacteriophage Aer-HYP-2 genome has a size of 236,916 bp and the entire genomic sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • bacteriophage Aer-HYP-2 is a novel bacteriophage different from the previously reported bacteriophages.
  • bacteriophage Aer-HYP-2 can provide different antimicrobial effects from other bacteriophages reported from the fact that the different types of bacteriophages usually have different strengths and antimicrobial ranges that can be provided there was.
  • Example 3 Bacteriophage Aer - HYP -2 of Eromonas Hydropila For bacteria Destructiveness Research
  • the ability of the isolated bacteriophage Aer-HYP-2 to eromonas hydrofilas was examined. The extinction ability was investigated by examining whether or not a transparent ring was formed through the drip test as described in Example 1.
  • the eromonas hydrofilas strains used in the study of the killing activity were total 15 weeks, which were isolated by the present inventors and identified as eromonas hydrofilas.
  • Bacteriophage Aer-HYP-2 had the ability to kill for 14 weeks out of 15 of the experimental eromonas hydrofilas. Representative experimental results are shown in Fig.
  • the bacteriophage Aer-HYP-2 did not have the ability to kill these species.
  • the bacteriophage Aer-HYP-2 has excellent killing ability against eromonas hydrofilas and can exhibit antibacterial effect against many eromonas hydro pilas strains. This means that bacteriophage Aer-HYP-2 can be used as an active ingredient of a composition for the prevention or treatment of diseases caused by eromonas hydrofilas.
  • Example 4 Bacteriophage Aer - HYP -2 of Eromonas Hydropila For prevention of fungal infection Experimental Example
  • the bacteriophage Aer-HYP-2 of the present invention not only inhibited the growth of eromonas hydrofilm, but also had the ability to kill eromonas hydrofilm. From this, it was confirmed that bacteriophage Aer-HYP-2 Can be utilized as an effective ingredient of a composition for the prevention of diseases caused by eromonas hydrofilas.
  • Example 5 Bacteriophage Aer - HYP -2 Eromonas Hydropila Bacterium-induced Preventive Animal Test for Disease
  • Rainbow trout (average weight: 23.4 g, average length: 15.8 cm) was divided into two groups of 20 rats and separated for 14 days in a water tank. The ambient environment of the water tank was controlled, and the temperature of the laboratory with the water tank was kept constant. Feeds containing 1 ⁇ 10 8 pfu / g of bacteriophage Aer-HYP-2 were fed to the rainbow trout of the experimental group (bacteriophage-treated group) from the beginning of the experiment to the experimental period according to a conventional feed feeding method. On the other hand, the rainbow trout of the control group (bacteriophage MIT) received feeds of the same composition without bacteriophage Aer-HYP-2 in the same manner.
  • Body size ulcer size measurement (average) US score (mean) date D9 D10 D11 D12 D13 D14 Control group (female bacteriophage) 0.40 0.50 0.55 0.60 0.70 0.75 Experimental group (bacteriophage administration) 0.10 0 0 0 0 0 0
  • the bacteriophage Aer-HYP-2 of the present invention is very effective for the prevention of diseases caused by eromonas hydrofilm.
  • Example 6 Bacteriophage Aer - HYP -2 Eromonas Hydropila For diseases caused by bacteria Treatment example
  • the bacteriophage Aer-HYP-2 was included (1 ⁇ 10 8 / ml) for the three days after the feeding of the eromonas hydro- pfu / g) were fed according to a conventional feed feeding method.
  • the rainbow trout of the control group (bacteriophage MIT) received feeds of the same composition without bacteriophage Aer-HYP-2 in the same manner.
  • the incidence of infestation was examined in all test animals on a daily basis. Investigation of the incidence of eruption caused by eromonas hydrofilas was carried out by measuring the ulcer size of the body surface as in Example 5. The results are shown in Table 3.
  • Body size ulcer size measurement (average) US score (mean) date D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 Control group (female bacteriophage) 0.95 1.25 1.45 1.55 1.55 1.55 1.65 Experimental group (bacteriophage administration) 1.00 0.85 0.40 0.35 0.25 0.20 0.10
  • the bacteriophage Aer-HYP-2 of the present invention is very effective for the treatment of diseases caused by eromonas hydrofilm.
  • Bacteriophage Aer-HYP-2 solution was used to prepare a feed additive containing 1 ⁇ 10 8 pfu of bacteriophage Aer-HYP-2 per gram of feed additive.
  • the feed additives were prepared by adding maltodextrin to the bacteriophage solution (50%, w / v) followed by lyophilization. And finally pulverized into a fine powder form.
  • the drying process during the manufacturing process may be replaced by vacuum drying, warm drying, or drying at room temperature.
  • a feed additive without bacteriophage was also prepared by using the buffer (Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO 4 , 0.1% Gelatin, pH 8.0) used in the preparation of the bacteriophage solution instead of the bacteriophage .
  • Buffer 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO 4 , 0.1% Gelatin, pH 8.0
  • Each of the two feed additives was mixed with a 250 - fold amount of raw fish to produce two final feeds.
  • the bath preparation was prepared as follows. Bacteriophage Aer-HYP-2 solution was used to prepare a bathing agent so that 1 ⁇ 10 8 pfu of bacteriophage Aer-HYP-2 per 1 ml of bath was contained.
  • the manufacturing method of the bathing agent is such that the above bacteriophage Aer-HYP-2 solution is added so as to include 1 ⁇ 10 8 pfu of bacteriophage Aer-HYP-2 per 1 ml of the buffer used for producing the bacteriophage solution, Respectively.
  • the buffer solution used in the preparation of the bacteriophage solution was used as the non-bacteriophage-free bath solution.
  • the two bath preparations thus prepared were diluted with water at a volume ratio of 1,000 times and used as a final bathing agent.
  • Example 7 and Example 8 Using the feeds prepared in Example 7 and Example 8, and a bathing agent, the improvement of the specification results in rainbow trout breeding was investigated. In particular, the survey was conducted in terms of mortality.
  • a total of 400 rainbow trout were divided into two groups of 200 birds (Group A, feed-fed group A, and group B, which was treated with bath) for four weeks. Each group was subdivided into small groups consisting of 100 animals. Each subgroup was divided into small group (1) with bacteriophage Aer-HYP-2 and small group (2) without bacteriophage.
  • the rainbow trout, which was subject to the test was a 5 - week - old rainbow trout (average weight: 23.8 g, average length: 15.9 cm).
  • Rainbow trout of each test group were kept in separate tanks at regular intervals. Each subgroup is identified and named as shown in Table 4 below.
  • Subgroup classification and display in the rainbow trout specimen test apply Classification and display of small groups
  • Example 7 In the case of feed feed, the feed prepared in Example 7 was fed according to a conventional feed feeding method according to the classification of Table 4, and in the case of the bath treatment, the feed prepared in accordance with the preparation method of bath preparation described in Example 8 A bath agent was treated according to a conventional bath bath treatment method in which a fish body was immersed in a diluting solution of a bath agent according to Table 4. The results are shown in Table 5.

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Abstract

본 발명은 에로모나스 하이드로필라 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대 박테리오파지 Aer-HYP-2(수탁번호 KCTC 13258BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 에로모나스 하이드로필라 박테리오파지 Aer-HYP-2 및 이의 에로모나스 하이드로필라 균 증식 억제 용도
본 발명은 에로모나스 하이드로필라 균에 감염하여 에로모나스 하이드로필라 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리한 박테리오파지 및 이를 유효성분으로 포함한 조성물을 이용한 에로모나스 하이드로필라 균에 의해서 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 에로모나스 하이드로필라 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대 박테리오파지 Aer-HYP-2(수탁번호 KCTC 13258BP), 및 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
에로모나스 속(Genus)에 속하는 에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 균은 운동성 그람음성 간균이며, 하천수나 담수어에 널리 분포하는 수계 상재균으로서 주로 메기, 무지개 송어와 같은 담수 어류 또는 비단 잉어와 같은 관상용 어류에 심각한 질병을 야기하는 원인균으로 잘 알려져 있다. 에로모나스 하이드로필라 균의 항원형(Serotype)으로는 열 안정성 균체항원(Thermo-stable, O antigen), 열 불안정 협막항원(Thermo-labile, K antigen), 및 편모항원(Flagella, H antigen)이 있는 것으로 알려져 있으며, 현재까지 알려진 병원성 에로모나스 하이드로필라 균의 대부분은 열 안정성 균체항원을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.
에로모나스 하이드로필라 균은 다양한 어류에서 운동성 에로모나스 패혈증(Motile Aeromonas Septicemia)이나 피부 궤양(Ulcer) 등과 같은 에로모나스 질병(Aeromonas diseases)을 유발하기도 하며, 정도가 심각한 경우에는 집단 폐사를 야기 시킬 수 있어서 담수 어류의 양식 산업에서 중요한 경제적 손실의 원인이 되고 있다. 따라서 에로모나스 하이드로필라 균 감염을 예방하고 나아가 감염 처치에까지 활용될 수 있는 방안의 개발이 절실한 실정이다.
에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환의 예방이나 치료 목적으로 다양한 항생제들이 사용되어 왔으나 최근 이들 항생제들에 대한 내성균의 발생이 증가함에 따라 항생제 외의 다른 방안의 확보가 시급한 실정이다.
최근 세균성 감염질환의 대처 방안으로 박테리오파지(Bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 항생제 내성균에 대한 우수한 항균력 때문에 더욱 큰 관심을 받고 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(Phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 세균에 감염(Infection)한 후에 세균의 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 세균 밖으로 나올 때 숙주인 세균의 세포벽을 파괴하는 방식으로 세균을 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 세균 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 세균에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 세균에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 항균효과를 제공할 수 있다. 이러한 박테리오파지의 세균 특이성으로 인하여 박테리오파지는 대상으로 하는 세균에 대해서만 항균효과를 제공하고 환경이나 동물 내의 상재균들에는 영향을 초래하지 않는다. 통상적으로 세균 처치에 널리 활용되던 기존의 항생제들은 여러 종류의 세균들에 대하여 동시에 영향을 끼쳤다. 이로 인하여 환경오염이나 동물의 정상 세균총 교란 등의 문제를 초래하였다. 이와는 달리 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 작동하므로 박테리오파지 사용에 의해서 체내 정상균총 교란 등이 발생하지 않는다. 따라서 박테리오파지 사용이 항생제 사용에 비교하여 매우 안전하다고 할 수 있고, 그 만큼 사용에 의한 부작용 초래 가능성이 상대적으로 크게 낮다.
박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구를 수행하면서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella dysenteriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원성 세균에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다.
세균을 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후부터 세균 감염에 대응하는 효과적 방안으로 기대를 모았으며 관련하여 많은 연구들이 있었다. 그러나 Fleming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 발생 증가로 인하여 기존 항생제의 한계성이 나타나고, 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-세균제로 주목을 받고 있다.
앞에서 설명했듯이 박테리오파지는 세균에 대한 특이성이 매우 높다. 이러한 박테리오파지의 세균에 대한 높은 특이성으로 인하여 박테리오파지는 동일 종(Species)에 속하는 세균들이라 할지라도 그 일부 주(Strain)에 대해서만 항균효과를 발휘하는 경우가 많다. 또한 대상 세균 주에 따라 발휘되는 박테리오파지의 항균력 세기 자체도 다를 수 있다. 이러한 이유로 특정 종류의 세균에 대하여 효과적 제어법을 확보하려면 다양한 종류의 유용 박테리오파지들의 확보가 필요하다. 에로모나스 하이드로필라 균에 대응하여 효과적인 박테리오파지 활용법을 개발하기 위해서도 당연히 에로모나스 하이드로필라 균에 대하여 항균효과를 제공할 수 있는 여러 종류의 다양한 박테리오파지들의 확보가 필요하고, 더 나아가 확보한 다양한 유용 박테리오파지들 중에서 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 비교우위에 있는 박테리오파지의 선발 활용도 필요하다.
이에, 본 발명자들은 에로모나스 하이드로필라 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 이용하여 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 데에 활용될 수 있는 조성물을 개발하고, 또 이 조성물을 이용하여 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 개발하고자 노력한 끝에, 이에 적합한 박테리오파지를 자연으로부터 분리하고, 이 분리된 박테리오파지를 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있도록 유전체(Genome)의 서열 정보를 확보한 후에 상기 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 개발한 다음에 이 조성물이 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 에로모나스 하이드로필라 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대(Myoviridae) 박테리오파지 Aer-HYP-2(수탁번호 KCTC 13258BP)를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 에로모나스 하이드로필라 균에 감염하여 에로모나스 하이드로필라 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Aer-HYP-2(수탁번호 KCTC 13258BP)를 유효성분으로 포함하는 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 활용 가능한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 에로모나스 하이드로필라 균에 감염하여 에로모나스 하이드로필라 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Aer-HYP-2(수탁번호 KCTC 13258BP)를 유효성분으로 포함하는 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 활용 가능한 조성물을 이용한 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 사용되는 약욕제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료를 통한 사양 효과 제공 목적의 사료첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명은 에로모나스 하이드로필라 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대 박테리오파지 Aer-HYP-2(수탁번호 KCTC 13258BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
박테리오파지 Aer-HYP-2는 본 발명자들에 의해 분리된 후에 2017년 5월 10일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 13258BP).
또한, 본 발명은 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 데에 활용될 수 있는 박테리오파지 Aer-HYP-2를 유효성분으로 포함하는 약욕제 및 사료첨가제를 제공한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지 Aer-HYP-2는 에로모나스 하이드로필라 균을 효과적으로 사멸시키므로 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환의 예방(감염 방지)이나 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 또는 치료 목적으로 활용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 “방지” 또는 “예방”이라는 용어는 (i) 에로모나스 하이드로필라 균의 감염 방지; 및 (ii) 에로모나스 하이드로필라 균 감염에 의한 질병으로의 발전을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 (i) 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ii) 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발된 질환의 병적상태를 경감시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서의 “분리”, “분리한” 또는 “분리된”은 자연 상태로부터 여러 실험 기법을 활용하여 박테리오파지를 분리하는 것과 타 박테리오파지와 구별하여 본 발명의 박테리오파지를 특정 지을 수 있는 특징을 확보하는 일을 지칭하며, 이에 더하여 생물공학기술로 본 발명의 박테리오파지를 산업적으로 활용할 수 있게끔 증식시키는 것도 포함한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 박테리오파지 Aer-HYP-2가 유효성분으로 포함된다. 이때 포함되는 박테리오파지 Aer-HYP-2는 1× 101 pfu/㎖ 내지 1× 1030 pfu/㎖ 또는 1× 101 pfu/g 내지 1× 1030 pfu/g로 포함되며, 바람직하게는 1× 104 pfu/㎖ 내지 1× 1015 pfu/㎖ 또는 1× 104 pfu/g 내지 1× 1015 pfu/g로 포함된다.
본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만 약욕제 및 사료첨가제로 구현될 수 있다. 이러한 활용 목적에서의 효율성을 높이기 위하여 다른 세균종에 대하여 항균활성을 제공할 수 있는 박테리오파지들이 본 발명의 조성물에 추가될 수 있다. 또한, 에로모나스 하이드로필라 균에 대하여 항균활성을 갖는 다른 종류의 박테리오파지들도 추가될 수 있다. 에로모나스 하이드로필라 균에 대하여 항균활성을 갖는 박테리오파지라 하더라도 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 서로 간에 차이가 있으므로 이들의 적절한 조합은 그 효과를 극대화 할 수 있다.
본 발명의 박테리오파지 Aer-HYP-2를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법은 기존의 항생제 등에 기반을 둔 방식에 비하여 에로모나스 하이드로필라 균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 사용할 수 있음을 의미하며, 이의 사용에 따른 부작용이 매우 적다는 것을 의미한다. 통상적으로 항생제 등을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 동물의 면역력 저하 등을 초래시켜 사용에 따른 다양한 부작용이 나타난다. 한편, 박테리오파지는 항균활성을 발휘할 수 있는 세균종이 같다 하더라도 항균효과 발휘에 있어 항균력의 세기나 항균범위[에로모나스 하이드로필라 균종에 속하는 여러 세균 주(Strain)의 측면에서 개별 세균 주에 대하여 박테리오파지의 항균활성이 발휘되는 범위. 통상적으로 박테리오파지는 같은 세균 종(Species)에 속하는 일부 세균 주(Strain)에 대하여 항균활성을 발휘할 수 있음. 즉, 같은 세균 종에 속한다 하더라도 개별 세균 주에 따라 박테리오파지에 대한 감수성에서 차이가 있을 수 있음] 측면에서 차이가 있으므로 본 발명은 에로모나스 하이드로필라 균에 대한 항균력을 갖는 타 박테리오파지에 비교하여 차별적 항균효과를 제공할 수 있다. 이는 산업현장 활용 시에 그 효과에 있어 큰 차이를 제공한다.
도 1은 박테리오파지 Aer-HYP-2의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 Aer-HYP-2의 에로모나스 하이드로필라 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다. 평판배지의 가운데 선을 기준으로 왼쪽은 박테리오파지 Aer-HYP-2가 포함되지 않은 완충액(Buffer)만을 점적한 것이고, 오른쪽은 박테리오파지 Aer-HYP-2가 포함된 액을 점적한 것이다. 오른쪽에서 관찰되는 투명한 부분은 시험대상 세균이 박테리오파지 Aer-HYP-2의 작용에 의하여 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 에로모나스 하이드로필라 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리
에로모나스 하이드로필라 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리에는 자연 환경으로부터 확보된 시료들을 이용하였다. 한편, 박테리오파지 분리에 사용된 에로모나스 하이드로필라 균주들은 본 발명자들에 의해 미리 분리되어 에로모나스 하이드로필라 균으로 동정(Identification)된 것들이다.
박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 에로모나스 하이드로필라 균을 1/1,000 비율로 접종한 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/L; 소이빈 다이제스트, 3 g/L; 덱스트로스, 2.5 g/L; NaCl, 5 g/L; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/L)에 수집된 시료를 함께 첨가한 다음 25℃에서 3-4시간동안 진탕배양 하였다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 에로모나스 하이드로필라 균을 1/1,000 비율로 접종한 다음 25℃에서 3-4시간 동안 또 다시 진탕배양 하였다. 박테리오파지가 시료에 포함되어 있었을 경우에는 박테리오파지의 수(Titer)가 충분히 증가될 수 있도록 이러한 과정을 총 5회 반복 실시하였다. 5회 반복 실시 후에 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 회수된 상등액에 대하여 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과를 실시해 주었다. 이렇게 하여 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(Spot assay)을 통하여 에로모나스 하이드로필라 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사하였다.
상기 점적 실험은 다음과 같이 실시되었다. TSB 배지에 에로모나스 하이드로필라 균을 1/1,000 비율로 접종한 다음 25℃에서 한밤동안 진탕배양 하였다. 이렇게 하여 준비된 에로모나스 하이드로필라 균의 배양액 3 ㎖(OD600이 1.5)을 TSA(Tryptic Soy Agar) 평판배지(카제인 다이제스트, 15 g/L; 소이빈 다이제스트, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(Spreading)하였다. 도말한 평판 배지를 클린벤치(Clean bench)에서 약 30분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 하였다. 건조 후 앞에서 준비한 여과액 10 μl를 에로모나스 하이드로필라 균이 도말된 평판 배지 위에 점적하였다. 이를 30분 정도 방치하여 건조시켰다. 건조 후 점적한 평판 배지를 25℃에서 하루 동안 정치 배양한 다음 여과액이 떨어진 위치에 투명환(Clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 에로모나스 하이드로필라 균을 사멸 시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 에로모나스 하이드로필라 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있었다.
에로모나스 하이드로필라 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하였다. 순수 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(Plaque assay)을 이용하였다. 이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음에 이를 에로모나스 하이드로필라 균의 배양액에 첨가해 주어 4-5시간 동안 25℃에서 함께 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 에로모나스 하이드로필라 균의 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 25℃에서 4-5시간 동안 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음에 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하였다. 통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회만으로는 달성되지 않기 때문에 이때 형성된 용균반을 이용하여 앞 단계를 전체적으로 다시 반복하였다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 반복 실시하여 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보하였다. 통상적으로 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복 수행하였다. 그리고 최종적으로는 전자현미경 분석을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인하였다. 전자현미경 분석에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 설명한 과정을 반복하였다. 전자현미경 분석은 통상의 방법에 따라 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(Copper grid)에 묻히고 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(Negative staining)과 건조를 수행한 후에 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 관찰하였다. 순수 분리한 박테리오파지의 전자현미경 사진이 도 1에 제시되어 있다. 형태적 특징으로 판단할 때, 신규 확보된 박테리오파지는 미오비리대(Myoviridae) 박테리오파지에 속함을 확인할 수 있었다.
이런 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제 과정을 거쳤다. 순수 박테리오파지를 포함한 용액에 용액 전체 부피의 50분의 1의 부피로 에로모나스 하이드로필라 균의 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 4-5시간 동안 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 충분한 수의 박테리오파지가 포함된 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과한 다음에 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol; PEG) 침전 과정을 실시하였다. 구체적으로, 여과액 100 ㎖에 10% PEG 8000/0.5 M NaCl이 되게 PEG와 NaCl을 첨가한 다음에 4℃에서 2-3시간 동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0) 5 ㎖로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.
상기 과정을 통하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 Aer-HYP-2로 명명한 뒤, 2017년 5월 10일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 13258BP).
실시예 2: 박테리오파지 Aer - HYP -2의 유전체 분리 및 유전체 서열 분석
박테리오파지 Aer-HYP-2의 유전체를 다음과 같이 분리하였다. 유전체 분리에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 부유액을 이용하였다. 먼저 부유액에 포함되어 있을 수 있는 에로모나스 하이드로필라 균의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ㎖에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음에 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 10분간 정치시켰다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음에 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K(20 ㎎/㎖) 100 μl를 첨가한 후에 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(Sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(Phenol) : 클로로포름(Chloroform) : 이소아밀알코올(Isoamylalcohol)의 혼합액 10 ㎖을 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음에 분리된 층들 중에서 위층을 취하여 여기에 1.5 부피비의 아이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol)을 첨가한 다음에 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 유전체를 침전시켰다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(Ethanol)을 첨가한 다음에 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물의 세척을 실시하였다. 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음에 이를 100 μl의 물에 녹였다. 상기 과정을 반복하여 박테리오파지 Aer-HYP-2의 유전체를 다량 확보하였다.
이렇게 얻어진 유전체는 마크로젠에서 illumina Mi-Seq 기기를 이용하여 차세대염기서열 분석(Next generation sequencing analysis)을 수행한 다음 박테리오파지 Aer-HYP-2의 유전체 서열 정보를 확보하였다. 최종적으로 분석된 박테리오파지 Aer-HYP-2 유전체는 236,916 bp의 크기를 가지며, 전체 유전체 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다.
확보된 박테리오파지 Aer-HYP-2의 유전체 서열 정보를 기반으로 Web상의 BLAST를 이용하여 기존에 알려진 박테리오파지 유전체 서열과의 상동성(Similarity)을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 50% 이상의 상동성을 가진 박테리오파지 서열은 확인할 수 없었다.
이러한 사실에 근거하여 박테리오파지 Aer-HYP-2는 기존 보고된 박테리오파지들과는 다른 신규한 박테리오파지라 결론지을 수 있었다. 이러한 사실과 함께 통상적으로 박테리오파지의 종류가 다르면 제공할 수 있는 항균력의 세기 및 항균범위가 다르다는 사실로부터 박테리오파지 Aer-HYP-2는 기존에 보고된 다른 박테리오파지들과는 다른 항균효과를 제공해 줄 수 있다고 판단할 수 있었다.
실시예 3: 박테리오파지 Aer - HYP -2의 에로모나스 하이드로필라 균에 대한 사멸능 조사
분리된 박테리오파지 Aer-HYP-2의 에로모나스 하이드로필라 균에 대한 사멸능을 조사하였다. 사멸능 조사는 실시예 1에서 제시한 점적 실험을 통하여 투명환 생성 여부를 조사하는 방식으로 수행하였다. 사멸능 조사에 사용되어진 에로모나스 하이드로필라 균주들은 본 발명자들에 의해 분리되어 에로모나스 하이드로필라 균으로 동정된 것들로 총 15주였다. 박테리오파지 Aer-HYP-2는 실험에 대상이 된 에로모나스 하이드로필라 15주 중에 총 14주에 대하여 사멸능을 갖고 있었다. 대표적 실험 결과가 도 2에 제시되어 있다. 한편, 박테리오파지 Aer-HYP-2의 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 비브리오 안길라룸(Vibrio anguillarum), 비브리오 익티오엔테리(Vibrio ichthyoenteri), 락토코커스 가르비에(Lactococcus garvieae), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 및 에로모나스 살모니시다 (Aeromonas salmonicida)에 대한 사멸능 조사도 실시하였는데, 결과로 박테리오파지 Aer-HYP-2는 이들 균종들에 대해서는 사멸능을 갖고 있지 않았다.
이상의 결과로 박테리오파지 Aer-HYP-2는 에로모나스 하이드로필라 균에 대하여 우수한 사멸능을 가지며, 다수의 에로모나스 하이드로필라 균주들에 대하여 항균 효과를 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 박테리오파지 Aer-HYP-2가 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 또는 치료 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 의미한다.
실시예 4: 박테리오파지 Aer - HYP -2의 에로모나스 하이드로필라 균 감염 예방에 대한 실험예
9 ㎖의 TSB 배지를 담은 하나의 튜브에 1× 108 pfu/㎖ 수준의 박테리오파지 Aer-HYP-2 액 100 μl를 넣어주고, 다른 하나의 9 ㎖의 TSB 배지를 담은 튜브에는 동량의 TSB 배지만을 추가로 첨가하였다. 그 다음에 각 튜브에 600 nm에서 흡광도가 약 0.5 정도가 되도록 에로모나스 하이드로필라 균의 배양액을 넣어 주었다. 에로모나스 하이드로필라 균을 첨가한 후 튜브들을 25℃의 배양기에 옮겨 진탕배양하면서 에로모나스 하이드로필라 균의 성장 상태를 관찰하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 박테리오파지 Aer-HYP-2 액을 첨가해 준 튜브에서는 에로모나스 하이드로필라 균의 성장 억제가 관찰된 반면에 박테리오파지 액을 첨가하지 않은 튜브에서는 에로모나스 하이드로필라 균의 성장 억제가 관찰되지 않았다.
에로모나스 하이드로필라 균의 성장 억제
구분 OD600 흡광도 값
배양 0분 배양후 60분 배양후 120분
박테리오파지 액 미첨가 0.50 1.02 1.64
박테리오파지 액 첨가 0.50 0.25 0.16
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Aer-HYP-2가 에로모나스 하이드로필라 균의 성장을 저해할 뿐만 아니라 에로모나스 하이드로필라 균의 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 박테리오파지 Aer-HYP-2가 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방하는 목적의 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다고 결론지을 수 있었다.
실시예 5: 박테리오파지 Aer - HYP -2를 이용한 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 동물시험
무지개 송어(평균체중: 23.4 g, 평균체장: 15.8 cm) 20마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후 수조에서 분리 사육하면서 14일간 실험을 실시하였다. 수조의 주위환경은 통제하였고, 수조가 있는 실험실의 온도는 일정하게 유지시켰다. 실험 개시일로부터 시험 전기간 동안에 걸쳐 실험군(박테리오파지 투여군)의 무지개 송어들에게는 1× 108 pfu/g의 박테리오파지 Aer-HYP-2를 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미투여군)의 무지개 송어들에게는 박테리오파지 Aer-HYP-2가 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 시험개시일로부터 7일째가 되는 날부터 2일간 1× 108 cfu/g 수준으로 에로모나스 하이드로필라 균을 급이하는 사료에 포함시켜 하루 2회씩 급이하여 에로모나스 하이드로필라 균 감염을 유도하였다. 시험 개시일로부터 9일째가 되는 날(에로모나스 하이드로필라 균 감염 유도 후 2일째)부터는 매일 모든 시험동물들을 대상으로 절창병 발생 상태를 조사하였다. 절창병 발생 상태 조사는 체표의 궤양 크기를 측정하는 방식으로 실시하였다. 체표의 궤양 크기 측정은 통상 사용되는 Ulcer size(US) score{정상(궤양 없음): 0, 약한 궤양(궤양 크기: 0.5 cm 미만): 1, 강한 궤양(궤양 크기: 0.5 cm 이상): 2}를 측정하는 방식으로 실시하였다. 그 결과는 표 2와 같았다.
체표 궤양 크기 측정 결과 (평균치)
US score(mean)
날짜 D9 D10 D11 D12 D13 D14
대조군(박테리오파지 미투여) 0.40 0.50 0.55 0.60 0.70 0.75
실험군(박테리오파지 투여) 0.10 0 0 0 0 0
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Aer-HYP-2가 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환의 예방에 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 박테리오파지 Aer - HYP -2를 이용한 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환에 대한 치료예
박테리오파지 Aer-HYP-2의 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환에 대한 치료 효과를 조사해 보았다. 무지개 송어(평균체중: 23.6 g, 평균체장: 15.8 cm) 40마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후 수조에서 분리 사육하면서 14일간 실험을 실시하였다. 수조의 주위환경은 통제하였고, 수조가 있는 실험실의 온도는 일정하게 유지시켰다. 실험 개시일로부터 5일째 되는 날부터 3일간 1× 108 cfu/g 수준으로 에로모나스 하이드로필라 균이 오염된 사료를 하루 2회씩 통상적인 사료 급이 방식으로 급이하였다. 에로모나스 하이드로필라 균이 오염된 사료 급이 마지막 날부터 절창병의 임상증상을 보이는 개체가 두 수조 모두에서 확인되었다. 3일간의 에로모나스 하이드로필라 균이 오염된 사료 급이 시행 다음날(시험 개시일로부터 8일째가 되는 날)부터 실험군(박테리오파지 투여군)의 무지개 송어들에게는 박테리오파지 Aer-HYP-2를 포함(1× 108 pfu/g)하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미투여군)의 무지개 송어들에게는 박테리오파지 Aer-HYP-2가 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 에로모나스 하이드로필라 균의 강제감염 후부터 3일째가 되는 날(시험 개시 8일째)부터는 매일 모든 시험동물들을 대상으로 절창병 발생 상태를 조사하였다. 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 절창병 발생 상태 조사는 실시예 5에서와 같이 체표의 궤양 크기를 측정하는 방식으로 실시하였다. 그 결과는 표 3과 같았다.
체표 궤양 크기 측정 결과 (평균치)
US score(mean)
날짜 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14
대조군(박테리오파지 미투여) 0.95 1.25 1.45 1.55 1.55 1.55 1.65
실험군(박테리오파지 투여) 1.00 0.85 0.40 0.35 0.25 0.20 0.10
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Aer-HYP-2가 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환의 치료에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 사료첨가제 및 사료의 제조
박테리오파지 Aer-HYP-2 액을 이용하여 사료첨가제 1 g당 1× 108 pfu의 박테리오파지 Aer-HYP-2가 포함되도록 사료첨가제를 제조하였다. 사료첨가제의 제조 방법은 박테리오파지 액에 말토덱스트린을 첨가(50%, w/v)한 다음에 동결 건조시켜 제조하였다. 최종적으로 고운 가루형태로 분쇄하였다. 상기 제조과정 중의 건조 과정에는 감압 건조, 가온 건조, 상온 건조도 대체 가능하다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 사료첨가제도 박테리오파지 액 대신에 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0)을 사용하는 방식으로 제조하였다.
이렇게 제조된 2종의 사료첨가제 각각을 중량비로 250배의 양어용 생사료와 혼합하여 최종 2종의 사료를 제조하였다.
실시예 8: 약욕제의 제조
약욕제는 다음과 같이 제조하였다. 박테리오파지 Aer-HYP-2 액을 이용하여 약욕제 1 ㎖ 당 1× 108 pfu의 박테리오파지 Aer-HYP-2가 포함되도록 약욕제를 제조하였다. 약욕제의 제조 방법은 박테리오파지 액 제조 시에 사용하는 완충액 1 ㎖ 당 1× 108 pfu의 박테리오파지 Aer-HYP-2가 포함되도록 상기 박테리오파지 Aer-HYP-2 액을 첨가하여 잘 혼합해 주는 방식으로 제조하였다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 약욕제로는 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액 자체를 그대로 사용하였다.
이렇게 제조된 2종의 약욕제는 부피비로 1,000배의 물로 희석하여 최종적인 약욕제로 사용하였다.
실시예 9: 무지개 송어 사육에서의 사양 효과 확인
실시예 7 및 실시예 8에서 제조한 사료, 및 약욕제를 이용하여 무지개 송어 사육 시의 사양 결과 개선 여부에 대하여 조사해 보았다. 특히 본 조사는 폐사율 관점에서 실시되었다. 총 400 마리의 무지개 송어를 200 마리씩 한 그룹으로 총 2개 그룹(사료로 급이한 그룹-A; 약욕제로 처치한 그룹-B)으로 나누어 4주간 시험을 실시하였다. 각 그룹은 다시 100마리씩으로 구성되는 소그룹으로 나누어지며 각 소그룹은 박테리오파지 Aer-HYP-2가 적용된 소그룹(소그룹-①) 및 박테리오파지가 적용되지 않은 소그룹(소그룹-②)으로 나누었다. 본 시험에 대상이 된 무지개 송어는 5주령의 무지개 송어(평균체중: 23.8 g, 평균체장: 15.9 cm)였으며, 각 시험 소그룹의 무지개 송어는 일정 간격을 두고 위치한 격리된 각각의 수조에서 사육되었다. 각 소그룹은 다음의 표 4와 같이 구분되고 지칭되었다.
무지개 송어 사양 시험에서의 소그룹 구분 및 표시
적용 소그룹 구분 및 표시
박테리오파지 Aer-HYP-2 적용 박테리오파지가 적용되지 않음
사료로 급이한 그룹 A-① A-②
약욕제로 처치한 그룹 B-① B-②
사료 급이의 경우에는 실시예 7에서 제조한 사료를 표 4의 구분에 따라 통상적인 사료 급이 방식을 따라 급이 하였으며, 약욕제 처치의 경우에는 실시예 8에서 설명한 약욕제 제조 방식에 따라 제조한 약욕제를 표 4의 구분에 따라 약욕제의 희석액에 어체를 담그는 방식으로 실시하는 통상적인 약욕제 처치 방식에 따라 처치하였다. 그 결과는 표 5와 같았다.
무지개 송어 사양 시험에서의 폐사율
그룹 폐사개체수/시험개체수 폐사율(%)
A-① 4/100 4.0
A-② 13/100 13.0
B-① 5/100 5.0
B-② 17/100 17.0
이상의 결과로 본 발명에 따라 제조된 사료의 급이와 본 발명에 따른 약욕제의 처치가 무지개 송어 사육에서의 폐사율 감소에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 조성물의 적용이 무지개 송어의 사양 결과 개선에 효과적이라는 결론을 내릴 수 있었다.
이상의 결과로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[수탁번호]
기탁기관명: KCTC
수탁번호: KCTC 13258BP
수탁일자: 20170510
Figure PCTKR2018006575-appb-I000001

Claims (7)

  1. 에로모나스 하이드로필라 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는, 자연으로부터 분리된 미오비리대 박테리오파지 Aer-HYP-2(수탁번호 KCTC 13258BP).
  2. 제1항의 박테리오파지 Aer-HYP-2(수탁번호 KCTC 13258BP)를 유효성분으로 포함하는, 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환 예방용 또는 치료용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 약욕제, 또는 사료첨가제 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는, 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환 예방용 또는 치료용 조성물.
  4. 제2항에 의한 박테리오파지 Aer-HYP-2(수탁번호 KCTC 13258BP)를 유효성분으로 포함하는 조성물에 사람을 제외한 동물을 담그는 처치를 실시하는 단계를 포함하는, 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물이 약욕제 형태인 것을 특징으로 하는, 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  6. 제2항에 의한 박테리오파지 Aer-HYP-2(수탁번호 KCTC 13258BP)를 유효성분으로 포함하는 조성물을 사람을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조성물이 사료첨가제 형태인 것을 특징으로 하는, 에로모나스 하이드로필라 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
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