CN113215111B - 一种噬菌体及在防治肉鸡心内膜炎中的医用用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种噬菌体及在防治肉鸡心内膜炎中的医用用途，以耐久肠球菌为宿主菌分离的新噬菌体，保藏名为：耐久肠球菌噬菌体vB_EduS_BLT01；Enterococcus durans phage vB_EduS_BLT01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020715；可以感染、杀灭耐久肠球菌，能够控制耐久肠球菌感染及其引发的肉鸡心内膜炎，用于制备防治肉鸡心内膜炎的药物，具有疗效显著，方便实用等特点。

Description

一种噬菌体及在防治肉鸡心内膜炎中的医用用途

技术领域

本发明公开了一种噬菌体，为一株新的耐久肠球菌噬菌体vB_ EduS_BLT01，该噬菌体可控制耐久肠球菌感染及其引发肉鸡心内膜炎，制备防治肉鸡心内膜炎药物，属于生物工程技术领域。

背景技术

耐久肠球菌（Enterococcus durans）是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，菌体球形或卵圆形，常成对，成串出现，菌落较小，圆形凸起，有光泽。耐久肠球菌(Enterococcusdurans)隶属于硬杆菌门,杆菌纲,乳酸杆菌目,肠球菌科,肠球菌属。该菌是动物肠道微生物的重要组分,且常见于发酵食品,如酸奶和奶酪中。来源不同的耐久肠球菌具有不同的生物学特性和生理功能。例如,黄坚等从牦牛发酵酸奶中筛选到耐久肠球菌SWUN5857菌株,发现该菌株能够适应小鼠胃肠环境,有效提高小鼠体质量,促进小鼠胸腺和脾脏发育,增强小鼠免疫功能。LIU等从内蒙古天然发酵奶油中分离到耐久肠球菌KLDS6.0930菌株,该菌则具有耐胆盐,吸收胆固醇等作用。YANAGIDA等从土壤中分离出一株耐久肠球菌L28-1产生的细菌素可以抑制一些革兰氏阳性菌的生长，有潜力被用作一种新的食品防腐剂。Ramakrishnan研究发现耐久肠球菌NCIM5427在30°C和pH值 4.6的条件下能够产生酸性脂肪酶，有用在家禽生产中的潜力，并且由于现阶段的家禽生产非常容易受到如大肠杆菌、沙门氏菌等病原微生物的感染从而造成经济损失，这使得益生菌的添加应用具有广阔的应用前景。耐久肠球菌较少引起临床感染，但Francisca C等在荷兰肉鸡养殖场中发现由耐久肠球菌引起心内膜炎的情况。心内膜炎是指由病原微生物直接侵袭心内膜而引起的一种炎症性疾病。瓣膜为最常受累部位，但感染可发生在室间隔缺损部位、腱索和心壁内膜。由于肠球菌为鸡正常肠道菌群中的一部分,目前没有对耐久肠球菌引起的肉鸡心内膜炎的相关治疗。

噬菌体（phage）是侵袭细菌的病毒，也是赋予宿主菌生物学性状的遗传物质。噬菌体必须在活菌内寄生，有严格的宿主特异性，其取决于噬菌体吸附器官和受体菌表面受体的分子结构和互补性。噬菌体是病毒中最为普遍和分布最广的群体。通常在一些充满细菌群落的地方。噬菌体于1915年由英国生物学家和1917年加拿大微生物学家各自独立发现。近几年，随着对噬菌体生物学特性和感染特性认识的深入，噬菌体作为治疗制剂的研究也越来越多。噬菌体在宿主细胞中生长繁殖，能够引起致病菌的裂解，降低致病菌的密度，从而减少或避免致病菌感染或发病的机会，达到治疗和预防疾病的目的，即噬菌体疗法。噬菌体广泛存在于自然界中，常伴随着细菌而存在，理论上每种细菌均有其对应的噬菌体。按照噬菌体与宿主菌的关系分为裂解性噬菌体和溶源性噬菌体，鉴于裂解性噬菌体的溶菌作用而被认为是细菌的天然杀手，与抗生素相比，噬菌体作为细菌病毒，可在宿主菌内复制并破坏宿主菌结构，释放出子代噬菌体，这个裂解过程速度快、周期短，远超过致病菌的繁殖速率，这种专门压制细菌生长的特质令噬菌体疗法脱颖而出。因此，分离获得对耐久肠球菌具有高效杀菌活性的噬菌体，开发利用噬菌体紧急预防和控制耐久肠球菌感染及其引发的肉鸡心内膜炎具有十分重要的意义。

发明内容

本发明公开一株噬菌体vB_EduS_BLT01，为一株以耐久肠球菌为宿主菌分离的新噬菌体，可以制成防治肉鸡心内膜炎的药物。

本发明提供的一株噬菌体vB_EduS_BLT01，保藏名为：耐久肠球菌噬菌体vB_EduS_BLT01；Enterococcus durable phage vB_EduS_BLT01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020715；保藏时间为：2020年11月9日。

本发明还提供了上述噬菌体的分离与纯化方法及其一般生物学特性。

本发明所述的耐久肠球菌噬菌体vB_EduS_BLT01在制备防治肉鸡心内膜炎药物中的应用。

一种用于杀耐久肠球菌和肠球菌的组合物，其包含本发明所述的耐久肠球菌噬菌体vB_EduS_BLT01作为活性成分，所述组合物为液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂等。

本发明的积极效果在于：

提供了一株新的耐久肠球菌噬菌体（vB_ EduS_BLT01），以耐久肠球菌为宿主菌分离的新噬菌体，可以感染、杀灭耐久肠球菌，能够控制耐久肠球菌感染及其引发的肉鸡心内膜炎，用于制备防治肉鸡心内膜炎的药物，具有疗效显著，方便实用等特点。

附图说明

图1.本发明耐久肠球 vB_ EduS_BLT01形成的噬菌斑，直径1.5mm；

图2. 本发明耐久肠球菌噬菌体vB_ EduS_BLT01在透射电镜下的形态；

图3. 本发明耐久肠球菌噬菌体vB_ EduS_BLT01的一步生长曲线。

具体实施方式

以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例1

噬菌体分离及制备

本发明中的粪液污水样品采自长春市火烧李污水沟；宿主菌为耐久肠球菌。采集污水，用纱布过滤，取上清；用处理过的污水代替ddH₂O配制BHI培养基（脑心浸出液肉汤3.85g）（100 mL）；取1 mL 过夜培养的耐久肠球菌菌液混于其中，置摇床中过夜培养（37℃，165 r/min）；取过夜培养物1 mL，12000 g/min离心5 min，上清用0.22 µm滤器过滤得到噬菌体原液并保存，将得到的滤液用于空斑测试，以检查噬菌体原液中是否包含能够杀死耐久肠球菌的噬菌体。

空斑测试如下进行：以2%的比例在5 mL BHI培养基中接种耐久肠球菌，37℃振荡培养过夜。取上述制备的细菌培养液100 µL(OD ₆₀₀＝1.5)用涂布棒均匀地涂在BHI培养基平板上；待其晾干后，取上述噬菌体原液10 µL滴于其中一个区域并作标记；静置，待滴加的噬菌体晾干后，倒放于37℃培养箱培养10 h后，观察滴加噬菌体区域有无空斑形成。

如果在噬菌体原液滴加位置产生透明空斑，则可以判断为原液中包含能够杀灭耐久肠球菌的噬菌体。通过上述步骤，可以获得具有杀死耐久肠球菌活性的噬菌体原液。

取上述所得噬菌体原液用无菌PBS进行倍比稀释，各取100 µL稀释过的滤液和200µL过夜培养的宿主菌混合，共孵育5 min，然后将混合液加入到7 mL 45℃融化的BHI半固体培养基中，充分混匀后倾倒于BHI固体琼脂培养基上，待其凝固，放置37℃温箱中孵育16-20h，获得单个噬菌斑。

实施例2

噬菌体扩增和纯化

在形成噬菌斑的双层平板上，用移液器的枪头挑取直径较大、圆且透亮的单个噬菌斑，接种于5 mL BHI培养基中，加入200 µL噬菌体宿主菌液，混匀，于摇床37℃培养至液体逐渐澄清，再12000 g/min，4℃ 离心10 min，取上清；重复双层平板实验4-5次，如此反复挑取4-5次单个噬菌斑，将噬菌体纯化成大小一样的噬菌斑。

将准备好的10mL菌液加入灭菌的800 mL BHI培养液中，大摇床振荡培养（37℃，180 r/ min），当培养瓶稍浑浊时取出，按照感染复数加入100µL噬菌体，静置 10 分钟后继续摇床培养，直至瓶中液体逐渐澄清后又微浑浊时，即为扩增出的较浓的噬菌体。将噬菌体扩增液倒入离心筒，使用高速立式离心机充分离心（8000 r/ min，40 min），得到离心上清即为耐久肠球菌噬菌体裂解液。

PEG纯化：在噬菌体裂解液中加入RNase A、DnaseⅠ至终浓度均为1 µg/mL，室温放置30 min；加入NaCl至终浓度为1 mol/L，混合均匀后，冰浴1-2 h；4℃ 离心机，8000 g/min离心15-20 min后收集上清；按每100 mL 10 g的量加入PEG-8000，轻轻搅拌使其溶解，冰浴过夜，此过程则为了使噬菌体在PEG-8000的作用下形成沉淀；4℃ 离心机，12000 g/min离心10-20 min，回收沉淀的噬菌体颗粒，加2 mL SM液，充分洗涤沉淀，室温作用1 h；加入等体积的氯仿抽提，温和振荡30 s；4℃ ，5000 g离心10 min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的耐久肠球菌噬菌体。

CsCl等密度梯度离心纯化: 按表制备CsCl梯度液，按照从高密度到低密度的顺序，在5 mL半透明聚丙烯酰胺高速离心管中依次加入各梯度液1 mL；将噬菌体浓缩液700 µL缓慢加入到CsCl梯度液的上面，放到4℃高速离心机中，35000 g/min平离心3 h；离心结束后待真空下降为0时，打开仓门，取出样品，关机；样品下端有一层蓝色带，用细针头从带侧面插入，小心吸取；将样品置于透析袋中，用10 mM Tris-HCl，pH为7.4，100 mM MgCl ₂缓冲液进行透析，2 L一次（10-14 kd）；最终将样品吸出，测定噬菌体效价（图1）。

表1 CsCl梯度液制备

采用双层平板法检测噬菌体效价：将以上纯化的噬菌体液进行10倍梯度稀释，取相应的几个梯度的噬菌体稀释液各100 µL与宿主菌液200 µL充分混匀，铺双层平板，37℃恒温培养10 h左右，对每个平皿进行噬菌斑计数。选择出现100-200左右噬菌斑的平皿，根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度即得噬菌体效价。

纯化的耐久肠球菌噬菌体在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2020715，保藏日期为2020年11月9日，保藏名为耐久肠球菌噬菌体vB_ EduS_BLT01，保藏单位地址：中国武汉武汉大学。

实施例3

耐久肠球菌噬菌体vB_EduS_BLT01透射电镜观察

取实施例2中PEG纯化的噬菌体做电镜观察，具体操作步骤为：加10 µL 样本滴在铜网上，待其沉淀15 min， 用滤纸吸去多余的液体，用 2%的磷钨酸（PTA）染色1-2 min，干燥后使用透射电镜（日立H-7650）观察；观测结果如图2 所示，头部呈正二十面体，头部直径约为66nm，尾长约为188nm包括尾丝和尾鞘。根据国际病毒分类委员会(ICTV) 2005年发表的《病毒分类—国际病毒分类委员会第八次报告》，vB_EduS_BLT01属于长尾病毒科（Myoviridae ）。

实施例4

耐久肠球菌噬菌体vB_ EduS_BLT01的一步生长曲线

一步生长曲线测定：将培养至对数期的宿主菌与噬菌体按照MOI=0.1的比例进行混合，在4℃放置15 min，用新鲜BHI培养基将沉淀悬起，将悬液于37℃振荡培养，前30 min每隔5 min取一次样品，后30 min每隔10 min取一次样品。所取的样品分成两组，一组加1%氯仿作用半小时，另一组不用氯仿处理。最终将取得的样品分别用0.22µm的滤器过滤，并作一定比例的稀释，按双层平板法铺板，计算噬菌体效价，做三组平行实验，从而绘制出噬菌体感染细菌的一步生长曲线，结果如图3所示。

实施例5

耐久肠球菌噬菌体vB_EduS_BLT01宿主谱分析

将实施例2获得的噬菌体vB_EduS_BLT01效价调整为10 ⁸ pfu/mL备用。实验选择多株肠球菌、耐久肠球菌及其他常见的细菌，对噬菌体vB_EduS_BLT01的杀菌谱进行分析，具体操作如下：

空斑实验测定：分别取待测菌株的过夜培养物100 µL，滴加BHI培养基平板中央，用涂布棒分别将它们涂制成均匀的菌苔。取10 µL噬菌体vB_EduS_BLT01滴加在菌苔表面，待液滴干燥后倒置于37℃培养12 ~ 16 h，观察结果。若空斑试验结果呈阳性，则继续进行噬斑试验。

噬斑实验测定：取噬菌体原液1 mL，进行一系列的10倍稀释。取10^-2、10^-4和10^-6稀释液各0.1 mL分别与待测菌株的过夜培养物0.1 mL混匀，室温作用15 min后，加入约7 mL加热融化的BHI半固体培养基中，混匀后迅速倾倒入BHI培养基平板上层，摇匀平置10 min，待其凝固，置于37℃温箱培养8 h后观察结果（表2）。

表2. 耐久肠球菌噬菌体vB_ EduS_BLT01宿主谱分析

菌株类型	菌株数量	可裂解菌株数量	不可裂解菌株数量
				肠球菌	205	3	202
粪肠屎肠	86	1	85
				大肠杆菌	5	0	5
金黄色葡萄球菌	8	0	8
				巴氏链球菌	2	0	2
破伤风球菌	2	0	2

本发明耐久肠球菌噬菌体vB_ EduS_BLT01对耐久肠球菌和肠球菌具有感染，裂解谱如表2所示，鉴于此，该噬菌体可用于控制耐久肠球菌感染及其引发的疾病。该噬菌体具有呈正二十面体的头部和尾部；噬菌体在BHI琼脂培养基上可以感染耐久肠球菌从而形成透亮的噬菌斑；基因组核酸的酶切图谱显示该噬菌体核酸是双链DNA（dsDNA）。

耐久肠球菌噬菌体是能够感染特定细菌并最终杀灭细菌的特异性病毒，并且是包含单链或双链脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)作为遗传物质的病毒。

Claims (4)

1.一株噬菌体，已于2020年11月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏命名为：耐久肠球噬菌体vB_EduS_BLT01；Klebsiella pneumonia phage vB_KpnP_ZK1，保藏编号为：CCTCC NO：M2020715。

2.如权利要求1所述的耐久肠球噬菌体vB_EduS_BLT01在制备防治肉鸡心内膜炎药物中的应用。

3.一种用于杀耐久肠球菌和肠球菌的组合物，其包含权利要求1所述的耐久肠球噬菌体vB_EduS_BLT01作为活性成分。

4.如权利要求3所示所述组合物，包括药物学中的液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂。

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