CN113174372B

CN113174372B - 一种噬菌体vB_KpnS_ZH01及医用用途

Info

Publication number: CN113174372B
Application number: CN202110689137.2A
Authority: CN
Inventors: 郭志敏; 顾敬敏; 韩文瑜; 张昊; 冀亚路
Original assignee: First Hospital Jinlin University
Current assignee: First Hospital Jinlin University
Priority date: 2021-06-22
Filing date: 2021-06-22
Publication date: 2023-04-11
Anticipated expiration: 2041-06-22
Also published as: CN113174372A

Abstract

本发明公开一种噬菌体vB_KpnS_ZH01及医用用途，一株以K2型肺炎克雷伯菌的噬菌体突变株为宿主菌分离的新噬菌体，该噬菌体具有较窄的杀菌谱，可以感染、杀灭肺炎克雷伯菌，更重要的是对已报道的噬菌体抗性株有杀菌活性，为肺炎克雷伯菌噬菌体鸡尾酒治疗法提供了基础。

Description

一种噬菌体vB_KpnS_ZH01及医用用途

技术领域

本发明公开了一种噬菌体vB_KpnS_ZH01，是一株以K2型肺炎克雷伯菌的噬菌体突变株为宿主菌分离的新噬菌体，同时提供了该噬菌体分离和纯化的方法以及一般生物学特性，属于生物工程技术领域。

背景技术

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）为革兰氏阴性菌它属于肠杆菌科，克雷伯氏菌属，是一类人畜共患病病原菌；临床上肺炎克雷伯菌可引起尿路、肺部感染，菌血症，外科术后感染，腹膜炎和神经系统感染；特别是免疫力低下的患者，比如高龄，血液系统疾病和肿瘤患者，或者近期有广谱抗生素的应用史、免疫抑制剂的应用史、激素应用史都是肺炎克雷伯菌感染的易感因素。

噬菌体(phage)是一种能够特异性感染细菌、放线菌、藻类甚至支原体和螺旋体的病毒，依据其生物学生长周期，噬菌体主要分为两大类：裂解性噬菌体(又称为烈性噬菌体)和溶原性噬菌体(又称为温和噬菌体)。噬菌体能够特异性的感染并杀死细菌，可被用于预防和控制细菌感染，噬菌体可以特异性感染细菌，并在细菌细胞内进行复制，组装合成子代噬菌体，以指数形式成倍增加，最终将细菌杀死，释放子代噬菌体颗粒。与其他治疗方法(抗生素，中药制剂，抗菌肽等)相比，噬菌体疗法具有更多优势，例如对于特定病原菌株的高度专一性、易于增殖生产、便于基因工程改造等。因此，噬菌体疗法是治疗人和动物细菌感染的除传统抗生素治疗外的另一种替代选择，尤其针对超级耐药菌感染的临床治疗方面具有良好前景和无限潜力。

发明内容

本发明公开一种噬菌体vB_KpnS_ZH01，一株以K2型肺炎克雷伯菌的噬菌体突变株为宿主菌分离的新噬菌体，该噬菌体具有较窄的杀菌谱，可以感染、杀灭肺炎克雷伯菌，更重要的是对已报道的噬菌体抗性株有杀菌活性，为肺炎克雷伯菌噬菌体鸡尾酒治疗法提供了基础。

本发明还提供了上述噬菌体的分离与纯化方法及其一般生物学特性。

本发明公开的一株噬菌体，命名为：肺炎克雷伯菌噬菌体vB_KpnS_ZH01，于2020年11月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名为： Klebsiella pneumoniae phage vB_KpnS_ZH01，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020714。

发明所述的噬菌体vB_KpnS_ZH01在制备杀灭空间环境、动物和人中肺炎克雷伯菌药物中的应用。

本发明所述的噬菌体vB_KpnS_ZH01的有效成分在制备用于杀灭人体内、体表、病房、医疗器具的药物添加剂、喷雾添加剂、消毒剂或清洁剂中的用途。

一种用于杀灭肺炎克雷伯菌的组合物，以本发明所述的噬菌体vB_KpnS_ZH01作为活性成分；所述组合物为液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂等。

公开了一种噬菌体vB_KpnS_ZH01，是一株以K2型肺炎克雷伯菌的噬菌体突变株为宿主菌分离的新噬菌体，该噬菌体具有较窄的杀菌谱，可以感染、杀灭肺炎克雷伯菌，更重要的是对已报道的噬菌体抗性株有杀菌活性，为肺炎克雷伯菌噬菌体鸡尾酒治疗法提供了基础。

附图说明

图1为本发明噬菌体vB_KpnS_ZH01形成的噬菌斑；

图2为本发明噬菌体vB_KpnS_ZH01在透射电镜下的形态；

图3为本发明噬菌体vB_KpnS_ZH01的MOI；

图4为本发明噬菌体vB_KpnS_ZH01的一步生长曲线。

实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

在本发明的实施方案中，提供了一株对肺炎克雷伯菌具有感染和杀菌活性的新型噬菌体。噬菌体是能够感染特定细菌并最终杀灭细菌的特异性病毒，并且是包含单链或双链脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)作为遗传物质的病毒。

实施例1

噬菌体分离及制备

噬菌体的分离过程在下文中详细描述。本发明中的粪液污水样品采自西藏；宿主菌为肺炎克雷伯菌K7R。采集粪便，加入无菌ddH₂O用纱布过滤，或10000 g/min离心5 min，取上清；用处理过的污水代替ddH₂O配制肺炎克雷伯菌扩增培养基（氯化钠1.0 g、胰蛋白胨1.0 g、酵母粉0.5 g）（100 mL）；取1 mL 过夜培养的菌液混于其中，置摇床中（37℃，180 r/min过夜培养）；取过夜培养物1 mL，12000 g/min离心3 min，上清用0.22 µm滤器过滤形成噬菌体原液并保存，将得到的滤液用于空斑实验，以检查噬菌体原液中是否包含能够杀死肺炎克雷伯菌的噬菌体；

空斑实验方法如下：以2%的比例在5 mL LB培养基中接种肺炎克雷伯菌K7R，37℃振荡培养过夜。取上述制备的细菌培养液100 µL(OD ₆₀₀ ＝1.5)用涂布棒均匀地涂在LB培养基平板上。待其晾干后，取上述噬菌体原液10 µL滴于其中一个区域并作标记；待自然晾干后，置于37℃培养箱培养10 h后，观察滴加噬菌体区域有无空斑形成；

如果在噬菌体原液滴加位置产生透明空斑，则可以判断为原液中包含能够杀灭肺炎克雷伯菌K7R的噬菌体。通过上述步骤，可以获得具有杀死肺炎克雷伯菌K7R活性的噬菌体原液；

取上述所得噬菌体原液用无菌PBS进行倍比稀释，各取100 µL稀释过的滤液和200µL过夜培养的宿主菌K7R混合，共孵育5 min，然后将混合液加入到7 mL 50℃左右的半固体培养基中，充分混匀后倾倒于固体琼脂培养基上，待其凝固，放置37℃温箱中孵育12-16 h，获得单个噬菌斑。

实施例2

噬菌体扩增和纯化

在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌的移液器的枪头挑取直径较大、圆且透亮的单个噬菌斑，接种于5 mL LB液体培养基中，加入过夜培养的肺炎克雷伯菌K7R菌液200 µL，混匀，室温作用15 min，37℃培养1～3 h，12000 g，4℃ 离心5 min，取上清；重复双层平板实验4-5次，如此反复挑取4-5次单个噬菌斑，将噬菌体纯化成大小一样的噬菌斑。

PEG纯化：在噬菌体裂解液中加入RNase A、DnaseⅠ至终浓度均为1 µg/mL，室温放置30 min；加入NaCl至终浓度为1 mol/L，混合均匀后，冰浴1 h；4℃ 离心机，8000 g/min离心15-20 min后收集上清；按每100 mL 10 g的量加入PEG-8000，轻轻搅拌使其溶解，冰浴2h以上（最好过夜），使噬菌体在PEG-8000作用下形成沉淀；4℃ 离心机，12000 g/min离心10-20 min，回收沉淀的噬菌体颗粒，加2 mL SM液，充分洗涤沉淀，室温作用1 h；加入等体积的氯仿抽提，温和振荡30 s；4℃ ，5000 g离心10 min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体。

采用双层平板法检测噬菌体效价：将以上纯化的噬菌体液进行10倍梯度稀释，取

相应的几个梯度的噬菌体稀释液各100 µL与宿主菌液200 µL充分混匀，铺双层琼脂平板，37℃恒温培养10 h左右，对每个琼脂平皿进行噬菌斑计数。选择出现100-200左右噬菌斑的平皿，根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度即得噬菌体效价。

纯化的噬菌体在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2020714，保藏日期为2020年11月9日，保藏单位地址：中国武汉市武汉大学，邮编430072。

实施例3

噬菌体vB_KpnS_ZH01透射电镜观察

取实施例2中PEG纯化的噬菌体做电镜观察，具体操作步骤为：加10 µL 样本滴在铜网上，待其沉淀15 min，用滤纸吸去多余的液体，用 2%的磷钨酸（PTA）染色1-2 min，干燥后使用透射电镜（日立H-7650）观察；观测结果如图2 所示，头部呈正二十面体，头部直径约为55 nm，尾长约为161.5 nm。根据国际病毒分类委员会(ICTV) 2005年发表的《病毒分类—国际病毒分类委员会第八次报告》，vB_KpnS_ZH01属于长尾病毒科（ Siphoviridae ）。

实施例4

噬菌体vB_KpnS_ZH01的最佳MOI

最佳MOI测定：将培养至对数期的宿主菌K7R调整至浓度为4 × 10⁸CFU/mL，然后分别按照噬菌体/菌为0.000001、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10的比例将两者混合，转接到5 mL LB液体培养基中37℃振荡培养7-8 h。然后将培养液离心（4℃，1 0000 g，15 min），用0.22 μm 孔径的无菌滤器对上清液过滤，用双层平板法对得到的噬菌体增值液进行滴度测定，从而绘制出噬菌体vB_KpnS_ZH01感染细菌的最佳MOI为0.01。

实施例5

噬菌体vB_KpnS_ZH01的一步生长曲线

一步生长曲线测定：将培养至对数期的宿主菌与噬菌体按照MOI＝1的比例进行混合，在37℃放置5 min，用新鲜LB培养基将沉淀悬起，将悬液放置在37℃振荡培养，每隔5min取一次样品，每个样品分成两部分，一部分立即过滤，另一部分用1%的氯仿处理30min后再进行过滤，测定噬菌体的滴度，从而绘制出噬菌体感染细菌的一步生长曲线，结果如图4所示。

实施例6

噬菌体vB_KpnS_ZH01宿主谱分析

将实施例2获得的噬菌体vB_KpnS_ZH01效价调整为10⁸pfu/mL备用。实验选择多株肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌，对噬菌体vB_KpnS_ZH01的杀菌谱进行分析，具体操作如下：

分别取待测菌株的过夜培养物100 µL，滴加在LB培养基平板中央，用涂布棒分别将它们涂制成均匀的菌苔。取10 µL噬菌体vB_KpnS_ZH01滴加在菌苔表面，待液滴干燥后倒置于37℃培养10 ~ 16 h，观察结果。若空斑试验结果呈阳性，则继续进行噬斑试验。

取噬菌体原液1 mL，进行一系列的10倍稀释。取10^-2、10^-4和10^-6稀释液各0.1 mL分别与待测菌株的过夜培养物0.1 mL混匀，室温作用5 min后，加入约7 mL， 50℃左右的半固体培养基中，混匀后迅速倾倒入LB培养基平板上层，摇匀平置10 min，待其凝固，置于37℃温箱培养8 h后观察结果，结果如表1所示：

结论：噬斑实验证明该噬菌体有较窄的宿主谱。

Claims

1.一株噬菌体，命名为：肺炎克雷伯菌噬菌体（Klebsiella pneumoniae phage）vB_KpnS_ZH01，于2020年11月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名为：Klebsiella pneumoniae phage vB_KpnS_ZH01，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020714。

2.如权利要求1所述的噬菌体vB_KpnS_ZH01在制备杀灭空间环境、动物和人中肺炎克雷伯菌药物中的应用。

3.一种用于杀灭肺炎克雷伯菌的组合物，其包含权利要求1所述的噬菌体vB_KpnS_ZH01作为活性成分。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物为液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂。