CN100363489C - 一株耐亚胺培南绿脓杆菌噬菌体及其用于治疗耐亚胺培南绿脓杆菌感染的用途 - Google Patents
一株耐亚胺培南绿脓杆菌噬菌体及其用于治疗耐亚胺培南绿脓杆菌感染的用途 Download PDFInfo
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Abstract
一株耐亚胺培南绿脓杆菌噬菌体及用于治疗耐亚胺培南绿脓杆菌感染的用途。本发明涉及一株分离获得的宽噬噬菌体及基治疗性应用。本发明人经过广泛的研究，以提供一种治疗临床耐亚胺培南绿脓杆菌感染的生物手段。结果是分离获得一株广谱耐药绿脓杆菌噬菌体φA392。它能有效地在体内、体外杀灭耐药绿脓杆菌。本发明人基于提供一种新型抗感染治疗手段的目的，做了进一步研究，该噬菌体能在体内外裂解多株临床分离耐亚胺培南绿脓杆菌。本发明证实了噬菌体作为一种治疗性物质应用临床抗绿脓杆菌感染治疗的优越性及可行性，提供了一种临床耐亚胺培南绿脓杆菌感染的新的治疗手段。
Description
【技术领域】
本发明涉及一株分离获得的宽噬噬菌体及其治疗性应用
【背景技术】
感染是长期以来一直困扰人类健康的疾病。虽然在抗生素问世以来，许多过去闻之色变的感染性疾病已经得到有效的控制，但由于耐药性的出现，使临床感染控制重新成为难题，特别是目前临床耐药菌的出现速度已经大大超越抗生素的更新速度，人类已经面临着无抗生素可用的境地。而且有的抗生素自身毒副作用大，选择性不强，本身就可以对机体造成损害或导致二重感染。因此有必要研究新的治疗手段。
噬菌体治疗作为一种生物性治疗手段近年来逐渐重新得到人们的重视。早在本世纪二、三十年代，噬菌体的发现者之一Felixd’herelle就曾致力于噬菌体的治疗性研究并取得积极效果。后来由于抗生素的问世，有效的解决了感染性疾病的控制问题。因而噬菌体治疗逐渐在西方国家被限制了。但在前苏联地区及东欧国家、法国等地区，噬菌体治疗作为一种治疗手段得以长期保存并取得一定效果，如在前苏联，噬菌体制剂被长期大量用于军队中腹泻的控制并取得显著效果。在东欧国家(如波兰)及法国，噬菌体作为一种治疗感染的手段也被长期使用并有成品制剂在市场出售。
噬菌体用于治疗感染性疾病的原理是基于其自身的生物学特性而发展出来的。噬菌体有两种生长方式：溶原性生长及裂解性生长。溶原性生长即是指噬菌体DNA进入宿主菌细胞后，与宿主菌细胞的DNA进行整合，并随着宿主菌的分裂而分裂，但并不导致宿主菌的死亡。而裂解性生长则是指噬菌体进入宿主菌细胞后，破坏宿主菌的DNA，并以之为原料合成自身的DNA，然后利用宿主细胞内的蛋白质合成蛋白质外壳，进而组装成一个完整的新的噬菌体。当宿主细胞内的噬菌体达到一定数量后，就会导致宿主菌裂解、死亡。其释放出来的噬菌体又可以继续感染周围的细菌，实现倍增效应，从而实现治疗细菌感染的目的。此外，噬菌体制剂吸附率高、潜伏期短、裂解量(即单个噬菌体感染细菌后裂解所释放出来的噬菌体数量)大、特异性强(噬菌体制剂一般只对宿主菌有损害，而对人体正常细胞及正常菌群无损害，不会导致二重感染)。因此，用噬菌体来治疗感染是一个很有前途的抗感染治疗新途径。当然，噬菌体对宿主菌损害的机制目前尚有争论，但这并不妨碍噬菌体制剂用于治疗的可行性。
【发明内容】
本发明人经过广泛的研究，以提供一种治疗临床耐亚胺培南绿脓杆菌感染的生物手段。结果是分离获得一株广谱耐药绿脓杆菌噬菌体φA392。它能有效地在体内、体外杀灭耐药绿脓杆菌。本发明人基于提供一种新型抗感染治疗手段的目的，做了进一步研究，该噬菌体能在体内外裂解多株临床分离耐亚胺培南绿脓杆菌。
因而，本发明的目的在于提供一株宽噬噬菌体，它能够在体内、体外有效地杀灭临床分离的耐亚胺培南绿脓杆菌。
本发明的另一个目的是证实了噬菌体作为一种治疗性物质应用临床抗绿脓杆菌感染治疗的优越性及可行性，提供了一种临床耐亚胺培南绿脓杆菌感染的新的治疗手段。
本发明的耐亚胺培南绿脓杆菌噬菌体φA392已于2005年5月16日在中国典型微生物保藏中心(中国武汉市，武汉大学，布达佩斯条约保藏单位)保藏，并收到保藏登记号CCTCC NO：M205045.
本发明它具有体内抗感染效应。而且有较宽的宿主谱，能够裂解75％的实验用临床分离耐药菌株。本发明的噬菌体作为抗感染物质应用于感染治疗，为临床治疗耐药菌问题提供了一种可选择手段，特别是应用分离筛选获取的并在动物实验中证实了其有效性的噬菌体φA392(CCTCC NO：M205045)作为一种治疗性物质用来制备治疗临床耐药绿脓杆菌感染的生物制剂。
根据本发明，耐亚胺培南噬菌体φA392在培养皿上可以形成较大的透亮空斑，并且对所收集的30株耐亚胺培南绿脓杆菌临床分离株中的22株有裂解作用，裂解率为75％，其所能裂解的耐亚胺培南临床分离株如下：IMR-Pa 91、15、9915、9472、9986、9747、9484、8095、8145、505、9431、7827、1014、1092、A392、A399、1423、1505、1612、1182、1578、2024。采用本发明的噬菌体用于小鼠菌血症的治疗，在MOI≥0.01(multiple of infection，感染复数)时可以治愈全部小鼠。即使在延迟3小时治疗的情况下(此时小鼠已经出现明显的全身感染症状如无活力、卷毛、弓背、眼周脓性渗出物聚集等)仍有40％的疗效。体内、体外实验均证明本发明的噬菌体为一种有效的抗感染物质，具有临床应用的潜在价值。
分离获得本发明的噬菌体的过程如下：取同济医院污水处理中心处理前污水1L，加NaCl58g，10,000×g离心10min。取上清，加PEG-8000至终浓度为10％(w/v)，置4℃冰箱过夜后在4℃，10，000×g离心20min。用5ml SM Buffer重悬沉淀。等体积氯仿抽提一次。300μl处理后的污水与200μl过夜培养的耐亚胺培南绿脓杆菌φA392混合，37℃孵育20min，与3ml熔化顶层琼脂在于50℃混匀，铺平皿，冷却后倒置于37℃过夜培养。次日在培养皿上发现数个大小不等透亮空斑。用tip头取下其中最大的空斑，溶于2mlLB培养液中，按1∶100的比例向该培养液中加入过夜培养的耐亚胺培南绿脓杆菌φA392，37℃，250转振摇4.5～5小时。12000转离心5分钟，取80％上清4℃保存。取此上清再与φA392菌于固体培养基上共培养，用tip挑取较大噬斑。如此反复3次，即可得到大小均一的噬斑。取出噬斑，按上述方法进行小量扩增，得到液态的噬菌体扩增液。将过夜培养的宿主菌按1∶100稀释，继续培养至早期对数生长期。加入前述浓缩噬菌体10μl，继续培养5h，加入1/10体积的氯仿，继续振摇10分钟后，分别加入DNase I及RNase A至终浓度均为1μg/ml，室温放置30分钟，离心除去细菌碎片。加1/6体积的PEG/NaCl，4℃过夜。次日，4℃，12,000×g离心20min。用1ml SM Buffer重悬沉淀。加入1/6体积PEG/NaCl再次沉淀，冰上孵育1h，4℃，12,000×g离心20min。用200μl SM Buffer重悬沉淀，即得到扩增的噬菌体，经过反复扩增可以达到所需的滴度。
本发明所采用的培养基具有以下组成：LB培养基：1％tryptone、0.5％Yeast extract和1％NaCl。固体琼脂：1％tryptone、0.5％Yeastextract和1％NaCl及1.5％Agar。顶层琼脂：1％tryptone、0.5％Yeastextract和1％NaCl及0.7％Agarose。SM Buffer由0.1M NaCl，0.01MMgSO4·7H2O，0.05M Tris-HCl(pH7.5)和0.01％gelatin(明胶)配制而成。PEG/NaCl由20％PEG-8000和2.5MNaCl配制而成。
本发明的噬菌体株φA392(CCTCC NO：M205045)具有以下微生物学特征：
1、形态学特性：
在电子显微镜下观察磷钨酸负染的噬菌体颗粒(图1)，该噬菌体呈正多面体的头部结构，直径60nm，有尾轴，长116nm。
2、培养学特性
本发明的噬菌体株在指示菌φA392的固体培养基上可以形成较大透亮空斑，空斑直径1～2mm，周围无晕环。
3、生物学特性：
本发明的噬菌体株可以快速的吸附于宿主菌φA392上，在5分钟内的吸附率达到96％(如图2)，吸附速率常数K为1.28×10-8ml/min。
该噬菌体的一步生长曲线如图3，从中可以看出该噬菌体感染宿主菌的潜伏期为20～25分钟，平均裂解量为125。潜伏期短，裂解量大，说明该噬菌体具有很强的裂解效应。
本发明的噬菌体裂解谱并不专一，它可以在30株临床分离的耐亚胺培南绿脓杆菌中的22株的培养皿上形成透亮空斑，宽噬率达到75％。而且，它对其它菌属如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌没有裂解作用。
本发明人已经证实，分离获得的噬菌体株φA392在动物实验中可以有效地治疗耐亚胺培南绿脓杆菌的感染，且没有毒副作用。由于其不对铜绿假单胞菌属以外的菌具有裂解作用，因此也不会发生菌群失调。
【附图说明】
图1：φA392的电镜照片，该噬菌体呈正多面体的头部结构，直径60nm，有尾轴机构。尾轴长116nm。
图2：噬菌体φA392的吸收曲线，在5分钟内的吸附率达到96％(如图2)，吸附速率常数K为1.28×10-8ml/min。
图3：噬菌体φA392的一步生长曲线，该噬菌体感染宿主菌的潜伏期为20～25分钟，平均裂解量为125。潜伏期短，裂解量大，说明该噬菌体具有很强的裂解效应。
图4：宽噬噬菌体的筛选：以绿脓杆菌φ9747为宿主菌制成均匀的菌苔，然后在培养皿的背部划分20个小方格，在格内滴加噬菌体，具有裂解性的噬菌体则可以形成透亮的空斑。
图5耐亚胺培南绿脓杆菌φA392感染小鼠最小致死量的确定，3×107-1×108CFU的菌液均可以导致全部小鼠死亡，而1×107-2×107CFU的菌液不会引起全部小鼠死亡。因此，3×107CFU为引起小鼠死亡的最小致死量。
图6最小致死量的精确时相性分析，MLD的菌液经腹腔注射于10只小鼠，90％小鼠均在6～14小时内死亡。
图7不同剂量噬菌体治疗效果，噬菌体剂量在MOI≥0.01的情况下全部小鼠均可存活并最终痊愈。
图8噬菌体延迟治疗效果，在延迟1小时内的情况下，全部小鼠均可免于死亡。而在延迟治疗1小时以上时，由于此时小鼠的状态较差，已出现明显的感染症状如卷毛、弓背、眼周渗出物聚集等，噬菌体的效果有所下降，但仍具有统计学意义(P＜0.01)。
【具体实施方式】
本发明通过借助下列实施例将更详细说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应当指出，本发明并不受这些实施例的限制。
实施例1：
取同济医院污水处理中心污水1L，加NaCl58g，10,000×g离心10min。取上清，加PEG-8000至终浓度为10％(w/v)，置4℃冰箱过夜后在4℃，10,000×g离心20min。用5ml SM Buffer重悬沉淀。等体积氯仿抽提一次。300μl处理后的污水与200μl过夜培养的宿主菌混合，37℃孵育20min，与3ml熔化顶层琼脂在于50℃混匀，铺平皿，冷却后倒置于37℃过夜培养。用tip头取下其中最大的空斑，溶于2mlLB培养液中，按1∶100的比例向该培养液中加入过夜培养的耐亚胺培南绿脓杆菌φA392，37℃，250转振摇4.5～5小时。12000转离心5分钟，取80％上清4℃保存。取此上清再与φA392菌于固体培养基上共培养，用tip挑取较大噬斑。如此反复3次，即可得到大小均一的噬斑。取此噬斑按前述方法液体扩增，得到浓缩噬菌体液。
实施例2：
将过夜培养的宿主菌φA392按1∶100稀释，继续培养至早期对数生长期。加入实施例1中的浓缩噬菌体10μl，继续培养5h，加入1/10体积的氯仿，继续振摇10分钟后，分别加入DNase I及RNase A至终浓度均为1μg/ml[3]，室温放置30分钟，离心除去细菌碎片。加1/6体积的PEG/NaCl，4℃过夜。次日，4℃，12,000×g离心20min。用1ml SM Buffer重悬沉淀。加入1/6体积PEG/NaCl再次沉淀，冰上孵育1h，4℃，12,000×g离心20min。用200μl SM Buffer重悬沉淀，即得到扩增的噬菌体，经过反复扩增可以达到所需的滴度。
实施例3：
用30株稀释的耐亚胺培南绿脓杆菌在LB培养基上制成均匀的菌苔。在该培养基背面划分16-20个方格并作标记，然后在相应的方格内滴加噬菌体φA392液，待液滴干燥后倒置于37℃孵育12-16h，观察结果(图4)。可见φA392在其中的22个菌株上形成噬斑，具体如下：IMR-Pa 91、15、9915、9472、9986、9747、9484、8095、8145、505、9431、7827、1014、1092、A392、A399、1423、1505、1612、1182、1578、2024。
实施例4：
1、取100ul过夜生长的细菌培养物，接入10ml培养基的三角烧瓶中，37℃振荡培养2.5-3小时后，经镜检计数，细胞可达到108/ml以上，用培养基稀释，配制成5*107/ml。
2、实验前一天测定噬菌体效价，按此稀释配制成5*109PFU/ml。
3、将上述二者在37度水浴中平衡，按MOI＝10将1ml噬菌体液加入9ml细菌悬液，混合均匀，放回水浴中保温或振荡保温。
4、按一定时间间隔(1-5min)取样，稀释1000倍，放在冰中，终止吸附。
5、取稀释样品1ml，在Ep管中离心3min或4000rpm离心5min，沉降细菌和吸附噬菌体的细胞。
6、经适当稀释(10-100倍)后，按双层琼脂法测定上清液中的游离噬菌体，培养后记录。
7、以游离噬菌体百分数的对数作为时间的函数作图，应得到一直线，从直线的斜率求K值(1.28×10-8ml/min)。
实施例5：
1、稀释噬菌体液至5*107PFU/ml。
2、将菌液稀释成5*107CFU/ml。
3、取20支Ep管，每管加入900ulLB液。
4、取20支Ep管，每管加入200ul菌液。
5、取20支试管，每管加入3ml熔化的顶层胶，保温在50度。
6、将上述噬菌体液，菌液置37度温育。
7、取0.1ml噬菌体液加入0.9ml的细菌悬液中，吸附5分钟。
8、取0.1ml混合液加至9.9ml冰TSBM液，混合均匀后各取1ml至Ep8、管中，4℃8000g离心5分钟，用1mlLB重悬沉淀。
9、取0.1ml重悬液加至9.9mlLB液，37℃振荡培养，期间分别于第0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90分钟取0.1ml共培养液与200ul菌液混合，5分钟后铺平皿，分别置于37℃培养。由上述各点的噬斑数-时间作曲线(图3)，可得该噬菌体潜伏期为20～25min，裂解量为125。
实施例6：
建立全身感染模型培养过夜的φA392菌按1∶100的比例稀释于100ml LB中，继续培养至早期对数生长期(OD600值约为0.5)，4℃，8000g离心5分钟，弃上清，将沉淀以等体积灭菌生理盐水重悬，再次离心，沉淀溶解于5ml生理盐水中。用生理盐水系列稀释的φA392经腹腔(intraperitoneal，i.p)注射于11组小鼠，导致一组(如无特殊说明，均为5只/组)小鼠全部死亡的最小剂量为最小致死量(minimal lethal dose，MLD)。系列稀释的菌液注射于小鼠后，3×107-1×108CFU的菌液均可以导致全部小鼠死亡，而1×107-2×107CFU的菌液不会引起全部小鼠死亡(如图5)。因此，3×107CFU为引起小鼠死亡的最小致死量。MLD的菌液经腹腔注射于10只小鼠，90％小鼠均在6～14小时内死亡(如图6)。
实施例7：
不同噬菌体剂量对疗效的影响：取9组小鼠，用MLD剂量的菌液经一侧腹腔注射，立即经另一侧腹腔注射不同剂量的噬菌体制剂(LB稀释)，其中一组i.p注射LB培养液作为对照。观测小鼠的健康状态20天以上。如图7，噬菌体剂量在MOI≥0.01的情况下全部小鼠均可存活并最终痊愈。MOI＝0和MOI≥0.01情况下小鼠生存率存在显著的统计学差异(P＜0.01)。
实施例8：
延迟治疗效果监测：取7组小鼠，均用MLD剂量的菌液感染，并分别于注射后第0，20，40，60，180，360分钟以500μl较高滴度的噬菌体液(MOI＝200)i.p注射，观测20天以上。每组小鼠均设置相应的对照组(即i.p注射等量的LB培养液)。如图8，在延迟1小时内的情况下，全部小鼠均可免于死亡。而在延迟治疗1小时以上时，由于此时小鼠的状态较差，已出现明显的感染症状如卷毛、弓背、眼周渗出物聚集等，噬菌体的效果有所下降，但仍具有统计学意义(P＜0.01)。
Claims (3)
1.一种作用于耐亚胺培南绿脓杆菌宿主的绿脓杆菌噬菌体ΦA392，其保藏号为CCTCC NO：M205045，其具有体内抗感染效应。
2.一种含有权利要求1所述的绿脓杆菌噬菌体ΦA392的生物制剂。
3.权利要求1所述的绿脓杆菌噬菌体ΦA392在制备治疗耐药绿脓杆菌感染的生物制剂中的应用。
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