CN112695017B - 噬菌体vB_Yen_X1及在防治鼠疫杆菌感染中应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种噬菌体vB_Yen_X1及在防治鼠疫杆菌感染中应用，提供了一株新的小肠结肠炎耶尔森菌噬菌体vB_Yen_X1，具有较宽的杀菌谱，不仅可以感染、杀灭小肠结肠炎耶尔森菌，更重要的是对鼠疫耶尔森菌表现出极宽的感染和杀菌谱，可以单独或与其他物质复配使用，能够有效净化鼠疫疫源地、紧急预防和控制鼠疫耶尔森菌感染及其引发的鼠疫。

Description

噬菌体vB_Yen_X1及在防治鼠疫杆菌感染中应用

技术领域

本发明公开了一株新的小肠结肠炎耶尔森菌噬菌体vB_Yen_X1，该噬菌体可有效的净化鼠疫疫源地、紧急预防和控制鼠疫耶尔森菌感染及其引发鼠疫，属于生物工程技术领域。

背景技术

小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）是一种革兰氏阴性杆菌或球杆菌，属肠杆菌科，耶尔森菌属。小肠结肠炎耶尔森菌是一类人畜共患病病原菌，也是非常重要的食源性致病菌，具有噬冷性，能够在冷藏环境下生长增殖。人感染后能够引起呼吸系统、胃肠道系统、心血管系统等疾病，也可能引起急性阑尾炎、败血症等。

鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis），属肠杆菌科、耶尔森菌属，俗称鼠疫杆菌，是引起鼠疫感人的病原菌。鼠疫是一种人兽共患的自然疫源性烈性传染病，具有很强的传染性和很高的死亡率，曾被用作生物战。鼠疫耶尔森菌主要寄生于啮齿类动物，以鼠蚤为传播媒介。临床上常见的鼠疫耶尔森菌感染有腺型、败血症型和肺型三种类型：其中腺型鼠疫最常见，多发生于流行初期，可引起出血坏死性淋巴结炎；败血症型鼠疫可原发或继发；肺鼠疫可直接造成肺部感染，使患者死于休克、心力衰竭等。由鼠疫引发的死者皮肤常呈黑紫色，故有“黑死病”之称。敏感的抗生素可以有效控制鼠疫耶尔森菌的感染，但是目前没有有效净化鼠疫疫源地、紧急预防和控制鼠疫耶尔森菌感染及其引发鼠疫的方法。

噬菌体是一类能感染细菌、真菌、放线菌和分枝杆菌等微生物的病毒，于1915年由英国生物学家和1917年加拿大微生物学家各自独立发现。噬菌体能够特异性的感染并杀死细菌，可被用于预防和控制细菌感染噬菌体可以特异性感染细菌，并在细菌细胞内进行复制，组装合成子代噬菌体，以指数形式成倍增加，最终将细菌杀死，释放子代噬菌体颗粒。近几年，随着对噬菌体生物学特性和感染特性认识的深入，噬菌体作为治疗制剂的研究也越来越多。耶尔森菌对氨苄西林和头孢类抗生素天然耐药，对其他抗生素也有不同程度的耐药性。与抗生素相比，噬菌体最大的特点是：特异性，不影响正常菌群；机制不同，对耐药菌株同样有效；高效性，可以快速的杀灭特定病原菌；具有放大效应，通过感染和杀灭特定细菌能够达到自身的增殖；种类多，自然界中存在大量的噬菌体，约10³¹种；易获得，研发周期短。因此，噬菌体在治疗、预防和控制细菌感染及其引发疾病方面具有较高的应用潜力。同时，由于噬菌体特异性强，其杀菌谱较窄，在一定程度上限制了其实际应用，分离获得具有广谱、高效杀菌能力的噬菌体是实现其应用的关键所在。因此，分离获得对鼠疫耶尔森菌具有广谱、高效杀菌活性的噬菌体，开发利用噬菌体有效净化鼠疫疫源地、紧急预防和控制鼠疫耶尔森菌感染及其引发的鼠疫具有十分重要的意义。

发明内容

本发明公开一株噬菌体vB_Yen_X1，具有较宽的杀菌谱，不仅可以感染、杀灭小肠结肠炎耶尔森菌，更重要的是对鼠疫耶尔森菌表现出极宽的感染和杀菌谱，可以单独或与其他物质复配使用，能够有效净化鼠疫疫源地、紧急预防和控制鼠疫耶尔森菌感染及其引发的鼠疫。

本发明提供的一株小肠结肠炎耶尔森菌噬菌体vB_Yen_X1，是以小肠结肠炎耶尔森菌为宿主菌分离的新噬菌体保藏名为Yersinia enterocolitica phage vB_Yen_X1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO: M 2019504；保藏时间为：2019年7月1日。

本发明还提供了上述噬菌体的分离与纯化方法及其一般生物学特性。

本发明进一步公开了一种用于杀灭鼠疫耶尔森菌及控制鼠疫流行的药物组合物，以噬菌体vB_Yen_X1作为活性成分。

本发明所述的组合物包括液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂等医药学上的任何剂型。

本发明所述的噬菌体vB_Yen_X1在杀灭空间环境、动物和人中鼠疫耶尔森菌的应用。

本发明的积极效果在于：

提供了一株新的噬菌体vB_Yen_X1，以小肠结肠炎耶尔森菌为宿主菌分离的新噬菌体(Yersinia enterocolitica phage)，具有较宽的杀菌谱，不仅可以感染、杀灭小肠结肠炎耶尔森菌，更重要的是对鼠疫耶尔森菌表现出极宽的感染和杀菌谱，可以单独或与其他物质复配使用，能够有效净化鼠疫疫源地、紧急预防和控制鼠疫耶尔森菌感染及其引发的鼠疫。

附图说明

图1. vB_Yen_X1形成的噬菌斑；

图2. 噬菌体vB_Yen_X1在透射电镜下的形态；

图3. 噬菌体vB_Yen_X1的一步生长曲线。

具体实施方式

以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例1

噬菌体分离及制备

本发明中的粪液污水样品采自长春市火烧李污水沟；宿主菌为小肠结肠炎耶尔森菌23715。采集污水，用纱布过滤，或6000 g/min离心10 min，取上清；用处理过的污水代替ddH₂O配制小肠结肠炎耶尔森菌扩增培养基（氯化钠0.5 g、胰蛋白胨0.5 g、牛肉浸粉0.4g）（100 mL）；取1 mL 过夜培养的菌液混于其中，置摇床中（37℃，165 r/min过夜培养）；取过夜培养物1 mL，12000 g/min离心5 min，上清用0.22 µm滤器过滤形成噬菌体原液并保存，将得到的滤液用于斑点测试，以检查噬菌体原液中是否包含能够杀死小肠结肠炎耶尔森菌的噬菌体。

空斑测试如下进行：以2%的比例在5 mL 小肠结肠炎耶尔森菌扩增培养基中接种小肠结肠炎耶尔森菌23715，37℃振荡培养过夜。取上述制备的细菌培养液100 µL(OD ₆₀₀＝1.5)用涂布棒均匀地涂在小肠结肠炎耶尔森菌扩增培养基平板上；待其晾干后，取上述噬菌体原液10 µL滴于其中一个区域并作标记；待自然晾干后，置于37℃培养箱培养10 h后，观察滴加噬菌体区域有无空斑形成。

如果在噬菌体原液滴加位置产生透明空斑，则可以判断为原液中包含能够杀灭小肠结肠炎耶尔森菌23715的噬菌体。通过上述步骤，可以获得具有杀死小肠结肠炎耶尔森菌23715活性的噬菌体原液。

取上述所得噬菌体原液用无菌PBS进行倍比稀释，各取100 µL稀释过的滤液和200µL过夜培养的宿主菌23715混合，共孵育5 min，然后将混合液加入到7 mL 45℃半固体培养基中，充分混匀后倾倒于固体琼脂培养基上，待其凝固，放置37℃温箱中孵育16-20 h，获得单个噬菌斑。

实施例2

噬菌体扩增和纯化

在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌的移液器的枪头挑取直径较大、圆且透亮的单个噬菌斑，接种于5 mL小肠结肠炎耶尔森菌扩增培养基中，加入噬菌体宿主菌液200 µL，混匀，室温作用15 min，37℃培养10～14 h，12000 g，4℃ 离心10 min，取上清；重复双层平板实验4-5次，如此反复挑取4-5次单个噬菌斑，将噬菌体纯化成大小一样的噬菌斑。

取1 mL新鲜培养的宿主菌，加300 µL噬菌体裂解液（以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1:1、1:10和1:100的比例）。37℃温育20 min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入800 mL 小肠结肠炎耶尔森菌扩增培养基，再加入CaCl₂ 母液至终浓度1.25 mM，37℃摇振培养6 ~ 8 h，12000 g，4℃ 离心10 min，取上清，即为噬菌体裂解液。

PEG纯化：在噬菌体裂解液中加入RNase A、DnaseⅠ至终浓度均为1 µg/mL，室温放置30 min；加入NaCl至终浓度为1 mol/L，混合均匀后，冰浴1-2 h；4℃ 离心机，8000 g/min离心15-20 min后收集上清；按每100 mL 10 g的量加入PEG-8000，轻轻搅拌使其溶解，冰浴2 h以上（最好过夜），使噬菌体在PEG-8000作用下形成沉淀；4℃ 离心机，12000 g/min离心10-20 min，回收沉淀的噬菌体颗粒，加2 mL SM液，充分洗涤沉淀，室温作用1 h；加入等体积的氯仿抽提，温和振荡30 s；4℃ ，5000 g离心10 min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体。

CsCl等密度梯度离心纯化: 按表制备CsCl梯度液，按照从高密度到低密度的顺序，在5 mL半透明聚丙烯酰胺高速离心管中依次加入各梯度液1 mL；将噬菌体浓缩液700 µL缓慢加入到CsCl梯度液的上面，放到4℃高速离心机中，35000 g/min平离心3 h；离心结束后待真空下降为0时，打开仓门，取出样品，关机；样品下端有一层蓝色带，用细针头从带侧面插入，小心吸取；将样品置于透析袋中，用10 mM Tris-HCl，pH为7.4，100 mM MgCl ₂ 缓冲液进行透析，2 L一次（10-14 kd）；最终将样品吸出，测定噬菌体效价（图1）。

表1 CsCl梯度液制备

采用双层平板法检测噬菌体效价：将以上纯化的噬菌体液进行10倍梯度稀释，取

相应的几个梯度的噬菌体稀释液各100 µL与宿主菌液200 µL充分混匀，铺双层琼脂平板，37℃恒温培养10 h左右，对每个琼脂平皿进行噬菌斑计数。选择出现100-200左右噬菌斑的平皿，根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度即得噬菌体效价。

纯化的噬菌体在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTC M 2019504，保藏日期为2019年7月1日，保藏名为vB_Yen_X1，保藏单位地址：中国武汉市武汉大学。

实施例3

噬菌体vB_Yen_X1透射电镜观察

取实施例2中PEG纯化的噬菌体做电镜观察，具体操作步骤为：加10 µL 样本滴在铜网上，待其沉淀15 min， 用滤纸吸去多余的液体，用 2%的磷钨酸（PTA）染色1-2 min，干燥后使用透射电镜（日立H-7650）观察；观测结果如图2 所示，头部呈正二十面体，头部直径约为64 nm，尾长约为94 nm。根据国际病毒分类委员会(ICTV) 2005年发表的《病毒分类—国际病毒分类委员会第八次报告》，vB_Yen_X1属于长尾病毒科（ Myoviridae ）。

实施例4

噬菌体vB_Yen_X1的一步生长曲线

一步生长曲线测定：将培养至对数期的宿主菌与噬菌体按照最佳MOI的比例进行混合，在4℃放置15 min，用新鲜小肠结肠炎耶尔森菌扩增培养基将沉淀悬起，将悬液雨37℃振荡培养，每隔10 min取一次样品测定噬菌体的滴度，从而绘制出噬菌体感染细菌的一步生长曲线，结果如图3所示。

实施例5

噬菌体vB_Yen_X1宿主谱分析

将实施例2获得的噬菌体vB_Yen_X1效价调整为10 ⁸ pfu/mL备用。实验选择多株鼠疫耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌及其他常见的细菌，对噬菌体vB_Yen_X1的杀菌谱进行分析，具体操作如下：

空斑实验测定：分别取待测菌株的过夜培养物100 µL，滴加在1.5% 小肠结肠炎耶尔森菌扩增培养基平板中央，用涂布棒分别将它们涂制成均匀的菌苔。取10 µL噬菌体vB_Yen_X1滴加在菌苔表面，待液滴干燥后倒置于37℃培养12 ~ 16 h，观察结果。若空斑试验结果呈阳性，则继续进行噬斑试验。

噬斑实验测定：取噬菌体原液1 mL，进行一系列的10倍稀释。取10^-2、10^-4和10^-6稀释液各0.1 mL分别与待测菌株的过夜培养物0.1 mL混匀，室温作用15 min后，加入约7 mL，45℃，半固体培养基中，混匀后迅速倾倒入1.5% 小肠结肠炎耶尔森菌扩增培养基平板上层，摇匀平置10 min，待其凝固，置于37℃温箱培养8 h后观察结果（表2）。

表2. 噬菌体vB_Yen_X1宿主谱分析

菌株类型	菌株数量	可裂解菌株数量	不可裂解菌株数量
				小肠结肠炎耶尔森菌	51	20	31
鼠疫耶尔森菌	184	180	4
				大肠杆菌	7	0	7
金黄色葡萄球菌	8	0	8
				肺炎克雷伯菌	5	0	5
绿脓杆菌	4	0	4
				鲍曼不动杆菌	2	0	2
粘质沙雷菌	3	0	3

本发明噬菌体vB_Yen_X1对小肠结肠炎耶尔森菌和鼠疫耶尔森菌均具有极宽的感染和杀菌谱，裂解谱如表2所示，鉴于此，该噬菌体可用于有效净化鼠疫疫源地、紧急预防和控制鼠疫耶尔森菌感染及其引发的鼠疫。

Claims (2)

1.一株小肠结肠炎耶尔森菌噬菌体vB_Yen_X1，保藏名为Yersinia enterocolitica phage vB_Yen_X1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2019504；保藏时间为：2019年7月1日。

2.用于杀灭鼠疫耶尔森菌及控制鼠疫流行的药物组合物，其特征在于包含权利要求1所述的小肠结肠炎耶尔森菌噬菌体vB_Yen_X1作为活性成分。

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