CN104140957A - 一株可裂解多重耐药铜绿假单胞菌的噬菌体及其治疗感染的应用 - Google Patents

Abstract

一株可裂解多重耐药铜绿假单胞菌的噬菌体及其治疗感染的应用。本发明公开了一株可裂解多重耐β-内酰胺类、氨基糖苷类和头孢菌素类抗生素铜绿假单胞菌的噬菌体，且将此株噬菌体(铜绿假单胞菌噬菌体，拉丁名Pseudomonas aeruginosa Bacteriophage)命名为PaP106号。于2012年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉市，武汉大学，布达佩斯条约保藏单位)，保藏号CCTCC NO：M2012200。本专利申请人基于提供一种新型抗感染疗法的目的，证实该分离纯化的噬菌体可在体内外裂解多株多重耐β-内酰胺类(包括碳青霉烯类)、氨基糖苷类和头孢菌素类抗生素的铜绿假单胞菌，从而验证了该噬菌体在临床治疗多重耐药铜绿假单胞菌感染中的可行性，为临床耐药菌感染提供了新的治疗途径。

Description

一株可裂解多重耐药铜绿假单胞菌的噬菌体及其治疗感染的应用

技术领域：

本发明专利涉及可以裂解临床多重耐β-内酰胺类(包括碳青霉烯类)、氨基糖苷类和头孢菌素类抗生素铜绿假单胞菌的噬菌体及其在治疗临床耐药株感染的应用。 

背景技术：

噬菌体由和Twort在1907年和D，Herelle在1909年发现。凡存在细菌的场所就可能有相应的噬菌体存活。20世纪初，由于抗生素的发现及临床应用为治疗细菌感染提供了有效途径，以至于对噬菌体生物制剂的研究放缓了步伐。但随着多重耐药致病菌威胁的不断加大，人们需要寻找抗生素以外的疗法治疗感染性问题。因此，噬菌体疗法又引起人们广泛关注。 

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分噬菌体能致相应宿主菌的裂解死亡，故称噬菌体。作为一种细菌病毒，噬菌体具有病毒基本特性和严格的宿主特异性。噬菌体的生长方式包括溶源性生长和裂解性生长。溶源性生长是指噬菌体侵染宿主细菌，其遗传物质与宿主菌核酸相整合，且随着宿主菌增殖而增殖，不引起宿主菌裂解死亡；裂解性生长是指噬菌体进入宿主细胞，破坏其遗传物质的稳定性和完整性，并利用宿主细胞的蛋白质合成其外壳，从而组装成新的完整的噬菌体颗粒从宿主细胞中释放出，伴随着宿主菌的崩解。其释放出的噬菌体颗粒又侵染其他细胞，循环往复，实现链式反应，达到杀死细菌而治疗感染的目的。此外，噬菌体疗法因其特异性强(即噬菌体可专一性针对宿主菌起裂解作用，而对正常体细胞和人体常驻菌群无毒性作用)、治疗副作用少、潜伏期短、具有指数增殖能力、裂解量大、细菌不易对噬菌体产生抗性等优势得到人们的广泛关注。国内也有一些关于铜绿假单胞菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体等噬菌体的相关研究和报道：李明等《铜绿假单胞菌噬菌体PaP1生物学特性的研究》确定了分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP1的形态大小、核酸类型、嗜菌特性、最佳感染复数和一步生长曲线等基本生物学特性。张克斌等《铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其基因组学研究》成功分离了3株铜绿假单胞菌噬菌体，并对其中两株(一株为溶源性噬菌体，一株为裂解性噬菌体，二者具有相同的宿主菌)进行了基因组测序。同时，对已完成测序的PaP3展开了基因组学研究和某些基因功能的研究。周莹冰等《铜绿假单胞菌噬菌体PaP3生物学特性的研究》测定了铜绿 假单胞菌噬菌体PaP3的最佳感染复数、一步生长曲线和吸附值及交叉吸附值等基本生物学特性。郑文旭等《铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性的分析》分离出3株铜绿假单胞菌噬菌体(PaP-c01、PaP-c02和PaP-c03)。其中，噬菌体PaP-c01能裂解6株铜绿假单胞菌，表现相对广泛的裂解谱；其生长曲线显示感染宿主菌的潜伏期为30min，且证实了该噬菌体具有较宽的裂解范围，为噬菌体作为生物制剂用于体内外抗感染的治疗打下基础。成伏波等《噬菌体疗法对烧伤合并铜绿假单胞菌感染小鼠的治疗作用》进行了进一步的动物实验，在铜绿假单胞菌感染实验小鼠后，利用分离纯化的铜绿假单胞菌噬菌体行腹腔注射治疗，证实了噬菌体对烧伤感染小鼠有明显的治疗作用。胡北等《耐亚胺培南铜绿假单胞菌噬菌体分离及其生物学特性分析》和《噬菌体治疗实验性小鼠耐亚胺培南铜绿假单胞菌感染的研究》对可裂解耐亚胺培南铜绿假单胞菌的噬菌体进行了研究。前者从污水内分离耐亚胺培南铜绿假单胞菌噬菌体并进行分析，筛选出2株相对广谱噬菌体φA392、φ1093，并对其生物学、形态学进行研究，证实了该分离的噬菌体裂解性较强、裂解谱较宽，潜伏期较短，可供临床抗感染治疗的研究；后者以小鼠为实验对象建立感染模型，应用宽噬噬菌体进行治疗，结果发现该噬菌体可有效杀灭铜绿假单胞菌以提高小鼠生存率。并且发现延迟治疗3h的小鼠仍有40％的生存率。杨洪江等的发明(专利公开号：CN102199576A----降解铜绿假单胞菌生物被膜噬菌体的分离与筛选方法)提供了铜绿假单胞菌噬菌体的扩增、分离、保存方法，还针对噬菌体进行了降解菌株生物被膜的实验，得到了降解力强的噬菌体C12；孙建华等的发明(专利公开号：CN101962631A----耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备方法)改良了绿脓杆菌噬菌体的分离纯化方法；胡俊波等的发明(专利公开号：CN1699559A----一株耐亚胺培南绿脓杆菌噬菌体及其用于治疗耐亚胺培南绿脓杆菌感染的用途)分离出的宽噬绿脓杆菌噬菌体φA392用于耐亚胺培南的绿脓杆菌感染的治疗。张智英等的发明(专利公开号：CN101220349A----一种分离的大肠杆菌噬菌体及其作为生物杀菌剂在食品和抗感染中的应用)分离出一种大肠杆菌噬菌体作为生物杀菌剂应用于抗感染；何俭等的发明(专利公开号为：一株治疗金黄色葡萄球菌感染的噬菌体)分离出的一株金黄色葡萄球菌噬菌体用于治疗金葡菌感染及处理被金葡菌污染的食品、饲料及器皿等。但是当前，宽噬噬菌体的分离筛选仍然较少，尤其裂解多耐药菌的宽噬噬菌体的分离极少，大大限制了临床应用研究。为此，我们从临床患者排泄物及医院环境、居民生活环境中广泛采样，分离铜绿假单胞菌毒性噬菌体，筛选得到可裂解多重耐β-内酰胺类(包括碳青霉烯类)、氨基糖苷类和头孢菌素类抗生素铜绿假单胞菌的宿主谱宽的噬菌体，从而为临床解决铜绿假单胞菌耐药性菌株感染提供新的治疗途径。 

本发明对新分离出的铜绿假单胞菌噬菌体及临床耐β-内酰胺类(包括碳青霉烯类)、氨基糖苷类和头孢菌素类抗生素铜绿假单胞菌(本发明采用铜绿假单胞菌Pa1110333)进行研 究，从而实现本发明。 

发明内容：

本发明经过广泛的研究，以提供一种治疗临床多重耐β-内酰胺类(包括碳青霉烯类)、氨基糖苷类和头孢菌素类抗生素铜绿假单胞菌感染的手段，结果分离到一株能裂解铜绿假单胞菌的宽谱噬菌体PaP106号。本发明人基于提供一种新的生物治疗手段为目的，对其进行进一步研究，证实了该噬菌体可裂解多株临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌，从而为临床治疗耐药菌感染提供新的治疗途径。 

本发明目的在于提供一种新型生物制剂，即利用分离纯化所得的宽噬噬菌体独特的生物活性，以有效地解决临床耐β-内酰胺类(包括碳青霉烯类)、氨基糖苷类和头孢菌素类抗生素铜绿假单胞菌感染的问题。 

本发明的耐β-内酰胺类(包括碳青霉烯类)、氨基糖苷类和头孢菌素类抗生素铜绿假单胞菌噬菌体于2012年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉市，武汉大学，布达佩斯条约保藏单位)，分类命名为铜绿假单胞菌噬菌体PaP106(Pseudomonas aeruginosa Bacteriophage PaP106)，保藏号CCTCC M 2012200。 

铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)在自然界分布广泛，属于人体常见条件致病菌。患者长期使用免疫抑制剂、激素，进行放化疗等致机体免疫力低下，以及手术后或某些诊断性或治疗性操作如行导尿管插管等，均易导致本菌感染。故认为该菌为院内感染的重要致病菌之一。 

传统的铜绿假单胞菌抗生素疗法中，最为有效的有碳青霉烯类药物，如亚胺培南、美罗培南；β-内酰胺类抗生素，如哌拉西林作用较好；第三代头孢菌素中以头孢他啶、头孢哌酮的作用较强；氨基糖苷类有庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星和异帕米星，在临床治疗中使用也较为广泛。但是由于铜绿假单胞菌耐药株的广泛存在，传统的抗生素疗法受到了极大的限制。2010年中国CHINET铜绿假单胞菌耐药性监测显示，我国临床分离的铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药性仍处于较高水平，不同地区、不同医院的分离株对抗菌药物的耐药性相差较大，ICU应是监控重点。而碳青霉烯类抗生素常作为临床治疗多耐药的铜绿假单胞菌感染的最后一道防线，一旦耐碳青霉烯类的铜绿假单胞菌大量出现，我们将对其感染的治疗将进入极其困难的地步。目前，耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌感染在临床上已非常多见。在国内张克斌《铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其基因组学研究》、周莹冰《铜绿假单胞菌噬菌体PaP3生物学特性的研究》、成伏波《噬菌体疗法对烧伤合并铜绿假单胞菌感染小鼠的治疗作用》、郑文旭《铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性的分析》、黄建军《铜绿假单胞菌噬菌体PaP2生物学特性及其基因组学的研究》等分离到的噬菌体主要裂解铜绿假单胞菌 敏感菌株；而胡北《耐亚胺培南铜绿假单胞菌噬菌体分离及其生物学特性分析》《噬菌体治疗实验性小鼠耐亚胺培南铜绿假单胞菌感染的研究》和胡俊波等的发明(专利公开号：CN1699559A----一株耐亚胺培南绿脓杆菌噬菌体及其用于治疗耐亚胺培南绿脓杆菌感染的用途)提供了宽噬绿脓杆菌噬菌体，并证实了噬菌体可作为新的治疗手段应用临床抗绿脓杆菌感染治疗。但是，上述发明和文献报道的噬菌体有以下局限性：①上述分离纯化的宽噬噬菌体裂解谱有限。虽然其对耐亚胺培南的铜绿假单胞菌有效，却未涉及临床更为常用的抗生素，如β-内酰胺类、氨基糖苷类、头孢菌素类、喹诺酮类抗生素等，而本发明所研究的铜绿假单胞菌均为多重耐药菌。②该噬菌体只是对单一耐药的铜绿假单胞菌有裂解作用，未证实是否对多重耐药的铜绿假单胞菌亦有效。而本发明分离的噬菌体已证实不仅对单一耐药的铜绿假单胞菌有裂解作用，尤其对多重耐药的铜绿假单胞菌的裂解作用更加明显。③该噬菌体对临床分离的单一耐药铜绿假单胞菌的裂解率为75％，而本发明所分离出的噬菌体对临床多重耐药的铜绿假单胞菌(本发明所涉及的所有菌株均为多重耐药菌)的裂解率为81.5％(对多重耐β-内酰胺类、氨基糖苷类以及头孢菌素类铜绿假单胞菌27株中的22株有裂解作用)，明显优于申请专利和文献报道噬菌体的裂解率。基于上述优点，本发明可以在临床上获得更为广泛的应用。 

本发明具有体内外抗感染的治疗性作用。根据本发明，耐β-内酰胺类(包括耐碳青霉烯类)、氨基糖苷类和头孢菌素类铜绿假单胞菌噬菌体可在双层琼脂平板上形成直径约4mm的透亮噬斑，且对于临床所收集的多重耐药铜绿假单胞菌均表现出较强的裂解作用。其所能裂解的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌为：1110333、1201110、858701、11077223、1110537、1205830、1110378、1110552、1204305、1110377、1204295、1203327、1206296、1110709；耐β-内酰胺类铜绿假单胞菌为：1110333、1110552、1110537、1206031、858701、1110906、1203541、1203944、1110377、1110709、1203327、1204295、1110378、1203944、1204305、1206296、1205446、1110490；耐氨基糖苷类铜绿假单胞菌为：1110333、1204295、858701、11077223、1110906、1203944、1203541、1110377、1206031、1203327、1205830、1110251、1110552、1205446、i201110、1110490；耐头孢菌素类铜绿假单胞菌为：1204295、1110709、1203327、11077223、1203944、1110333、1206031、1205830、1110552、1110251、1201110、1110378、1110906、1204305、1110490；耐β-内酰胺类、氨基糖苷类铜绿假单胞菌为：1205446、858701、1203541、1110377、1203944；耐β-内酰胺类、头孢菌素类铜绿假单胞菌为：1203944、1110709、1110378、1204350；耐氨基糖苷类、头孢菌素类铜绿假单胞菌为：11077223、1205830、1110251、1201110；耐β-内酰胺类、氨基糖苷类、头孢菌素类铜绿假单胞菌为：1110333、1110552、1206031、1203327、1110490、1110906、1204295。 

本发明噬菌体，在体外加菌培养滴度可达1×10¹⁰pfu·ml^-1，杀菌作用强大、迅速，为一种高效抗感染物质，具有潜在临床应用价值。 

本发明进行动物毒理实验采用的铜绿假单胞菌为Pa1110333。该菌株经过药敏试验，证实其耐药性如表1所示。符合本发明的要求。 

表1.Pa1110333耐药性 

(注：耐药记为“+”，中介记为“±”，敏感记为“-”) 

故本发明采用Pa1110333号铜绿假单胞菌进行进一步实验。 

本发明所采用的培养基如下：LB培养基：1％Tryptone、0.5％Yeast Extract和1％NaCl。固体培养基：1％Tryptone、0.5％Yeast Extract、1.5％Agar和1％NaCl。顶层培养基：1％Tryptone、0.5％Yeast Extract、0.7％Agar和1％NaCl；SM Buffer由5.2g NaCl、2g MgSO₄·7H₂O，50ml 1mol/LTris·HCl(pH＝7.5)配置而成。 

生物学特性： 

噬菌体PaP106(CCTCC M2012200)具有以下生物学特性： 

1.噬菌体分离纯化： 

PaP106号噬菌体在双层固体营养琼脂平板上可形成直径约4mm的透亮噬斑，周围无晕环(图1)； 

2.透射电镜观察： 

电子显微镜下观察负染的噬菌体颗粒(图2)，该噬菌体为正多面体的头部结构，直径53.3nm；有尾，直径100.0nm。 

3.PaP106噬斑直径、效价及毒力(MIC)测定：实验结果见表2。 

表2.PaP106噬斑直径、效价及毒力(MIC) 

4.一步生长曲线： 

Ellis等创立了一步生长曲线实验方法，即先以适量的噬菌体感染细菌，待噬菌体吸附细菌(约10分钟)后，高倍稀释噬菌体-宿主菌混悬液，或以抗噬菌体血清处理该混合物使吸附停止。继续培养并测量混合液中噬菌体滴度，以感染时间为横坐标，噬菌体滴度为纵坐标，绘制出特征性的噬菌体一步生长曲线。从该曲线中，可以获得噬菌体繁殖的三个特征性数据：潜伏期(latent period)、爆发期(burst period)和爆发量(burst size)(也称裂解量)。潜伏期是指噬菌体吸附于宿主菌之后到子代噬菌体被释放到细菌体外环境所需的最短时间，其值等于从噬菌体吸附细菌之后开始，到培养体系中噬菌体滴度第一次大量急速上升之间的时间。而这种培养体系中噬菌体数量迅速增加持续的时间，即噬菌体的爆发期，也称上升期(rise period)。爆发量是指每个受染细胞所产生的子代噬菌体的平均数目，其值等于噬菌体滴度急速上升末期培养体系中的噬菌体滴度与被感染细菌的初始浓度之比。潜伏期和爆发期的长短以及爆发量的大小与噬菌体、宿主菌及环境条件都有关。本发明参考了黄建军等《铜绿假单胞菌噬菌体PaP2生物学特性及其基因组学的研究》，绘制出可裂解多重耐药铜绿假单胞菌的噬菌体PaP106号的一步生长曲线(图3)，得到噬菌体感染宿主菌的潜伏期为60min左右，爆发期为50min左右，爆发量约为174。 

5.裂解谱： 

结果显示，本实验所分离的铜绿假单胞菌噬菌体，对临床多重耐药铜绿假单胞菌有不同的裂解结果。其中已保藏编号的噬菌体CCTCC M2012200裂解谱较广，并且潜伏期短，裂解量大，明显优于其他实验室分离纯化株，故较为典型。可作为噬菌体疗法治疗铜绿假单胞菌感染生物制剂的理想选择株之一，实验结果见表3。 

表3.PaP106对临床耐药菌的裂解谱 

(注：“+”表示裂解，“-”表示不裂解) 

6.pH稳定性： 

经实验测定噬菌体PaP106在pH＝7～8范围内有较高活性，在酸性环境下其裂解速度明显降低，实验结果见图4； 

7.热稳定性： 

PaP106在70℃以下依然保持活性，大于80℃活性丧失，实验结果见表4。 

表4.PaP106热稳定性 

(注：“++”表示双层琼脂平板完全透亮，即噬菌体大量存活且裂解性强；“+”表示表示双层琼脂平板上有较多噬斑；“-”表示双层琼脂平板有大量细菌生长，完全不透亮，即噬菌体死亡，无噬斑出现。) 

8.有机溶剂敏感性： 

噬菌体PaP106经氯仿处理13h后，各梯度平板菌未出现噬斑，说明PaP106对氯仿有较高的敏感性。结果见表5： 

表5.PaP106有机溶剂敏感性 

(注：“-”表示无噬斑出现，“+”表示有噬斑出现) 

9.动物毒性实验： 

本发明人已证实，PaP106号噬菌体可在体内外有效裂解耐β-内酰胺类(包括碳青霉烯类)、氨基糖苷类、头孢菌素类抗生素铜绿假单胞菌(即Pa1110333号菌株)，治疗铜绿假单胞菌感染引起的小鼠菌血症。实验表明，小鼠腹腔注射最小致死剂量菌液后，腹腔注射高滴 度噬菌体，最后80％小鼠存活；中、低滴度噬菌体治疗感染小鼠，小鼠有效生存时间可明显延长。该实验证实了PaP106号噬菌体可有效延长小鼠生存时间，起到治疗性作用，有较强的临床应用价值。 

附图说明：

图1：PaP106号噬斑图片。可见双层固体营养琼脂平板上形成直径约4mm的透亮噬斑，周围无晕环。 

图2：PaP106号噬菌体透射电镜图片。该噬菌体为正多面体的头部结构，直径53.3nm；有尾，直径100.0nm。 

图3：PaP106号噬菌体一步生长曲线。该噬菌体感染宿主菌的潜伏期为60min左右，爆发期为50min左右，爆发量约为174。 

图4：不同pH下PaP106噬斑数。PaP106号噬菌体在pH＝7～8范围内有较高活性，在酸性环境下其裂解速度明显降低。 

具体实施方式：

标本的收集处理： 

取甘肃省兰州市瑞德大道污水，每次3000ml，加入0.333gCaCl₂。另加入3ml铜绿假单胞菌标准株菌液，次日用0.22μm滤膜过滤除菌。吸取处理后污水200ml，加液体LB培养基50ml，宿主菌悬液1.2ml，混匀后置于37℃温箱过夜培养。次日取扩增液10ml，2000r/min离心15mim，上清液即为含有铜绿假单胞菌噬菌体的原液。取原液0.3ml，标准宿主菌液0.6ml，混匀后置于室温下培养15min后加入47℃半固体2ml，混匀后倒入固体琼脂平板上制成双平板，37℃温育4～6h后观察噬斑。若有噬斑出现，则表明铜绿假单胞菌噬菌体初步分离成功。另设空白对照板。挑取平板上生长8h以内，边缘明显的单个透亮噬斑，接种于2mi LB液体培养基中，室温放置1～2h后，4℃过夜。次日取上述液体0.1ml加入50μl标准铜绿假单胞菌悬液与2ml LB培养基，混匀后室温放置20～30min后，在37℃温箱培养6～8h。将混合液用0.22μm的滤膜过滤除菌。 

噬菌体的分离、纯化： 

挑取平板上生长8h以内，边缘明显的单个透亮噬斑，接种于2ml LB培养基中，室温放置1～2h后，4℃过夜，次日取上述液体0.1ml加入50μl标准铜绿假单胞菌菌悬液与2ml LB培养基，混匀后室温放置20-30min后，在37℃温箱培养6～8h。将混合液用0.22μm的滤膜过滤除菌。取滤液0.3ml，加标准铜绿假单胞菌菌悬液0.3ml混匀，室温放置15min，加入47℃融化半固体琼脂培养基2ml混匀，铺制双层平板，凝固后，37℃培养4～6h，观察噬斑。重复三次。待噬斑出现后，挑取数个清晰噬斑分别接种于2ml LB中，4℃避光保存备用。 

噬菌体的效价测定： 

取上述保存液1ml，连续十倍稀释。取后三个梯度稀释液200μl，与400μl菌液混合，室温放置15min，分别双层琼脂法制板，每个稀释梯度设置3个平行板，37℃培养5h后计数噬斑。滴度＝(噬斑数×稀释倍数×10)÷2(单位：pfu·ml^-1)。结果表明，PaP106号噬菌体滴度为6.7×10⁹pfu·ml^-1，在体外加菌培养滴度可达1×10¹⁰pfu·ml^-1。 

噬菌体裂解谱测定： 

从临床收集多重耐药铜绿假单胞菌，制作菌悬液。取噬菌体保藏液0.1ml加入50μl标准铜绿假单胞菌菌悬液与2ml LB培养基，混匀后室温放置20～30min后，在37℃温箱培养6～8h，0.22μm的滤膜过滤除菌，取滤液0.3ml，加临床耐药铜绿假单胞菌悬液0.3ml混匀，室温放置15min，加入47℃融化半固体琼脂培养基2ml混匀，铺制双层平板，凝固后，37℃培养4～6h，观察噬斑。依此法，对各株耐药铜绿假单胞菌进行裂解性测定，经选取得到宽噬噬菌体，命名为PaP106号。并于2012年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉市，武汉大学，布达佩斯条约保藏单位)，分类命名为铜绿假单胞菌噬菌体PaP106(Pseudomonas aeruginosa BacteriophagePaP106)，保藏号CCTCC M 2012200。 

噬菌体毒力测定： 

噬菌体的毒力以最小抑菌浓度(MIC)表示。取噬菌体原液，连续10倍稀释。取各稀释倍数的稀释液200μl，各加入4ml Pa标准株菌液，记录12小时内使菌液变澄清的最小浓度，即为该噬菌体MIC。结果表明，PaP106的MIC为1×10³pfu·ml^-1。 

宽噬噬菌体对pH敏感性的测定： 

配制pH为4，5，6，7，7.3，7.5，8，9的LB液体培养基，取滴度约为1×10⁶pfu·ml^-1噬菌体液200μl，分别与上述不同pH值的LB液体培养基混合，37℃培养4h后，各取200μl噬菌体液与400μl Pa标准株菌液混合后用双层琼脂法评价其效价。绘制pH敏感度曲线。结果表明，PaP106在pH＝7～8范围内有较高活性，且在酸性环境下活性明显降低。 

宽噬噬菌体热稳定性实验： 

取滴度约为6.7×10⁹pfu·ml^-1噬菌体液200μl，加入到2ml LB培养基中，分别在37℃，40℃，45℃，50℃，60℃，70℃，80℃水浴条件下孵育1h。热处理后取处理液200μl，与400μl菌液混合后双层琼脂法评价滴度，并于37℃下培养。5h后计数噬斑。结果表明，PaP106在70℃以下依然保持活性，大于80℃活性丧失。 

宽噬噬菌体对氯仿敏感性实验： 

取滴度约为1×10⁹pfu·ml^-1噬菌体液1ml，用LB培养基连续10倍稀释5次，取后三个梯度的稀释液各1ml，加入50μl的氯仿，使其浓度达到0.5％，混匀后置于37℃温箱中温育13h。取处理液各200μl与400μl菌液混合，双层琼脂法评价滴度，5h后观察有无噬斑出现。另设不加氯仿的空白对照。结果证实PaP106对氯仿有较高的敏感性。 

一步生长曲线测定： 

①制备铜绿假单胞菌噬菌体PaP106培养液，测定噬菌体的滴度(pfu·ml^-1)； 

②制备对数期生长的铜绿假单胞菌菌液，以不含细菌的LB液为空白调零，测定其OD₆₀₀值，计算出细菌的浓度(初始菌液浓度4.3×10⁶cfu·ml^-1)； 

③在3.3ml总体积LB液中，加入噬菌体及其宿主菌。混匀，37℃温育15min。取出0.5ml，13000g离心30s，用微量加样器尽量吸去上清，再用1ml LB液洗涤2次(13000g离心30s)，弃上清。用预热的LB液混悬沉淀(总体积为6ml)并充分混匀，迅速置于37℃摇床中160rpm振荡培养，同时开始计时，在0时刻和每隔20min取出0.03ml，10000g离心2min，吸取上清用LB液倍比稀释后用双层琼脂法测定噬菌体滴度，测定双份复管结果取平均值，同时作宿主菌和噬菌体对照。 

④以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，得出PaP106的潜伏期、爆发期和爆发量(图3)； 

⑤根据图3可知，噬菌体感染宿主菌的潜伏期为60min左右，爆发期为50min左右，爆发量约为174。 

最小致死量(MLD)测定及PaP106治疗性作用实验： 

(一)MLD测定 

①昆明小鼠，清洁级，体重18-20g，由兰州大学动物实验中心提供。饲养于清洁饲养室，在室温下进行动物实验。将小鼠分为6组，每组4只，雌雄对半。 

②建立小鼠铜绿假单胞菌全身感染模型，以测定最小致死量(Minimum Lethal Dosage，MLD)。铜绿假单胞菌Pa1110333号于液体LB培养基中培养至OD₆₀₀＝0.4～0.8，即对数生长期。收集菌苔于高压蒸汽灭菌后的生理盐水中，1000r/min，10min离心三次，菌苔用无菌NS洗涤。该无菌NS液用于最小致死量(MLD)测定。 

③菌液计数。将所得的菌液10倍稀释6个梯度，后取其中一定量的菌液200ul平铺于固体营养琼脂培养基上，置于37℃恒温箱过夜培养后行菌落计数。得到菌液滴度为1.46×10⁸cfu·ml^-1。 

④菌液稀释分组。取一定量菌液，分别加入LB液体培养基，配成不同滴度梯度：1.5×10⁸cfu/ml，7×10⁷cfu/ml，5×10cfu/ml，3×10⁷cfu/ml，1.5×10⁷cfu/ml，9×10⁶cfu/ml。记为组1～组6。 

⑤注射药物。行小鼠等量不同滴度梯度的菌液腹腔注射，准确记录小鼠死亡时间及小鼠死亡数量。见表6。 

⑥结果表明，1.5×10⁸cfu/ml，7×10⁷cfu/ml，5×10⁷cfu/ml，3×10⁷cfu/ml，1.5×10⁷cfu/ml滴度的菌液均可致小鼠全部死亡，而滴度9×10⁶cfu/ml的菌液不会导致小鼠死亡。故本实验测定小鼠MLD为1.5×10⁷cfu/ml。 

表6.铜绿假单胞菌MLD剂量感染小鼠存活时间(min) 

(注：48h后依然生存记为“+”，48h内死亡记为“-”) 

(二）噬菌体治疗实验 

①MLD测定完成后，将实验小鼠分为四组(每组五只)，记为组A，组B，组C，组D。小鼠为昆明小鼠，清洁级，体重18-20g，由兰州大学动物实验中心提供。其中，组D为对照组。组A注射高滴度噬菌体(滴度6.7×10⁷cfu/ml)，组B注射中滴度噬菌体(滴度6.7×10⁶cfu/ml)，组C注射低滴度噬菌体(滴度6.7×10⁵cfu/ml)，组D注射等量无菌NS液。 

②组A、B、C行腹腔注射MLD量铜绿假单胞菌后，立即行另一侧腹腔注射PaP106号噬菌体；组D腹腔注射等量MLD滴度铜绿假单胞菌菌液后，立即行另一侧腹腔注射无菌NS液。30min观察一次小鼠健康状态，结果见表7。 

③结果表明，高滴度噬菌体治疗组小鼠观察48h以上，在出现精神萎靡之后，最后80％存活；中低滴度噬菌体治疗组小鼠有效生存时间明显延长。该实验证实了PaP106号噬菌体可有效延长小鼠生存时间，起到治疗性作用。 

表7.PaP106号噬菌体对行MLD剂量注射小鼠的治疗效应(min) 

Claims (3)

1.一株铜绿假单胞菌的噬菌体PaP106，其保藏号为：CCTCCM2012200，该噬菌体对临床多重耐β-内酰胺类(包括碳青霉烯类)、氨基糖苷类和头孢菌素类抗生素铜绿假单胞菌具有有效的裂解作用，该噬菌体是烈性的。 

2.权利要求1所述的铜绿假单胞菌的噬菌体(CCTCC M2012200)，其特征为具有较宽的宿主谱，能够裂解多重耐β-内酰胺类(包括碳青霉烯类)、氨基糖苷类及头孢菌素类抗生素的铜绿假单胞菌临床耐药菌。 

3.权利要求1所述的噬菌体作为一种用于治疗多重耐药铜绿假单胞菌感染的生物制剂的应用。