CN108721619B - 热休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭革兰氏阴性菌的方法 - Google Patents

热休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭革兰氏阴性菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了热休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭革兰氏阴性菌的方法。本发明公开的杀灭革兰氏阴性菌的方法包括：对待灭革兰氏阴性菌或含有待灭革兰氏阴性菌的液体施用抗生素，得到细菌与抗生素的混合物，抗生素对待灭革兰氏阴性菌的生长具有抑制作用；将混合物在大于25℃的环境中进行处理，杀灭待灭革兰氏阴性菌。实验证明，利用本发明的方法可以大幅度提高氨基糖苷抗生素对革兰氏阴性菌的杀菌效率，将有效降低病原菌产生耐药的风险，同时在达到同样治疗效果的前提下，减少用药量和给药时间，从而降低其副作用。

Description

热休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭革兰氏阴性菌的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，热休克提高氨基糖苷类抗生素杀灭革兰氏阴性菌的方法。
背景技术
细菌耐药是全球面临的重大公共健康问题。在中国，由于临床抗生素滥用以及养殖业抗生素的滥用，使得细菌耐药问题更为紧迫。提高现有抗生素的杀菌效率、快速高效杀灭病原菌是降低细菌耐药风险的重要手段。
大肠杆菌是一种重要的寄生于人体肠道的细菌，特殊情况下会致病，例如血液感染。同时大肠杆菌作为生物学研究常用的标准菌株，广泛用于细菌耐药机理的研究。铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，也是研究细菌耐药机理的常用菌株，其本身耐受卡那霉素。大肠杆菌和铜绿假单胞菌都属于革兰氏阴性细菌。
氨基糖苷抗生素是目前治疗需氧革兰氏阴性杆菌严重感染的重要药物，属于杀菌型抗生素。因其分子结构有一个氨基环醇类和一个或多个氨基糖分子，并由配糖键连接成苷而得名。氨基糖苷抗生素与细菌核糖体30S小亚基结合，导致细菌合成错误的蛋白质，产生有害的蛋白质聚集体，最终杀死细菌。这类抗生素在临床应用方面受到诸多限制，主要原因包括日益严重的细菌耐药现象以及该类抗生素的肾毒性和耳毒性。目前临床医用或养殖业使用的氨基糖苷抗生素主要包括：妥布霉素，卡那霉素，链霉素，庆大霉素，新霉素，阿米卡星，安普霉素，达苄霉素，奈替米星，西索米星等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高细菌的杀灭效率。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了杀灭细菌的方法，所述方法包括：对待灭细菌或含有待灭细菌的液体施用抗生素，得到细菌与抗生素的混合物，所述抗生素对所述待灭细菌的生长具有抑制作用；将所述混合物在所述待灭细菌的热休克温度下进行处理，杀灭所述待灭细菌。
所述细菌可为革兰氏阴性菌。
所述细菌具体可为大肠杆菌(如大肠杆菌BW25113)或铜绿假单胞菌(如铜绿假单胞菌PAO1)。
所述抗生素可为氨基糖苷抗生素。所述氨基糖苷抗生素为由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的抗生素。
所述抗生素具体可为卡那霉素、庆大霉素、链霉素或妥布霉素。
所述待灭细菌的热休克温度可为大于25℃的温度。
所述大于25℃的温度可为b1)或b2)：
b1)45～55℃；
b2)50℃。
所述处理的时间可为下述a1)、a2)、a3)或a4)：
a1)1-60分钟；
a2)2-50分钟；
a3)3-10分钟；
a4)5分钟。
所述混合物中所述抗生素的浓度可为25-100μg/ml。
所述混合物中所述抗生素的浓度具体可为30μg/ml。
本发明中的杀灭细菌的方法为非治疗动物疾病目的的杀灭细菌的方法。
实验证明，利用本发明的方法可以提高细菌的杀灭效率。针对大肠杆菌，和常温(25℃)处理相比，45℃、50℃或55℃下处理(以妥布霉素为例)的杀菌效率分别能提高2、4和5个数量级；针对铜绿假单胞菌，45℃、50℃或55℃下(以妥布霉素为例)的杀菌效率分别能提高1、4和5个数量级。这些结果表明，利用本发明的方法可以大幅度提高氨基糖苷抗生素的杀菌效率。这对降低病原菌产生耐药的风险具有重要意义，同时在达到同样治疗效果的前提下，可以减少用药量和给药时间，从而降低其副作用。
附图说明
图1为氨基糖苷类抗生素在热休克温度(55℃、50℃、45℃)和常温25℃下杀灭大肠杆菌效率的比较。图中，每个处理下的6个菌落图从左至右分别为稀释度分别为105、104、103、102、10和1下的菌落图。
图2为氨基糖苷类抗生素在热休克温度(55℃、50℃、45℃)和常温25℃下杀灭铜绿假单胞菌效率的比较。图中，每个处理下的6个菌落图从左至右分别为稀释度分别为105、104、103、102、10和1下的菌落图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的大肠杆菌E.coli.K-12 BW25113(Baba T.et al.(2006)Construction of Escherichia coli K‐12 in‐frame,single‐gene knockout mutants:the Keio collection.Mol Systems Biol 2(1),1-11,doi:10.1038/msb4100050.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用)。
下述实施例中的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1(Kindrachuk et al.(2011)Involvement of an ATP-dependent protease,PA0779/AsrA,in inducing heat shockin response to tobramycin in Pseudomonas aeruginosa.Antimicrob AgentsChemother 55(5),1874-1882.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、热休克增强氨基糖苷类抗生素杀灭大肠杆菌的效率
1、活化大肠杆菌(E.coli.k-12BW25113，大肠杆菌k-12BW25113)：吸取保存于-80℃冰箱中的大肠杆菌BW25113的20％甘油菌液1μl，加至1ml LB液体培养基中，于37℃摇床(250rpm)培养到平台期，将得到的菌液稀释1000倍后接种于10ml LB液体培养基中，37℃摇床(250rpm)培养到对数期(OD600＝0.8)，得到大肠杆菌培养液。
2、取步骤1得到的大肠杆菌培养液离心(13000g，2min)，去上清，将菌体沉淀重悬在与大肠杆菌培养液等体积的生理盐水(0.9％NaCl的灭菌水溶液)中后，分装于无菌离心管中，每管分装有100μl菌液；
将装有菌液的离心管随机分为五组，即无抗生素组、卡那霉素组、庆大霉素组、链霉素组和妥布霉素组，无抗生素组3个装有菌液的离心管(记为CK1、CK2和CK3)，其余每组3个装有菌液的离心管；
向卡那霉素组中的每个离心管中添加卡那霉素，卡那霉素在菌液中的浓度为50μg/ml，设置三个离心管，将卡那霉素浓度为50μg/ml的三个离心管分别记为50-K1、50-K2和50-K3；
向庆大霉素组中的每个离心管中添加庆大霉素，庆大霉素在菌液中的浓度为25μg/ml，设置三个离心管，将庆大霉素浓度为25μg/ml的三个离心管分别记为25-G1、25-G2和25-G3；
向链霉素组中的每个离心管中添加链霉素，链霉素在菌液中的浓度为100μg/ml，设置三个离心管，将链霉素浓度为100μg/ml的三个离心管分别记为100-S1、100-S2和100-S3；
向妥布霉素组中的每个离心管中添加妥布霉素，妥布霉素在菌液中的浓度为25μg/ml，设置三个离心管，将妥布霉素浓度为25μg/ml的三个离心管分别记为25-T1、25-T2和25-T3；
将CK1、50-K1、25-G1、100-S1和25-T1常温25℃温浴5min(作为对照)；将CK2、50-K2、25-G2、100-S2和25-T2于55℃下温浴热处理3min；将CK3、50-K3、25-G3、100-S3和25-T3于55℃下温浴热处理5min。
3、步骤2完成后，将处理后的菌液离心(10000g，1min)，去除上清液，然后用100μl100mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体，洗涤两次后，再利用100μl100mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体。
4、步骤3完成后，将得到的菌液按照每次10倍的梯度用100mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)稀释，稀释梯度为10、102、103、104、105，每个稀释度取5μl菌液点滴在LB固体培养基六方格平板上，置于37℃温箱培养12小时后，检查细菌死亡，并进行菌落计数，计算大肠杆菌经处理后的存活率。
5、重复步骤2-4，其中热处理温度由55℃替换为50℃，将处理时间3min替换为10min，将处理时间5min替换为15min，常温处理的时间由5min替换为15min，其他步骤均相同。
6、重复步骤2-4，其中热处理温度由55℃替换为45℃，将处理时间3min替换为50min，将处理时间5min替换为60min，常温处理的时间由5min替换为60min，其他步骤均相同。
结果如图1和表1所示。
表1、不同温度及抗生素处理下大肠杆菌的存活率与相对杀菌效率
Figure BDA0001687999000000041
Figure BDA0001687999000000051
注：相对杀菌效率＝热休克下(即热处理下)无抗生素的存活率×常温下有抗生素的存活率/热休克下(即热处理下)有抗生素的存活率。
结果显示，将含有妥布霉素的菌液经热休克温度(45℃，50℃和55℃)处理，和常温(25℃)处理相比，大肠杆菌的死亡率能分别提高2、3和4个数量级。用其他类型的氨基糖苷抗生素(庆大霉素,链霉素,卡那霉素)在热休克温度(50℃或55℃)下处理大肠杆菌，其杀菌效率和常温(25℃)相比，也均有不同程度的提高，但45℃下的处理没有增强效果。
实施例2、热休克增强氨基糖苷类抗生素杀灭铜绿假单胞菌的效率
1、活化铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1。吸取保存于-80℃冰箱中的铜绿假单胞菌PAO1的20％甘油菌液1μl，加至1ml LB液体培养基中，于37℃摇床(250rpm)培养到平台期，将得到的菌液稀释1000倍后接种于10ml LB液体培养基中，37℃摇床(250rpm)培养到对数期(OD600＝0.8)，得到铜绿假单胞菌培养液。
2、取步骤1得到的铜绿假单胞菌培养液离心(13000g，2min)，去上清，将菌体沉淀重悬在与铜绿假单胞菌培养液等体积的生理盐水(0.9％NaCl的灭菌水溶液)中后，分装于无菌离心管中，每管分装有100μl菌液；
将装有菌液的离心管随机分为五组，即无抗生素组、庆大霉素组、链霉素组和妥布霉素组，无抗生素组3个装有菌液的离心管(记为CK1、CK2和CK3)，其余每组3个装有菌液的离心管；
向庆大霉素组中的每个离心管中添加庆大霉素，庆大霉素在菌液中的浓度为25μg/ml，设置三个离心管，将庆大霉素浓度为25μg/ml的三个离心管分别记为25-G1、25-G2和25-G3；
向链霉素组中的每个离心管中添加链霉素，链霉素在菌液中的浓度为100μg/ml，设置三个离心管，将链霉素浓度为100μg/ml的三个离心管分别记为100-S1、100-S2和100-S3；
向妥布霉素组中的每个离心管中添加妥布霉素，妥布霉素在菌液中的浓度为25μg/ml，设置三个离心管，将妥布霉素浓度为25μg/ml的三个离心管分别记为25-T1、25-T2和25-T3；
将CK1、50-K1、25-G1、100-S1和25-T1常温25℃温浴2min(作为对照)；将CK2、50-K2、25-G2、100-S2和25-T2于55℃下温浴热处理2min；将CK3、50-K3、25-G3、100-S3和25-T3于55℃下温浴热处理1min。
3、步骤2完成后，将处理后的菌液离心(10000g，1min)，去除上清液，然后用100μl100mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体，洗涤两次后，再利用100μl100mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体。
4、步骤3完成后，将得到的菌液按照每次10倍的梯度用100mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)稀释，稀释梯度为10、102、103、104、105，每个稀释度取5μl菌液点滴在LB固体培养基六方格平板上，置于37℃温箱培养10小时后，检查细菌死亡，并进行菌落计数，计算铜绿假单胞菌经处理后的存活率。
5、重复步骤2-4，其中热处理温度由55℃替换为50℃，将处理时间2min替换为5min，将处理时间1min替换为3min，常温处理的时间由2min替换为5min，其他步骤均相同。
6、重复步骤2-4，其中热处理温度由55℃替换为45℃，将处理时间2min替换为10min，将处理时间1min替换为5min，常温处理的时间由2min替换为10min，其他步骤均相同。
结果如图2和表2所示。
表2、不同温度及抗生素处理下铜绿假单胞菌的存活率与相对杀菌效率
Figure BDA0001687999000000061
Figure BDA0001687999000000071
注：相对杀菌效率＝热休克下(即热处理下)无抗生素的存活率×常温下有抗生素的存活率/热休克下(即热处理下)有抗生素的存活率。
结果显示，针对铜绿假单胞菌，妥布霉素在热休克温度(45℃，50℃和55℃)下的杀菌效率比常温(25℃)分别提高3、4和3个数量级。庆大霉素和链霉素在这三个热休克温度的杀菌效率也均有显著提高。

Claims (3)

1.一种非治疗目的的杀灭细菌的方法，包括：对含有待灭细菌和生理盐水的液体施用抗生素，得到细菌与抗生素的混合物，所述抗生素对所述待灭细菌的生长具有抑制作用；将所述混合物在所述待灭细菌的热休克温度下进行处理，杀灭所述待灭细菌；其中所述细菌为大肠杆菌或铜绿假单胞菌，所述大肠杆菌的处理方法为：采用卡那霉素、庆大霉素、链霉素或妥布霉素，50℃处理15分钟或55℃处理5分钟；所述铜绿假单胞菌的处理方法为：采用庆大霉素、链霉素或妥布霉素，45℃处理10分钟、50℃处理5分钟或55℃处理2分钟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述混合物中所述抗生素的浓度为25-100µg/ml。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述混合物中所述抗生素的浓度为30 µg/ml。
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