CN109526956B - 乙醇作为增敏剂提高氨基糖苷类抗生素杀菌效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了乙醇作为增敏剂提高氨基糖苷类抗生素杀菌效率的方法。该方法是在含有待灭细菌的菌液中加入终浓度为20‑30mM的乙醇，得到菌液预处理液，然后在所得菌液预处理液中加入氨基糖苷类抗生素，杀灭细菌。本发明方法可以大幅度提高氨基糖苷抗生素对革兰氏阴性菌的杀菌效率，将有效降低病原菌产生耐药的风险，同时在达到同样治疗效果的前提下，减少用药量和给药时间，从而降低其副作用。

Description

乙醇作为增敏剂提高氨基糖苷类抗生素杀菌效率的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及乙醇作为增敏剂提高氨基糖苷类抗生素杀菌效率的方法。
背景技术
细菌耐药是全球面临的重大公共健康问题。在中国，由于临床抗生素滥用以及养殖业抗生素的滥用，使得细菌耐药问题更为紧迫。提高现有抗生素的杀菌效率、快速高效杀灭病原菌是降低细菌耐药风险的重要手段。
大肠杆菌是一种重要的寄生于人体肠道的细菌，特殊情况下会致病，例如血液感染。同时大肠杆菌作为生物学研究常用的标准菌株，广泛用于细菌耐药机理的研究。铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，也是研究细菌耐药机理的常用菌株，其本身耐受卡那霉素。大肠杆菌和铜绿假单胞菌都属于革兰氏阴性细菌。
氨基糖苷抗生素是目前治疗需氧革兰氏阴性杆菌严重感染的重要药物，属于杀菌型抗生素。因其分子结构有一个氨基环醇类和一个或多个氨基糖分子，并由配糖键连接成苷而得名。氨基糖苷抗生素与细菌核糖体30S小亚基结合，导致细菌合成错误的蛋白质，产生有害的蛋白质聚集体，最终杀死细菌。这类抗生素在临床应用方面受到诸多限制，主要原因包括日益严重的细菌耐药现象以及该类抗生素的肾毒性和耳毒性。目前临床医用或养殖业使用的氨基糖苷抗生素主要包括：妥布霉素，卡那霉素，链霉素，庆大霉素，新霉素，阿米卡星，安普霉素，达苄霉素，奈替米星，西索米星等。
发明内容
本发明提供了乙醇作为增敏剂提高氨基糖苷类抗生素杀菌效率的菌液预处理方法。本发明方法不以疾病的诊断或治疗为目的。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
乙醇作为增敏剂提高氨基糖苷类抗生素杀菌效率的菌液预处理方法：在含有待灭细菌的菌液中加入乙醇，得到菌液预处理液，所述乙醇在菌液预处理液中的终浓度为20-30mM。
进一步，在所得菌液预处理液中加入氨基糖苷类抗生素，得到细菌与抗生素的混合物。将所述混合物置于37℃摇床培养处理，杀灭所述细菌。
所述细菌与抗生素的混合物中，抗生素的终浓度为250-1000μg/ml。
所述抗生素对待灭细菌具有杀灭作用。
当所述细菌为大肠杆菌时，所述抗生素为妥布霉素、庆大霉素、链霉素或卡那霉素中的一种。所述细菌与抗生素的混合物中，妥布霉素的终浓度为500μg/ml、庆大霉素的终浓度为 250μg/ml、链霉素的终浓度为250μg/ml，卡那霉素的终浓度为1000μg/ml。
当所述细菌为铜绿假单胞菌，所述抗生素为妥布霉素或庆大霉素中的一种。所述细菌与抗生素的混合物中，妥布霉素的终浓度为500μg/ml、庆大霉素的终浓度为250μg/ml。
本发明采用以上技术方案，在采用抗生素杀灭细菌前，先在菌液中加入乙醇进行预处理，可以大幅度提高的抗生素灭菌效率，同时在达到同样治疗效果的前提下，减少用药量和给药时间，从而降低抗生素的副作用。
实验证明，针对平台期大肠杆菌，菌液加乙醇和不加乙醇的处理组相比，处理3小时，5 小时(以妥布霉素为例)的杀菌效率分别能提高2和3个数量级。针对平台期铜绿假单胞菌，菌液加乙醇和不加乙醇的处理组相比，处理3小时(以妥布霉素为例)的杀菌效率能提高3 个数量级。
附图说明
图1为平台期大肠杆菌中，几种常见醇类对妥布霉素的菌效率的影响。图中，每个处理下的6个菌落图从左至右分别为稀释度为105、104、103、102、10和1下的菌落图。
图2为平台期大肠杆菌中，乙醇对氨基糖苷类抗生素杀菌效率的影响。图中，每个处理下的6个菌落图从左至右分别为稀释度分别为105、104、103、102、10和1下的菌落图。
图3为平台期铜绿假胞杆菌中，乙醇对氨基糖苷类抗生素杀菌效率的影响。图中，每个处理下的6个菌落图从左至右分别为稀释度分别为105、104、103、102、10和1下的菌落图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的大肠杆菌E.coli K-12 BW25113.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用(E.coli K-12BW25113 是生物实验室广泛使用的大肠杆菌标准菌株，参考文献可用Baba T.et al.(2006) Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockoutmutants:the Keio collection.Mol Systems Biol 2(1),1-11,doi:10.1038/msb4100050.)
下述实施例中的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用(P.aeruginosa PAO1 为生物学实验室的铜绿假单胞菌标准菌株，参考文献可用Kindrachuk et al.(2011) Involvement of an ATP-dependent protease,PA0779/AsrA,in inducing heat shock in response to tobramycin in Pseudomonasaeruginosa.Antimicrob Agents Chemother 55(5), 1874-1882.)。
实施例1
常见醇类对于妥布霉素杀灭大肠杆菌的影响
1、活化大肠杆菌(E.coli k-12BW25113(大肠杆菌k-12BW25113)：吸取保存于-80℃冰箱中的大肠杆菌BW25113的20％甘油菌液1μl，加至1ml LB液体培养基中，于37℃摇床(250rpm)培养到平台期，将得到的菌液稀释1000倍后接种于20ml LB液体培养基中，37℃摇床(250rpm)培养过夜(20小时)，得到大肠杆菌培养液。
2、取18ml步骤1得到的大肠杆菌培养液，分装于18个无菌摇菌管中，随机分为2组，即无抗生素组和妥布霉素组，每管1ml菌液。
无抗生素组的9个摇菌管，其中1个摇菌管不加醇类，剩余8个摇菌管分别加入甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇，异丁醇，2-丁醇，叔丁醇，使得各醇类终 浓度为30mM。
向妥布霉素组中的9个摇菌管中分别添加妥布霉素，妥布霉素在菌液中的浓度为500 μg/ml，其中1个含妥布霉素摇菌管不加醇类，剩余8个含妥布霉素的摇菌管分别加入甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇，异丁醇，2-丁醇，叔丁醇，使得各醇类终 浓度为30mM。
将上述18个摇菌管直接置于37℃摇床(250rpm)培养处理。
3、步骤2完成5小时后，取出100μl的菌液离心(10000g，1min)，去除上清液，然后用100μl 10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体，洗涤两次后，再利用100μl 10mM 灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体。
4、步骤3完成后，将得到的菌液按照每次10倍的梯度用10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)稀释，稀释梯度为10、102、103、104、105，每个稀释度取5μl菌液点滴在LB固体培养基六方格平板上，置于37℃温箱培养12小时后，检查细菌死亡，并进行菌落计数，计算大肠杆菌经处理后的存活率。
结果如图1和表1所示。
表1几种常见醇类对妥布霉素的杀菌效率的影响
Figure GDA0002638092280000031
Figure GDA0002638092280000041
注：相对杀菌效率＝醇类存在时无抗生素的存活率×仅有抗生素存在时的存活率/醇类存在时有抗生素的存活率。
结果显示，乙醇配合妥布霉素杀灭大肠杆菌的效果最好。乙醇配合妥布霉素处理大肠杆菌，与对照相比，细菌死亡率提高3个数量级。与对照相比，正丙醇或正丁醇配合妥布霉素处理大肠杆菌，死亡率提高2个数量级。甲醇，异丙醇，异丁醇，2-丁醇，叔丁醇配合妥布霉素处理大肠杆菌，与对照相比，没有明显提高杀菌的效果。
实施例2
乙醇增强氨基糖苷类抗生素杀灭大肠杆菌的效率
1、活化大肠杆菌(E.coli k-12 BW25113(大肠杆菌k-12BW25113)：吸取保存于-80℃冰箱中的大肠杆菌BW25113的20％甘油菌液1μl，加至1ml LB液体培养基中，于37℃摇床(250rpm)培养到平台期，将得到的菌液稀释1000倍后接种于20ml LB液体培养基中，37℃摇床(250rpm)培养过夜(20小时)，得到大肠杆菌培养液。
2、取10mL步骤1得到的大肠杆菌培养液，分装于10个无菌摇菌管中，随机分为5组，即无抗生素组、妥布霉素组、庆大霉素组、链霉素组和卡那霉素组，每管分装有1mL菌液。
向妥布霉素组中的2个摇菌管中添加妥布霉素，妥布霉素在菌液中的浓度为500μg/ml， 2个离心管分别记为500-T1、500-T2；
向庆大霉素组中的2个摇菌管中添加庆大霉素，庆大霉素在菌液中的浓度为250μg/ml， 2个离心管分别记为250-G1、250-G2；
向链霉素组中的2个摇菌管中添加链霉素，链霉素在菌液中的浓度为250μg/ml，2个离心管分别记为250-S1、250-S2；
向卡那霉素组中的2个摇菌管中添加卡那霉素，卡那霉素在菌液中的浓度为1000μg/ml， 2个离心管分别记为1000-K1、1000-K2；
将CK1、500-T1、250-G1、250-S1、1000-K1直接置于37℃摇床(250rpm)培养处理；将CK2、500-T2、250-G2、250-S2、1000-K2加入30mM乙醇后置于37℃摇床(250rpm)培养处理。
3、步骤2完成3小时后，取出100μl的菌液离心(10000g，1min)，去除上清液，然后用100μl 10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体，洗涤两次后，再利用100μl 10mM 灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体。
4、步骤3完成后，将得到的菌液按照每次10倍的梯度用10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)稀释，稀释梯度为10、102、103、104、105，每个稀释度取5μl菌液点滴在LB固体培养基六方格平板上，置于37℃温箱培养12小时后，检查细菌死亡，并进行菌落计数，计算大肠杆菌经处理后的存活率。
5、步骤2完成的5小时后，重复步骤3和步骤4的操作。
结果如图2和表2所示。
表2不同抗生素及不同时间处理下大肠杆菌的存活率与相对杀菌效率
Figure GDA0002638092280000051
注：相对杀菌效率＝乙醇存在时无抗生素的存活率×仅有抗生素存在时的存活率/乙醇存在时有抗生素的存活率。
结果显示，和不加乙醇处理相比，将含有妥布霉素、庆大霉素、链霉素的菌液添加30mM 乙醇处理，处理3小时的大肠杆菌的死亡率能提高2个数量级，处理5小时的大肠杆菌的死亡率能提高3个数量级；和不加乙醇处理相比，将含有卡那霉素的菌液添加20mM乙醇处理，处理3小时的大肠杆菌的死亡率能提高1个数量级，处理5小时的大肠杆菌的死亡率能提高2个数量级。
实施例3
乙醇增强氨基糖苷类抗生素杀灭铜绿假单胞杆菌的效率
1、活化铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1：吸取保存于-80℃冰箱中的铜绿假单胞菌 (P.aeruginosa)PAO1的20％甘油菌液1μl，加至1ml LB液体培养基中，于37℃摇床(250 rpm)培养到平台期，将得到的菌液稀释1000倍后接种于20ml LB液体培养基中，37℃摇床 (250rpm)培养过夜(24小时)，得到铜绿假单胞菌培养液。
2、取6mL步骤1得到的铜绿假单胞菌培养液，分装于6个无菌摇菌管中，随机分为3组，即无抗生素组、妥布霉素组、庆大霉素组，每管分装有1mL菌液。
向妥布霉素组中的2个摇菌管中添加妥布霉素，妥布霉素在菌液中的浓度为500μg/ml， 2个离心管分别记为500-T1、500-T2；
向庆大霉素组中的2个摇菌管中添加庆大霉素，庆大霉素在菌液中的浓度为250μg/ml， 2个离心管分别记为250-G1、250-G2；
将CK1、500-T1、250-G1直接置于37℃摇床(250rpm)培养处理；将CK2、500-T2、500-G2 加入20mM乙醇后置于37℃摇床(250rpm)培养处理。
3、步骤2完成2小时后，取出100μl的菌液离心(10000g，1min)，去除上清液，然后用100μl 10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体，洗涤两次后，再利用100μl 10mM 灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体。
4、步骤3完成后，将得到的菌液按照每次10倍的梯度用10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)稀释，稀释梯度为10、102、103、104、105，每个稀释度取5μl菌液点滴在LB固体培养基六方格平板上，置于37℃温箱培养20小时后，检查细菌死亡，并进行菌落计数，计算铜绿假单胞菌经处理后的存活率。
结果如图3和表3所示。
表3不同抗生素处理2小时下铜绿假单胞菌的存活率与相对杀菌效率
Figure GDA0002638092280000061
注：相对杀菌效率＝乙醇存在时无抗生素的存活率×仅有抗生素存在时的存活率/乙醇存在时有抗生素的存活率。
结果显示，和不加乙醇处理相比，将含有妥布霉素、庆大霉素的菌液添加30mM乙醇处理， 2小时的处理时间铜绿假单胞菌的死亡率能分别提高3和2个数量级。

Claims (7)

1.乙醇作为增敏剂提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期细菌效率的方法，其特征在于：在含有待灭细菌的菌液中加入乙醇，得到菌液预处理液，所述乙醇在菌液预处理液中的终浓度为20-30mM，在所得菌液预处理液中加入氨基糖苷类抗生素，得到细菌与抗生素的混合物。
2.根据权利要求1所述的乙醇作为增敏剂提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期细菌效率的方法，其特征在于：所述细菌与抗生素的混合物中，抗生素的终浓度为250-1000µg/ml。
3.根据权利要求1所述的乙醇作为增敏剂提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期细菌效率的方法，其特征在于：所述抗生素对待灭细菌具有杀灭作用。
4.根据权利要求3所述的乙醇作为增敏剂提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期细菌效率的方法，其特征在于：所述细菌为大肠杆菌，所述抗生素为妥布霉素、庆大霉素、链霉素或卡那霉素中的一种。
5.根据权利要求4所述的乙醇作为增敏剂提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期细菌效率的方法，其特征在于：所述细菌与抗生素的混合物中，妥布霉素的终浓度为500µg/ml、庆大霉素的终浓度为250µg/ml、链霉素的终浓度为250µg/ml，卡那霉素的终浓度为1000µg/ml。
6.根据权利要求3所述的乙醇作为增敏剂提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期细菌效率的方法，其特征在于：所述细菌为铜绿假单胞菌，所述抗生素为妥布霉素或庆大霉素中的一种。
7.根据权利要求6所述的乙醇作为增敏剂提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期细菌效率的方法，其特征在于：所述细菌与抗生素的混合物中，妥布霉素的终浓度为500µg/ml、庆大霉素的终浓度为250µg/ml。
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