CN112021314B - Cccp提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期细菌效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了CCCP提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期细菌菌效率的方法。该方法是在含有待灭细菌的菌液中加入氨基糖胺类抗生素和CCCP，得到菌液处理液，将所述菌液处理液进行摇床培养。本发明方法可以大幅度提高氨基糖苷抗生素对革兰氏阴性菌的杀菌效率，将有效降低病原菌产生耐药的风险，同时在达到同样治疗效果的前提下，减少用药量和给药时间，从而降低其副作用。

Description

CCCP提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期细菌效率的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及CCCP提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期细菌效率的方法。
背景技术
细菌耐药是全球面临的重大公共健康问题。在中国，由于临床抗生素滥用以及养殖业抗生素的滥用，使得细菌耐药问题更为紧迫。提高现有抗生素的杀菌效率、快速高效杀灭病原菌是降低细菌耐药风险的重要手段。
大肠杆菌是一种肠道致病菌，一定条件下能引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染，在养殖业中,大肠杆菌是危害养殖动物的主要疾病之一。同时大肠杆菌作为生物学研究常用的标准菌株，广泛用于细菌耐药机理的研究。志贺氏菌是一种人和灵长类动物的肠道致病菌，引起细菌性痢疾，10～200个细菌可使人群中10～50％致病。大肠杆菌和志贺氏菌属于革兰氏阴性细菌。
金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病微生物。金黄色葡萄球菌常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、痈、化脓疮口中，空气、污水等环境中也无处不在。可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症。金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性细菌。
氨基糖苷抗生素是目前治疗需氧革兰氏阴性杆菌严重感染的重要药物，属于杀菌型抗生素。因其分子结构有一个氨基环醇类和一个或多个氨基糖分子，并由配糖键连接成苷而得名。氨基糖苷抗生素与细菌核糖体30S小亚基结合，导致细菌合成错误的蛋白质，产生有害的蛋白质聚集体，最终杀死细菌。这类抗生素在临床应用方面受到诸多限制，主要原因包括日益严重的细菌耐药现象以及该类抗生素的肾毒性和耳毒性。目前临床医用或养殖业使用的氨基糖苷抗生素主要包括：妥布霉素，卡那霉素，链霉素，庆大霉素，新霉素，阿米卡星，安普霉素，达苄霉素，奈替米星，西索米星等。
CCCP(羰基氰化物间氯苯腙，Chloro carbonyl cyanide phenyl hydrazone)是一种氧化呼吸链解耦连剂，只影响氧化磷酸化但不干扰底物水平磷酸化，这一脂溶性底物能够携带质子穿透线粒体内膜，进而破坏ATP合成。
发明内容
本发明提供了CCCP提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期细菌效率的方法。本发明方法不以疾病的诊断或治疗为目的。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
CCCP提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期细菌效率的方法：在含有待灭细菌的菌液中加入氨基糖苷类抗生素和CCCP，得到菌液处理液，将所述菌液处理液进行摇床培养，杀灭所述细菌。
所述CCCP在菌液处理液中的终浓度为5-100μM。
所述氨基糖苷类抗生素在菌液处理液中的终浓度为50-500μg/ml
所述细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或志贺氏菌中一种
所述抗生素为妥布霉素、庆大霉素、链霉素或卡那霉素中的一种。
进一步的，当所述细菌为大肠杆菌时，所述抗生素为妥布霉素、庆大霉素、链霉素或卡那霉素中的一种；菌液处理液中，CCCP终浓度为20μM，妥布霉素的终浓度为200μg/ml、庆大霉素的终浓度为200μg/ml、链霉素的终浓度为200μg/ml，卡那霉素的终浓度为500μg/ml。
进一步的，当所述细菌为金黄色葡萄球菌时，所述抗生素为妥布霉素、庆大霉素、链霉素或卡那霉素中的一种；菌液处理液中，CCCP终浓度为20μM，妥布霉素的终浓度为200μg/ml、庆大霉素的终浓度为200μg/ml、链霉素的终浓度为200μg/ml，卡那霉素的终浓度为500μg/ml。
进一步的，当所述细菌为志贺氏菌，所述抗生素为妥布霉素或庆大霉素中的一种；菌液处理液中，CCCP终浓度为5μM，妥布霉素的终浓度为100μg/ml、庆大霉素的终浓度为100μg/ml。
本发明采用以上技术方案，在采用抗生素杀灭细菌前，先在菌液中加入CCCP进行预处理，可以大幅度提高的抗生素灭菌效率，同时在达到同样治疗效果的前提下，减少用药量和给药时间，从而降低抗生素的副作用。
实验证明，针对平台期大肠杆菌，菌液加CCCP和不加CCCP的处理组相比，处理5小时(以妥布霉素为例)的杀菌效率能提高4个数量级。针对平台期金黄色葡萄球菌，菌液加CCCP和不加CCCP的处理组相比，处理5小时(以妥布霉素为例)的杀菌效率能提高3个数量级。针对平台期志贺氏菌，菌液加CCCP和不加CCCP的处理组相比，处理5小时(以妥布霉素为例)的杀菌效率能提高3个数量级。
附图说明
图1为平台期大肠杆菌中，CCCP配合不同浓度的妥布霉素对杀菌效率的影响。图中，每个处理下的6个菌落图从左至右分别为稀释度为105、104、103、102、10和1下的菌落图。
图2为平台期大肠杆菌中，CCCP对不同氨基糖苷类抗生素杀菌效率的影响。图中，每个处理下的6个菌落图从左至右分别为稀释度分别为105、104、103、102、10和1下的菌落图。
图3为平台期金黄色葡萄球菌中，CCCP对不同氨基糖苷类抗生素杀菌效率的影响。图中，每个处理下的6个菌落图从左至右分别为稀释度分别为105、104、103、102、10和1下的菌落图。
图4为平台期志贺氏菌中，CCCP对不同氨基糖苷类抗生素杀菌效率的影响。图中，每个处理下的6个菌落图从左至右分别为稀释度分别为105、104、103、102、10和1下的菌落图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的大肠杆菌(E.coli K-12BW25113)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用(E.coli K-12BW25113是生物实验室广泛使用的大肠杆菌标准菌株，参考文献可用Baba T.et al.(2006)Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockoutmutants:the Keio collection.Mol Systems Biol 2(1),1-11,doi:10.1038/msb4100050.)
下述实例中的金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实例中的志贺氏菌(Shigella flexneri serotype 2a 2457T)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1
不同浓度的妥布霉素对于CCCP配合妥布霉素杀灭大肠杆菌的影响
1、活化大肠杆菌(E.coli K-12BW25113)：吸取保存于-80℃冰箱中的大肠杆菌BW25113的20％甘油菌液1μl，加至1ml的LB液体培养基中，于37℃摇床(250rpm)培养到平台期，将得到的菌液稀释1000倍后接种于20ml的LB液体培养基中，37℃摇床(250rpm)培养过夜(20小时)，得到大肠杆菌培养液。
2、取10ml步骤1得到的大肠杆菌培养液，分装于10个无菌摇菌管中，随机分为5组，即无抗生素组，50μg/ml妥布霉素组，100μg/ml妥布霉素组，200μg/ml妥布霉素组，500μg/ml妥布霉素组，每管分装有1ml菌液。
无抗生素组的2个摇菌管分别记为CK1、CK2；
向50μg/ml妥布霉素组中的2个摇菌管中添加妥布霉素，妥布霉素在菌液中的浓度为50μg/ml，2个摇菌管分别记为50-1、50-2；
向100μg/ml妥布霉素中的2个摇菌管中添加妥布霉素，妥布霉素在菌液中的浓度为200μg/ml，2个摇菌管分别记为100-1、100-2；
向200μg/ml妥布霉素中的2个摇菌管中添加妥布霉素，妥布霉素在菌液中的浓度为200μg/ml，2个摇菌管分别记为200-1、200-2；
向500μg/ml妥布霉素中的2个摇菌管中添加妥布霉素，妥布霉素在菌液中的浓度为500μg/ml，2个摇菌管分别记为500-1、500-2；
将CK1、50-1、100-1、200-1、500-1直接置于37℃摇床(250rpm)培养处理；将CK2、50-2、100-2、200-2、500-2加入20μM的CCCP后置于37℃摇床(250rpm)培养处理。将上述10个摇菌管直接置于37℃摇床(250rpm)培养处理。
3、步骤2完成5小时后，取出100μl的菌液离心(10000g，1min)，去除上清液，然后用100μl的10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体，洗涤两次后，再利用100μl的10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体。
4、步骤3完成后，将得到的菌液按照每次10倍的梯度用10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)稀释，稀释梯度为10、102、103、104、105，每个稀释度取5μl菌液点滴在LB固体培养基六方格平板上，置于37℃温箱培养12小时后，检查细菌死亡，并进行菌落计数，计算大肠杆菌经处理后的存活率。
结果如图1和表1所示。
表1.CCCP配合不同浓度的妥布霉素对平台期大肠杆菌杀菌效率的影响
Figure GDA0003263910440000051
注：相对杀菌效率＝CCCP存在时无抗生素的存活率×仅有抗生素存在时的存活率/CCCP存在时有抗生素的存活率。
结果显示，随着妥布霉素浓度的升高，CCCP配合妥布霉素杀菌效果越明显。50μg/ml的妥布霉素杀菌效果不明显，100μg/ml妥布霉素有2个数量级的杀菌效果，200μg/ml妥布霉素有3个数量级的杀菌效果，500μg/ml妥布霉素有5个数量级的杀菌效果。
实施例2
CCCP提高氨基糖苷类抗生素杀灭大肠杆菌的效率
1、活化大肠杆菌(E.coli K-12BW25113)：吸取保存于-80℃冰箱中的大肠杆菌BW25113的20％甘油菌液1μl，加至1ml的LB液体培养基中，于37℃摇床(250rpm)培养到平台期，将得到的菌液稀释1000倍后接种于20ml的LB液体培养基中，37℃摇床(250rpm)培养过夜(24小时)，得到大肠杆菌培养液。
2、取10mL步骤1得到的大肠杆菌培养液，分装于10个无菌摇菌管中，随机分为5组，即无抗生素组、妥布霉素组、庆大霉素组、链霉素组和卡那霉素组，每管分装有1mL菌液。
无抗生素组的2个摇菌管分别记为CK1、CK2；
向妥布霉素组中的2个摇菌管中添加妥布霉素，妥布霉素在菌液中的浓度为200μg/ml，2个摇菌管分别记为200-T1、200-T2；
向庆大霉素组中的2个摇菌管中添加庆大霉素，庆大霉素在菌液中的浓度为200μg/ml，2个摇菌管分别记为200-G1、200-G2；
向链霉素组中的2个摇菌管中添加链霉素，链霉素在菌液中的浓度为200μg/ml，2个摇菌管分别记为200-S1、200-S2；
向卡那霉素组中的2个摇菌管中添加卡那霉素，卡那霉素在菌液中的浓度为500μg/ml，2个摇菌管分别记为500-K1、500-K2；
将CK1、200-T1、200-G1、200-S1、500-K1直接置于37℃摇床(250rpm)培养处理；将CK2、200-T2、200-G2、200-S2、500-K2加入20μM的CCCP后置于37℃摇床(250rpm)培养处理。
3、步骤2完成5小时后，取出100μl的菌液离心(10000g，1min)，去除上清液，然后用100μl的10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体，洗涤两次后，再利用100μl的10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体。
4、步骤3完成后，将得到的菌液按照每次10倍的梯度用10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)稀释，稀释梯度为10、102、103、104、105，每个稀释度取5μl菌液点滴在LB固体培养基六方格平板上，置于37℃温箱培养12小时后，检查细菌死亡，并进行菌落计数，计算大肠杆菌经处理后的存活率。
结果如图2和表2所示。
表2不同抗生素处理平台期大肠杆菌的存活率与相对杀菌效率
Figure GDA0003263910440000061
Figure GDA0003263910440000071
注：相对杀菌效率＝CCCP存在时无抗生素的存活率×仅有抗生素存在时的存活率/CCCP存在时有抗生素的存活率。
结果显示，和不加CCCP处理相比，将含有妥布霉素、庆大霉素、链霉素、卡那霉素的菌液添加20μM的CCCP处理，处理5小时的大肠杆菌的死亡率能提高3-4个数量级。
实施例3
CCCP提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期金黄色葡萄球菌的效率
1、活化金黄葡萄球菌ATC25923：吸取保存于-80℃冰箱中的金黄色葡萄球菌ATC25923的20％甘油菌液1μl，加至1ml的LB液体培养基中，于37℃摇床(250rpm)培养到平台期，将得到的菌液稀释1000倍后接种于20ml的LB液体培养基中，37℃摇床(250rpm)培养过夜(24小时)，得到金黄色葡萄球菌培养液。
2、取10mL步骤1得到的金黄色葡萄球菌培养液，分装于10个无菌摇菌管中，随机分为5组，即无抗生素组、妥布霉素组、庆大霉素组、链霉素组和卡那霉素组，每管分装有1mL菌液。
无抗生素组的2个摇菌管分别记为CK1、CK2；
向妥布霉素组中的2个摇菌管中添加妥布霉素，妥布霉素在菌液中的浓度为200μg/ml，2个摇菌管分别记为200-T1、200-T2；
向庆大霉素组中的2个摇菌管中添加庆大霉素，庆大霉素在菌液中的浓度为200μg/ml，2个摇菌管分别记为200-G1、200-G2；
向链霉素组中的2个摇菌管中添加链霉素，链霉素在菌液中的浓度为200μg/ml，2个摇菌管分别记为200-S1、200-S2；
向卡那霉素组中的2个摇菌管中添加卡那霉素，卡那霉素在菌液中的浓度为500μg/ml，2个摇菌管分别记为500-K1、500-K2；
将CK1、200-T1、200-G1、200-S1、500-K1直接置于37℃摇床(250rpm)培养处理；将CK2、200-T2、200-G2、200-S2、500-K2加入20μM的CCCP后置于37℃摇床(250rpm)培养处理。
3、步骤2完成5小时后，取出100μl的菌液离心(10000g，1min)，去除上清液，然后用100μl的10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体，洗涤两次后，再利用100μl的10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体。
4、步骤3完成后，将得到的菌液按照每次10倍的梯度用10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)稀释，稀释梯度为10、102、103、104、105，每个稀释度取5μl菌液点滴在LB固体培养基六方格平板上，置于37℃温箱培养12小时后，检查细菌死亡，并进行菌落计数，计算大肠杆菌经处理后的存活率。
结果如图3和表3所示。
表3不同抗生素处理平台期金黄色葡萄球菌的存活率与相对杀菌效率
Figure GDA0003263910440000081
注：相对杀菌效率＝CCCP存在时无抗生素的存活率×仅有抗生素存在时的存活率/CCCP存在时有抗生素的存活率。
结果显示，和不加CCCP处理相比，将含有妥布霉素、庆大霉素、链霉素、卡那霉素的菌液添加20μM的CCCP处理，处理5小时的金黄色葡萄球菌的死亡率能提高3个数量级。
实施例4
CCCP提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期志贺氏菌的效率
1、活化志贺氏菌：吸取保存于-80℃冰箱中的金志贺氏菌的20％甘油菌液1μl，加至1ml的LB液体培养基中，于37℃摇床(250rpm)培养到平台期，将得到的菌液稀释1000倍后接种于20ml的LB液体培养基中，37℃摇床(250rpm)培养过夜(24小时)，得到志贺氏菌培养液。
2、取6mL步骤1得到的志贺氏菌培养液，分装于6个无菌摇菌管中，随机分为3组，即无抗生素组、妥布霉素组、庆大霉素组，每管分装有1mL菌液。
无抗生素组的2个摇菌管分别记为CK1、CK2；
向妥布霉素组中的2个摇菌管中添加妥布霉素，妥布霉素在菌液中的浓度为100μg/ml，2个摇菌管分别记为100-T1、100-T2；
向庆大霉素组中的2个摇菌管中添加庆大霉素，庆大霉素在菌液中的浓度为100μg/ml，2个摇菌管分别记为100-G1、100-G2；
将CK1、100-T1、100-G1直接置于37℃摇床(250rpm)培养处理；将CK2、100-T2、100-G2加入5μM的CCCP后置于37℃摇床(250rpm)培养处理。
3、步骤2完成5小时后，取出100μl的菌液离心(10000g，1min)，去除上清液，然后用100μl的10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体，洗涤两次后，再利用100μl的10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体。
4、步骤3完成后，将得到的菌液按照每次10倍的梯度用10mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)稀释，稀释梯度为10、102、103、104、105，每个稀释度取5μl菌液点滴在LB固体培养基六方格平板上，置于37℃温箱培养24小时后，检查细菌死亡，并进行菌落计数，计算志贺氏菌经处理后的存活率。
结果如图4和表4所示。
表4不同抗生素处理5小时下平台期志贺氏菌的存活率与相对杀菌效率
Figure GDA0003263910440000091
注：相对杀菌效率＝CCCP存在时无抗生素的存活率×仅有抗生素存在时的存活率/CCCP存在时有抗生素的存活率。
结果显示，和不加CCCP处理相比，将含有妥布霉素、庆大霉素的菌液添加5μM的CCCP处理，5小时的处理时间志贺氏菌的死亡率能提高2-3个数量级。

Claims (2)

1.CCCP提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期细菌效率的方法，其特征在于：在含有待灭细菌的菌液中加入氨基糖苷类抗生素和CCCP，得到菌液处理液，然后进行250rpm摇床培养5h；
所述细菌为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌，所述抗生素为妥布霉素、庆大霉素、链霉素或卡那霉素，CCCP在菌液处理液中的终浓度为20µM，且所述菌液处理液中，妥布霉素的终浓度为200µg/ml，庆大霉素的终浓度为200µg/ml，链霉素的终浓度为200µg/ml，卡那霉素的终浓度为500µg/ml。
2.CCCP提高氨基糖苷类抗生素杀灭平台期细菌效率的方法，其特征在于：在含有待灭细菌的菌液中加入氨基糖苷类抗生素和CCCP，得到菌液处理液，然后进行250rpm摇床培养5h；
所述细菌为志贺氏菌，所述抗生素为妥布霉素或庆大霉素，CCCP在菌液处理液中的终浓度为5µM，且所述菌液处理液中，妥布霉素的终浓度为100µg/ml，庆大霉素的终浓度为100µg/ml。
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