CN114272246A

CN114272246A - 尿嘧啶在制备抗感染药物中的应用

Info

Publication number: CN114272246A
Application number: CN202111529177.7A
Authority: CN
Inventors: 苏玉斌; 范绿园; 钟依霖
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2021-12-14
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2022-04-05

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及尿嘧啶在制备抗感染药物中的应用。本发明经过实验数据证明，将尿嘧啶与氨基糖苷类抗生素联用时，两者存在相互协同作用，可以显著提高机体内ROS含量，大量的ROS破坏病原微生物的内部结构，导致其死亡；并且，尿嘧啶还可以显著提高病原微生物对氨基糖苷类抗生素的敏感性，可以在抗生素较小浓度条件下达到杀灭病原微生物的效果。

Description

尿嘧啶在制备抗感染药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及尿嘧啶在制备抗感染药物中的应用。

背景技术

感染是指细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体侵入人体所引起的局部组织和全身性炎症反应。目前针对微生物的感染，临床上主要用各种抗生素来治疗，抗生素成为临床上使用频次最高的药物，已经成为现代医疗最重要的医疗干预手段之一。抗生素的使用可以降低与细菌感染相关的发病率和死亡率，避免了无数人死于细菌感染。但是在抗生素不断发展，种类不断增加的同时，病原微生物也在抗菌药物的围追堵截之中不断壮大，甚至产生变异，导致许多病原微生物对抗生素产生耐药性，原有常用抗生素对产生耐药性的病原微生物抑制效果显著降低，甚至存在抗生素毫无抗感染效果的情况。

为了解决日益增加的病原微生物对抗生素产生耐药性，导致抗感染疾病越来越难治愈的问题，一方面是针对耐药菌研究新的药物进行治疗，但是新药的研发是漫长而困难的，需要花费大量的时间和金钱，无法及时解决目前就面临的耐药菌治疗问题。另一方面，本领域技术人员研究发现，可以将抗生素与一些小分子化合物联合使用来提高病原微生物对抗菌药物的敏感性，从而杀死病原微生物，达到抗感染的效果；如中国专利申请CN112569251A公开了次黄嘌呤核苷酸在制备抗感染药物中的应用，将次黄嘌呤核苷酸和抗生素联用，可以显著提高大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等多种耐药菌对阿莫西林、头孢哌酮等抗菌药物的敏感性，达到较好的抗感染效果，同时减少细菌耐药性的产生。

因此，迫切需要开发出多种可以和抗生素联用杀死耐药细菌，达到抗感染作用的小分子化合物。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有病原微生物对抗生素产生耐药性，难以治疗的缺陷和不足，提供尿嘧啶在制备抗感染药物中的应用。

本发明的目的是提供一种抗感染组合物。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

小分子化合物尿嘧啶是构成核酸RNA即遗传物质的重要组成部分，在人体中广泛分布并发挥着不同的生物学功能，主要包括参与核酸形成、能量存储、细胞代谢和生理调节等过程。尿嘧啶是常见且天然存在的嘧啶衍生物，安全性高。

本发明通过研究发现，当尿嘧啶与抗生素联用时，两者存在相互协同作用，可以显著提高机体内ROS含量，大量的ROS破坏病原微生物的内部结构，导致其死亡；另一方面，尿嘧啶可以显著提高病原微生物对氨基糖苷类常用抗生素的敏感性，可以在抗生素较小浓度条件下，协同杀死病原微生物，从而达到显著的抗感染作用。

因此，本发明要求保护尿嘧啶在制备抗感染药物中的应用。

进一步地，所述尿嘧啶在抗感染药物中提高细菌对氨基糖苷类抗生素的敏感性。

更进一步地，所述尿嘧啶和氨基糖苷类抗生素提高机体ROS含量。

进一步地，所述细菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。

更进一步地，所述细菌还包括革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌的耐药菌。

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌是研究细菌耐药的模式菌，故这些细菌为耐药和非耐药菌的较好代表菌。尽管在本发明的实施例中，所列举的细菌包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的耐药菌，尤其是本发明多数验证试验是以金黄色葡萄球菌耐药菌作为研究对象的。但是，这些细菌并不能作为对本发明保护范围的限制。原因如下：

①大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌为研究耐药机制的模式菌；②大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌分别属于革兰氏阴性和阳性细菌，具有较好的代表性；③细菌可以具有耐药和非耐药状态，即同一细菌的耐药和非耐药菌株，本发明的尿嘧啶对耐药菌都有作用，那么对非耐药菌应该具有更好的抗感染效果。因此，根据上述原理从这些菌种可以推知到更多的菌种也适宜于本发明的理念。

优选地，所述细菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)、人工传代大肠杆菌(Escherichia coli，K12 BW25113)庆大霉素耐药株(GEN-R)。

优选地，所述氨基糖苷类抗生素包括庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星。根据同一类抗生素的化学结构和抗菌机制的一致性，不需要对所有氨基糖苷类抗生素进行一一验证。本领域技术人员根据本发明的理念，可以容易地推知到其他氨基糖苷类抗生素也同样能适用于本发明所述的方法。上述抗生素并不能作为对本发明保护范围的限制。

另外的，本发明还提供了一种抗感染组合物，所述组合物由尿嘧啶和氨基糖苷类抗生素组成。

进一步地，所述氨基糖苷类抗生素为庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素或阿米卡星。

更进一步地，所述抗感染组合物针对革兰氏阴性菌或其耐药菌时，尿嘧啶和氨基糖苷类抗生素的质量比为(5.6～35)：1。

进一步地，所述抗感染组合物针对革兰氏阳性菌或其耐药菌时，尿嘧啶和氨基糖苷类抗生素的质量比为(0.7～2.8)：1。

进一步地，所述抗感染组合物结合药学上可接受的辅料可以制成口服制剂、注射剂、吸入剂或外用制剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了尿嘧啶在制备抗感染药物中的应用，经过实验数据证明，将尿嘧啶与氨基糖苷类抗生素联用时，两者存在相互协同作用，可以显著提高机体内 ROS含量，大量的ROS破坏病原微生物的内部结构，导致其死亡；并且，尿嘧啶还可以显著提高病原微生物对氨基糖苷类抗生素的敏感性，可以在抗生素较低浓度条件下达到杀灭病原微生物的效果。

附图说明

图1为尿嘧啶提高MRSA对庆大霉素的敏感性实验结果统计图；其中，图1 A为MRSA对庆大霉素敏感性与尿嘧啶浓度的关系图；图1B为MRSA对庆大霉素敏感性与庆大霉素浓度的关系图；图1C为MRSA对庆大霉素敏感性与作用时间的关系图。

图2为尿嘧啶提高MRSA对庆大霉素的敏感性与ROS产生的关系图；其中，图2A为各组加入活性氧荧光探针后的荧光强度图；图2B为不同浓度硫脲与细菌生存率的关系图。

图3为尿嘧啶提高MRSA对氨基糖苷类抗生素的敏感性数据统计图；其中，图3A为阿米沙星，图3B为卡那霉素，图3C为妥布霉素。

图4为尿嘧啶提高GEN-R对氨基糖苷类抗生素的敏感性数据统计图；其中，图4A为庆大霉素，图4B阿米沙星，图4C为卡那霉素，图4D为妥布霉素。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

细菌样本1的制备：从LB培养基(1L培养基中含细菌性蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，市售)平板上挑取MRSA单菌落接种于30mL LB 培养基中，于37℃、220rpm条件下振荡培养12h达饱和状态；离心收集菌液，于8000rpm条件下离心3min，除去上清并以0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用 1×M9基本液体培养基悬浮菌体，调节菌液OD₆₀₀值至0.2，然后分装5mL于试管中备用。

其中，1×M9基本液体培养基：1L溶液A(1L水中含有17.1g十二水合磷酸氢二钠、3g磷酸二氢钾、1g氯化铵、0.5g氯化钠)中加入5mL 2M乙酸钠、 2mL 1M硫酸镁、100μL 1M氯化钙，混匀，备用。

实施例1尿嘧啶提高MRSA对庆大霉素的敏感性

1、MRSA对庆大霉素敏感性随尿嘧啶浓度增加而提高

(1)实验方法：

在制备好的细菌样本1中，先添加400μg/mL的庆大霉素，然后添加尿嘧啶，使其终浓度为0.625、1.25、2.5、5、10mM，于37℃、220rpm条件下摇床孵育 6h后，取10μL菌液进行LB琼脂平板菌落计数，培养12h后，计算相同抗生素不同浓度尿嘧啶作用后的细菌生存率，计算公式为：生存率(％)＝(加入相同抗生素不同浓度尿嘧啶的活菌数/空白组的活菌数)×100％。

(2)实验结果：

结果参见图1，由图1A可见，即使加入很低浓度的尿嘧啶，与对照只加入庆大霉素不加尿嘧啶相比，耐药菌存活细菌数略微减少，但随着加入尿嘧啶的浓度提高，杀菌效率逐渐提高；单加抗生素庆大霉素不加尿嘧啶的细菌存活率为97.4％，随着尿嘧啶浓度升高，存活率从84％左右降低到0.17％，杀菌效果提高了525倍，这些结果说明尿嘧啶可以提高MRSA对庆大霉素敏感性。

2、MRSA对庆大霉素的敏感性具有浓度依赖性

(1)实验方法：

在制备好的细菌样本1中，先添加庆大霉素使其终浓度为分别为25、50、 100、200、400、800μg/mL，然后每组都添加尿嘧啶，使其终浓度都为10mM，于37℃、220rpm条件下摇床孵育6h后，取10μL菌液进行LB琼脂平板菌落，培养12h后计数，计算在相同浓度尿嘧啶作用下，不同浓度抗生素庆大霉素作用后的细菌生存率，计算公式为：生存率(％)＝(加入相同尿嘧啶不同浓度抗生素庆大霉素的活菌数/空白组的活菌数)×100％。

(2)实验结果：

结果参见图1，由图1B可见，MRSA在不加尿嘧啶的情况下，即使添加最高浓度的庆大霉素也只能杀死少量耐药菌MRSA，生存率仍高达到89.64％；而加入尿嘧啶后，较低浓度的庆大霉素也可杀死耐药菌MRSA，且随着加入抗生素庆大霉素量增多，其活菌数越少，细菌对抗生素敏感性越高。10mM的尿嘧啶协同400μg/mL庆大霉素的杀菌作用相比于单独加抗生素庆大霉素的效果，提高了225倍。此结果表明尿嘧啶可恢复耐药菌对庆大霉素的敏感性，而且杀菌效果与抗生素浓度相关即抗生素浓度越高，杀菌效果就越好。

3、尿嘧啶提高MRSA对庆大霉素的敏感性具有作用时间的相关性

(1)实验方法：

在制备好的细菌样本1中，加入终浓度为400μg/mL的庆大霉素以及终浓度为10mM的尿嘧啶，37℃、220rpm孵育总时间为7h，每隔1h用平板检测其活菌数，并以只加庆大霉素不添加尿嘧啶作为对照，计算不同时间即0-7h的每个小时的生存率，绘制生存率与时间梯度的关系曲线。计算公式为：生存率(％) ＝(加入庆大霉素或庆大霉素协同尿嘧啶后在某个时间点的活菌数/某个时间点空白组的活菌数)×100％。

(2)实验结果：

结果参见图1，由图1C可见，与对照只加入抗生素庆大霉素相比，加入尿嘧啶1小时后，细菌存活数开始减少，且随着时间延长活菌数越少。这些结果说明，尿嘧啶可以提高耐药菌对庆大霉素敏感性，加入物质时间越长效果越明显。实施例2尿嘧啶提高MRSA对庆大霉素的敏感性与活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生的相关性

(1)实验方法：

从LB培养基平板上挑取MRSA单菌落接种于30mL LB培养基中，于37℃、 220rpm条件下振荡培养12h达饱和状态；离心收集菌液，于8000rpm条件下离心3min，除去上清并以0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用1×M9基本液体培养基悬浮菌体，调节菌液OD₆₀₀值至0.6，然后分装5mL于试管中，将其分为4 个组，分别为空白组、400μg/mL庆大霉素组、10mM尿嘧啶组、400μg/mL庆大霉素+10mM尿嘧啶联合组；于37℃、220rpm条件下孵育6小时，然后取194 μL的菌液于不透明的96孔板中，再加入活性氧荧光探针(2′,7′-Dichlorofluorescindiacetate，DCFH-DA，购买于Sigma-Aldrich)使其在体系终浓度为20nM，振荡混匀后在37℃培养箱孵育1小时，于酶标仪测485/515nm处读值，结果参见图2 A。

为了再次验证与ROS的相关性，使用硫脲消除ROS，观察能否恢复细菌耐药：把硫脲加入到终浓度为400μg/mL庆大霉素以及10mM尿嘧啶的5mL菌液体系中，使硫脲的终浓度分别为50、100、200mM，并于37℃、220rpm条件下摇床孵育6h后，取10μL菌液进行LB琼脂平板菌落计数，计算公式为生存率 (％)＝(加入硫脲组的活菌数/空白组)×100％；

(2)实验结果：

由图2A可见，尿嘧啶的加入可以增加菌体ROS的产生，增加量超过两倍，大量的ROS可以破坏细菌内的结构，导致细菌死亡；由图2B可见：随着硫脲加入可以在一定程度增加活菌的数量。

实施例3尿嘧啶提高MRSA对其它氨基糖苷类抗生素(庆大霉素，阿米沙星，卡那霉素，妥布霉素)的敏感性

(1)实验方法：

将细菌样本1分为空白组、单独抗生素组(1.6mg/mL阿米卡星、800μg/mL 卡那霉素、400μg/mL妥布霉素)、单独10mM的尿嘧啶组，抗生素+尿嘧啶联合组，孵育6小时后取10μL菌液进行LB琼脂平板菌落计数，计算公式为：生存率(％)＝(不同实验组的活菌数/空白组的活菌数)×100％。

(2)实验结果：

由图3可见，尿嘧啶可以不同程度地提高细菌对抗生素的敏感性，恢复氨基糖苷类抗生素的杀菌效果；对于耐药阳性菌MRSA而言，其中妥布霉素和庆大霉素与尿嘧啶的协同效果更好。

实施例4尿嘧啶提高GEN-R对氨基糖苷类抗生素(庆大霉素，阿米沙星，卡那霉素，妥布霉素)的敏感性

1.E.coli K12 BW25113庆大霉素耐药菌株的筛选

用二倍梯度稀释法检测大肠杆菌敏感菌(E.coli K12 BW25113)对庆大霉素的最小抑菌浓度(MIC)。按1：100将饱和菌液加入在含1/2MIC庆大霉素的培养基中连续培养数十代，测定所获单克隆的最小抑菌浓度。结果发现，得到的耐药菌株对庆大霉素的最小抑菌浓度为80μg/mL，是敏感菌株的最低抑菌浓度 (1.25μg/mL)的64倍，将该耐药大肠杆菌菌株命名为GEN-R。

细菌样本2的制备：从LB培养基平板上挑取GEN-R单菌落接种于30mL LB 培养基中，于37℃、220rpm条件下振荡培养14h达饱和状态；离心收集菌液，于8000rpm条件下离心3min，除去上清并以0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用 1×M9基本液体培养基悬浮菌体，调节菌液OD₆₀₀值至0.2，然后分装5mL于试管中备用。

2.尿嘧啶提高GEN-R对氨基糖苷类抗生素(庆大霉素，阿米沙星，卡那霉素，妥布霉素)的敏感性

(1)实验方法：

将细菌样本2分为四个组，分别为空白组、单独抗生素组(32μg/mL庆大霉素、100μg/mL阿米卡星、200μg/mL卡那霉素、80μg/mL妥布霉素)、单独 10mM的尿嘧啶组，抗生素+尿嘧啶联合组，孵育6小时后取10μL菌液进行LB 琼脂平板菌落计数，计算公式为：生存率(％)＝(不同实验组的活菌数/空白组的活菌数)×100％。

(2)实验结果：

由图4可见，尿嘧啶可以不同程度恢复氨基糖苷类抗生素的杀菌效果，单独加入抗生素能杀死一部分的细菌，当加入尿嘧啶后，杀菌效果都有所提高。对于耐药阴性菌GEN-R而言，其中庆大霉素和阿米卡星与尿嘧啶的协同杀菌效果更好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.尿嘧啶在制备抗感染药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述尿嘧啶在抗感染药物中提高细菌对氨基糖苷类抗生素的敏感性。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述尿嘧啶和氨基糖苷类抗生素提高机体ROS含量。

4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述细菌为革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述细菌还包括革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌的耐药菌。

6.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，所述抗生素为庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素或阿米卡星。

7.一种抗感染组合物，其特征在于，所述组合物由尿嘧啶和氨基糖苷类抗生素组成。

8.根据权利要求7所述抗感染组合物，其特征在于，所述氨基糖苷类抗生素为庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素或阿米卡星。

9.根据权利要求7或8所述抗感染组合物，其特征在于，所述抗感染组合物针对革兰氏阴性菌或其耐药菌时，尿嘧啶和氨基糖苷类抗生素的质量比为(5.6～35)：1。

10.根据权利要求7或8所述抗感染组合物，其特征在于，所述抗感染组合物针对革兰氏阳性菌或其耐药菌时，尿嘧啶和氨基糖苷类抗生素的质量比为(0.7～2.8)：1。