CN109601762B - 医用水蛭的矿质水营养液及其灭菌消毒方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医疗技术领域，特别涉及医用水蛭的矿质水营养液及其灭菌消毒方法。该矿质水营养液包括氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、碳酸氢钠、硫酸锌和水。本发明在无菌的环境条件下，经过一系列化学消毒剂和抗生素消毒灭菌处理，可以实现批量生产医用级的菲牛蛭。本发明相比传统水蛭养殖和除菌方案具有显著优点，既能在较短时间内使水蛭达到无条件致病菌的状态，同时又保持水蛭的活力和吮吸能力，从而确保在实施水蛭活体疗法过程中，使患者减少或者避免因水蛭携带的病菌引起的感染。因此，该发明有利于提高水蛭活体治疗技术的安全性，有助于促进水蛭活体疗法的规范推广和医用级水蛭活体产品相关标准建立。

Description

医用水蛭的矿质水营养液及其灭菌消毒方法

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，特别涉及医用水蛭的矿质水营养液及其灭菌消毒方法。

背景技术

水蛭俗称蚂蟥、马鳖等，在动物分类学上隶属于环节动物门、蛭纲的种类。目前世界上估计约有500种，在我国有100种左右，业已发现89种。水蛭根据其食性可以分为吸血和不吸血两大类。国际医学界将吸食哺乳动物或者其它动物血液的蛭类动物统称为医用水蛭。

公元1500年前，埃及人首创医蛭放血疗法。在古代英语中，“Leech”(水蛭)就是医生的意思。由此可见水蛭在古代医疗中发挥重要的作用。19世纪以来欧洲一些国家普遍使用欧洲医蛭(Hirudo medicinalis)治疗心血管疾病、神经系统疾病、炭疽、青光眼和乳突炎等疾病。印度从19世纪至今一直就有人利用欧洲医蛭吸去病人体内的淤血，包括处理毒蛇咬伤、烧伤以及眼科疾病。在当时水蛭就是医生的得力助手。鉴于吸血水蛭具有治疗多种疾病的神奇效果，在2004年美国食药监局(FDA)批准一家生物医药(法国)有限公司将侧纹医蛭(Hirudo verbana)作为医疗器械进入医疗市场。

其实，我国早在公元前2世纪汉朝初期的《尔雅》中就已记载了蛭类动物药用价值，对水蛭的应用在《神农本草经》中记述较为详细。《本草经百种录》记载：“水蛭最喜食人之血，而性又迟缓善入，迟缓则生血不伤，善入则坚积易破，借其力以攻久之滞，自有利而无害也”。晋代葛洪《肘后方》中记载：“取水蛭令吸去恶血，以治毒肿”。宋代陈自明在《外科精要》中称其为“蜞针法”。“笔管一根，入蚂蝗一条，管口对疮口，使蜞吮脓血，其毒即散”。这比西方国家利用水蛭的历史要早千年以上。

目前，随着再植技术、整容手术和显微外科手术的蓬勃发展。很多如断指、断耳和皮瓣等再植手术面临的最大难题是如何快速恢复静脉机能。因为在再植手术中，主动脉一旦缝合成功，血液就可流入人体组织。如果血液不能有效快速通过静脉回流进入循环系统，很多再植的皮肤和肢体就会因淤血而肿胀，无法成活直至坏死。而吸血水蛭可以解决组织中静脉血管淤塞问题。因为水蛭在吸血过程中一方面可以清除组织中淤积的血液，同时其唾液腺释放出具有抗凝血功能的水蛭素等物质，防止血液凝结、血管堵塞，促进血液循环，增加组织的灌流量。采用水蛭活体疗法可以辅助术后组织迅速恢复，达到满意的治疗效果。因此，吸血水蛭以其独有的优势备受医学界青睐。

水蛭活体疗法(Hirudotheropy)是一种古为今用的医学治疗手段。现代医学和药理学研究表明，吸血水蛭在吸吮血液过程中能够分泌大量的唾液，其唾液中含有许多生物活性成分，其中主要包括：(1)含有直接作用于凝血系统的成分，包括凝血酶抑制剂以及其他抑制血液凝固的物质，如水蛭素等。(2)含有类似于吗啡类的生物镇痛及消炎成分。(3)含有抑制各种细菌(如金黄色葡萄球菌等)生长的活性物质。(4)含有能促使伤口愈合并减少疤痕形成的成分，如透明质酸类酶等。除了水蛭素以外，水蛭唾液中含有多种其它有效生物活性成分可以直接进入人体发挥作用，相比水煎水蛭中药而言，更能发挥其独特的疗效。

水蛭活体疗法(又称蜞针法、水蛭生物疗法)本质上就是利用饥饿的水蛭对患者局部穴位或者创伤部位进行吸血，达到治疗各种疾病的目的。目前已经成为治疗血栓、中风偏瘫、痛风和静脉淤血并发症的一种标准疗法。

然而，在水蛭活体疗法过程中，如何避免水蛭携带的致病菌所造成的感染风险一直是医疗工作者关心的问题。虽然国内在水蛭养殖过程中也采取一些控制措施，试图解决水蛭携带寄生虫、病毒和病菌的问题，如申请公布号CN 105684996 A、发明名称为“一种医用级吸血水蛭养殖方法”中描述通过人工孵化阻断病原体、采用4万单位庆大霉素的生理盐水浸泡、喂食灭菌后的猪血饲料、在洁净的室内空间里投放大菌落益生菌的养殖水体中饲养。研究资料表明：野外或者人工饲养的活体水蛭，在其体表和体内常常带有一些细菌，其中有些细菌属于条件致病菌，例如嗜水气单胞菌、产吲哚金黄杆菌、奇异变形杆菌等条件致病菌。特别是水蛭肠道内的共生嗜水气单胞菌群落，采用上述专利方法不可能根除。因此，水蛭活体疗法在一定程度上会给病人带来感染的风险。所以，在采用水蛭活体治疗时必须考虑和解决病菌引起感染问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了医用水蛭的矿质水营养液及其灭菌消毒方法。该方法可在较短时间内获得无致病菌的水蛭，同时又保持水蛭的活力和吮吸能力。文中提及的净养是指将水蛭放入矿质水营养液中，期间不饲喂任何食物。文中提及的矿质水营养液是指为有效地保持活体水蛭的渗透压和体能活力而专门设计的配方，一般的无菌水、自来水和矿物水和生理盐水均不能取代。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种医用水蛭的矿质水营养液，矿质水营养液包括氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、碳酸氢钠、硫酸锌和水。

作为优选，矿质水营养液中各组分的浓度为：氯化钠30～50mg/L，氯化钙20～40mg/L，硫酸镁10～20mg/L，硫酸亚铁10～20mg/L，碳酸氢钠5～15mg/L，硫酸锌0.01～0.10mg/L，无菌水补足。

优选地，矿质水营养液中各组分的浓度为：氯化钠40mg/L，氯化钙30mg/L，硫酸镁15mg/L，硫酸亚铁15mg/L，碳酸氢钠10mg/L，硫酸锌0.05mg/L，无菌水补足。

在本发明提供的一具体实施例中，矿质水营养液中各组分的浓度为：氯化钠30mg/L，氯化钙20mg/L，硫酸镁10mg/L，硫酸亚铁10mg/L，碳酸氢钠5mg/L，硫酸锌0.01mg/L，无菌水补足。

在本发明提供的另一具体实施例中，矿质水营养液中各组分的浓度为：氯化钠50mg/L，氯化钙40mg/L，硫酸镁20mg/L，硫酸亚铁20mg/L，碳酸氢钠15mg/L，硫酸锌0.10mg/L，无菌水补足。

本发明还提供了一种医用水蛭的灭菌消毒方法，包括如下步骤：

步骤1：将水蛭浸泡于高铁酸钾溶液中15～20min，无菌水冲洗3次，每次5min；随即移至本发明提供的上述矿质水营养液中净养1～2天，然后饲喂含有氯霉素类抗生素的无菌脱纤维牛血，之后移至矿质水营养液中净养6～8天；

步骤2：饲喂含有喹诺酮类抗生素的无菌脱纤维牛血，然后采用矿质水营养液净养6～8天；

步骤3：将水蛭移至含有氯霉素类抗生素或第三代头孢类抗生素的矿质水营养液中，净养6～8天；

步骤4：饲喂含有喹诺酮类抗生素的无菌脱纤维牛血，然后采用矿质水营养液净养6～8天。

本发明除了在医用水蛭净养过程中严格控制环境条件以外，还对水蛭活体疗法应用前，在无菌环境条件下进行全面彻底杀毒灭菌处理，使其达到无致病菌的医疗标准；在采取消毒灭菌措施以后，同时还要确保水蛭的活力和吸吮能力，这样才能真正使水蛭活体疗法在医疗和美容手术中达到安全标准的目的。

在本发明提供的具体实施例中，灭菌消毒方法包括如下步骤：

步骤1：将水蛭浸泡于高铁酸钾溶液中15-20min，无菌水冲洗3次，每次5min；随即移至本发明提供的矿质水营养液中净养1天，然后饲喂含有氯霉素类抗生素或者第三代头孢类抗生素的无菌脱纤维牛血，之后移至矿质水营养液中净养7天；

步骤2：饲喂含有喹诺酮类抗生素的无菌脱纤维牛血，然后采用矿质水营养液净养7天；

步骤3：将水蛭移至含有氯霉素类或者第三代头孢类抗生素抗生素的矿质水营养液中，净养7天；

步骤4：饲喂含有喹诺酮类抗生素的无菌脱纤维牛血，然后采用矿质水营养液净养7天。

作为优选，步骤1中水蛭为经饥饿处理的水蛭，饥饿处理的时间为20～40天。

优选地，饥饿处理的时间为30天。

作为优选，高铁酸钾溶液的浓度为15～25mg/L。

优选地，高铁酸钾溶液的浓度为20mg/L。

作为优选，步骤1中含有氯霉素类抗生素的无菌脱纤维牛血为含有50～150mg/L氯霉素类抗生素的无菌脱纤维牛血。

优选地，含有氯霉素类抗生素的无菌脱纤维牛血为含有100mg/L氯霉素类抗生素的无菌脱纤维牛血。

作为优选，步骤2或步骤4中含有喹诺酮类抗生素的无菌脱纤维牛血为含有80～120mg/L喹诺酮类抗生素的无菌脱纤维牛血。

优选地，含有喹诺酮类抗生素的无菌脱纤维牛血为含有100mg/L喹诺酮类抗生素的无菌脱纤维牛血。

作为优选，步骤3中含有氯霉素类抗生素或第三代头孢类抗生素的矿质水营养液为含有50～150mg/L氯霉素类抗生素或者50～150mg/L第三代头孢类抗生素的矿质水营养液。

优选地，步骤3中含有氯霉素类抗生素的矿质水营养液为含有100mg/L氯霉素类抗生素的矿质水营养液。

优选地，步骤3中含有第三代头孢类抗生素的矿质水营养液为含有100mg/L第三代头孢类抗生素的矿质水营养液。

作为优选，水蛭的一次饲喂量为3～5mL/条。

优选地，水蛭的一次饲喂量为4mL/条。

作为优选，氯霉素类抗生素为氯霉素。但氯霉素类抗生素的种类并非限定于此，本领域技术人员认可的氯霉素类抗生素种类均在本发明的保护范围之内。

第三代头孢类抗生素为头孢曲松和/或头孢哌酮。但第三代头孢类抗生素的种类并非限定于此，本领域技术人员认可的第三代头孢类抗生素种类均在本发明的保护范围之内。

作为优选，喹诺酮类抗生素为环丙沙星和/或左氧氟沙星。但喹诺酮类抗生素的种类并非限定于此，本领域技术人员认可的喹诺酮类抗生素种类均在本发明的保护范围之内。

作为优选，经致病菌药敏纸片实验检验后，第三代头孢类抗生素，如头孢曲松、头孢哌酮等均可以替代上述氯霉素类抗生素使用。

作为优选，水蛭为吸血水蛭，如菲牛蛭、日本医蛭，但本领域技术人员认可的吸血水蛭均在本发明保护范围之内。

作为优选，饲喂方法为：将无菌脱纤维牛血灌入肠衣，两端扎紧，让水蛭充分取食，待饲喂2.5～3h。

作为优选，肠衣均为灭菌的天然肠衣、人造肠衣、胶原肠衣或盐渍天然肠衣。

作为优选，肠衣的灭菌处理：20mg/L的高铁酸钾溶液中15-20min，无菌水漂洗3次，每次5min。

本发明提供了医用水蛭的矿质水营养液及其灭菌消毒方法。该矿质水营养液包括氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、碳酸氢钠、硫酸锌和水。本发明具有的技术效果为：

本发明灭菌消毒方法可以简单快速的获得无致病菌的水蛭，为水蛭活体疗法在临床治疗应用提供安全保障，也为医疗风险评估提供科学依据。

本发明在无菌的环境条件下，经过一系列化学消毒剂和抗生素消毒灭菌处理，可以实现批量生产医用级的菲牛蛭。本发明相比传统水蛭养殖和除菌方案具有显著优点，既能在较短时间内使水蛭在身体内外均达到无条件致病菌的状态，从而确保在实施水蛭活体疗法过程中，使患者减少或者避免因水蛭携带的病菌引起的感染。因此，该发明有利于提高水蛭活体治疗技术的安全性，有助于促进水蛭活体疗法的规范推广和医用级水蛭活体产品相关标准建立。

具体实施方式

本发明公开了医用水蛭的矿质水营养液及其灭菌消毒方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明内容包括：1)选用平均体重达到2-5g左右菲牛蛭个体，在无菌矿质水营养液中饥饿净养30天左右。2)用高铁酸钾、氯霉素类或者第三代头孢类抗生素溶液进行体表交替消毒灭菌；3)同时饲喂含不同类型(如氯霉素类、第三代头孢类和喹诺酮类)抗生素无菌脱纤维牛血进行体内交替消毒灭菌。4)按照《全国临床检验操作规程》进行细菌分离培养，进行致病菌的检测和鉴定。5)对检验经消毒灭菌处理对水蛭活跃度和吮吸能力进行检测评估。结果显示在无菌的环境条件下，经过一系列化学消毒剂和抗生素消毒灭菌处理，可以实现批量生产医用级的菲牛蛭。本发明相比传统水蛭养殖和除菌方案具有显著优点，既能在较短时间内使水蛭达到无条件致病菌的状态，同时又保持水蛭的活力和吮吸能力，从而确保在实施水蛭活体疗法过程中，使患者减少或者避免因水蛭携带的病菌引起的感染。因此，该发明有利于提高水蛭活体治疗技术的安全性，有助于促进水蛭活体疗法的规范推广和医用级水蛭活体产品相关标准建立。

本发明灭菌消毒方法包括：

1.挑选吸血水蛭成体：根据体重、颜色和活跃度大小，挑选来自国内不同地区的质量较优的野生或者人工培育饲养的成年菲牛蛭，要求生长1年以上，体重在2g以上，目测健壮活泼、色泽光润油亮同一批次的成年活体水蛭。在室内玻璃缸里进行净养，密度为20条/L矿质水营养液，水温控制在20-30度，每3天换水1次，饥饿一个月。

2.在无菌培养室，采用体表和体内轮换交替杀毒灭菌。具体为：

第一周：首先将处理组水蛭浸泡在20mg/L的高铁酸钾溶液中15-20分钟，无菌水冲洗3次，每次5min，随即饲喂含100mg/L氯霉素的无菌脱纤维牛血1次，然后用营养液净养7天。具体饲喂方法是：先将玻璃缸矿质水营养液倒掉，将无菌脱纤维牛血灌入每条长度左右为10cm所述的灭菌原肠衣，两端用绳子扎紧，放入玻璃缸底部，让水蛭充分取食，待饲喂2.5-3h后将剩余无菌脱纤维牛血的肠衣取出做无害化处理。饲喂过程中无菌脱纤维牛血用量为3-5mL无菌脱纤维牛血/条水蛭(注意每次吸血过多超过5mL时，容易导致消化不良吐血而死亡)。每次喂完无菌脱纤维牛血后清理玻璃缸，更换1次矿质水营养液。注意每次换液的时候须把水蛭蜕皮吸掉以免影响水质。在期间喂食过程中观察并清除死亡或者受伤个体。

第二周采用含100mg/L环丙沙星的无菌脱纤维牛血饲喂1次(饲喂方法如上所述，要确保每条水蛭都能取食到2mL左右)，然后用矿质水营养液净养7天。

第三周采用含100mg/L氯霉素的矿质水营养液净养7天。

第四周用含100mg/L环丙沙星的无菌脱纤维牛血喂养一次(饲喂方法如上所述，要确保每条水蛭都能取食到2mL左右)，然后用矿质水营养液净养7天。

矿质水营养液配方为：40mg/L氯化钠，30mg/L氯化钙，15mg/L硫酸镁，15mg/L硫酸亚铁，10mg/L碳酸氢钠和0.05mg/L硫酸锌。

本发明提供的医用水蛭的矿质水营养液及其灭菌消毒方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1、菲牛蛭活体消毒灭菌实验

一、环境消毒处理

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。菲牛蛭的消毒灭菌和净养均在无菌室内操作。水蛭消毒灭菌的无菌室必须达到无菌实验室的标准要求，缓冲间和操作间应装有紫外线杀菌灯用于空气消毒。工作人员进出无菌室均要求戴好口罩帽子和手套鞋套，穿好无菌服。紫外线杀菌灯1m以内距离杀菌效果最佳，每次开灯照射时间为30min。应定期检查紫外线灯辐射强度。对使用的器械、器皿和配制的各种溶液全部进行消毒处理。

二、试验材料

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。菲牛蛭成体由广西复鑫益生物科技有限公司提供。无菌脱纤维牛血购自南京森贝伽生物科技有限公司。

高铁酸钾粉末为Maclin品牌购于苏州科创生物有限公司。抗生素、氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、碳酸氢钠和硫酸锌均购自上海生工生物工程有限公司。

矿质水营养液具体配方是：40mg/L氯化钠，30mg/L氯化钙，15mg/L硫酸镁，15mg/L硫酸亚铁，10mg/L碳酸氢钠和0.05mg/L硫酸锌。

胶原肠衣(或者盐渍肠衣)灭菌处理：取肠衣浸泡在无菌水里2天，每隔12个小时换水一次，期间定期搅动，使肠衣变软除盐。最后放入20mg/L高铁酸钾溶液中浸泡15-20分钟，再用无菌水漂洗3次，每次10min。

三、具体实施步骤

1.由广西复鑫益生物科技有限公司提供生态养殖场的鲜活水蛭，挑选每个体重在3±0.6g水蛭800条，饥饿一个月。按照每组200条，共分成4组，分别放入盛有10L矿质水营养液的玻璃缸进行遮光净养，水温控制在25-28℃。其中对照组为非杀毒灭菌处理组，其余3个组均采用下面相同方式进行杀毒灭菌处理(又称处理组)。消毒杀菌实验时间为期4个周。

2.在无菌室进行水蛭的消毒灭菌处理。

第一周：首先将处理组水蛭浸泡在20mg/L的高铁酸钾溶液中15-20分钟，无菌水冲洗3次，每次5min，随即饲喂含100mg/L氯霉素的无菌脱纤维牛血1次，然后用矿质水营养液净养7天。具体饲喂方法是：先将玻璃缸营养液倒掉，将无菌脱纤维牛血灌入每条长度为10cm左右所述的灭菌胶原肠衣(或者盐渍天然肠衣)，两端用绳子扎紧，放入玻璃缸底部，让水蛭充分取食，待饲喂2.5-3h后将剩余无菌脱纤维牛血的肠衣取出做无害化处理。饲喂过程中无菌脱纤维牛血用量为3-5mL无菌脱纤维牛血/条水蛭(注意每次吸血过多超过5mL时，容易导致消化不良吐血而死亡)。每次喂完无菌脱纤维牛血后清理玻璃缸，更换1次矿质水营养液。注意每次换液的时候须把水蛭蜕皮吸掉以免影响水质。在期间喂食过程中观察并清除死亡或者受伤个体。

第二周采用含100mg/L环丙沙星的无菌脱纤维牛血饲喂1次(饲喂方法如上所述，要确保每条水蛭都能取食到2mL左右)，然后用矿质水营养液净养7天。

第三周采用含100mg/L氯霉素的矿质水营养液净养7天。

第四周用含100mg/L环丙沙星的无菌脱纤维牛血喂养一次(饲喂方法如上所述，要确保每条水蛭都能取食到2mL左右)，然后用矿质水营养液净养7天。

3.水蛭在进行体外和体内灭菌净养期间，一方面每天定时观察水蛭生存状态并统计其存活率。

存活率％＝每周存活数量/水蛭总数量×100％；

4.每周的周末对各组随机抽取10条水蛭检测其携带致病菌情况，进行细菌培养鉴定。

致病菌率％＝每周检出携带致病菌的水蛭数量/水蛭总数×100％；

处理组为3次重复相同的消毒灭菌处理方式，对照组为非消毒灭菌组，各组N＝10。具体检测步骤如下：

1)水蛭的致病菌检测与鉴定方法：在无菌操作台中，将待测的水蛭放置无菌解剖盘里，用无菌棉签刮取其口腔、腹面和背面的粘液，然后放入加有3mL灭菌生理盐水的无菌试管中，震荡混匀10min。接着将水蛭放入75％乙醇溶液里5min后取出，用手术刀解剖水蛭内脏，用镊子取出一段肠道组织，放入装有3mL生理盐水的试管震荡混匀10min。取上述来自体表和体内样品各100微升样品，分别涂布于不同的营养琼脂平板上，倒置后于30℃恒温培养箱培养一周，期间观察平板上是否有菌落生长。

2)如果有菌落生长，先利用PCR技术进行16S rRNA基因的快速检测，在此基础上，再参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《全国临床检验操作规程》的方法对细菌进行生化反应指标鉴定。

3)16SrRNA基因鉴定的具体步骤：

①引物设计：采用通用引物扩增16SrRNA基因，引物序列为

正向引物F27：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

反向引物1429R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，

预计目的片段1400bp左右。引物由上海生工生物工程公司合成。

②16SrRNA PCR扩增与序列分析：分离株DNA模板用细菌基因组DNA提取试剂盒提取。以提取的基因组DNA为模板，对其16SrRNA进行PCR扩增。50微升的PCR反应体系为：PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性1min、58℃复性1min、72℃延伸1min，30个循环；72℃温育10min。取5微升产物在gelred染色剂的1％琼脂糖凝胶上电泳，电泳结束后将胶放入凝胶成像系统，拍照观察结果。PCR扩增产物由上海生工生物工程公司进行测序测定。

③序列比对：所测序列在NCBI中利用Blastn软件与GenBank基因库中已知的16SrRNA序列进行同源性分析，选取同源性较高的序列并利用Mega软件进行多重比较后构建系统进化树。

4)再结合细菌形态特征(革兰氏染色后在显微镜下观察得到)和生理生化反应确定菌的种类。若结果都表明无致病菌，则说明水蛭产品合格。否则继续净养(注意更换抗生素)进行杀菌，直至无检出致病菌为止采用。最终检测鉴定菌落种类归属是否为致病菌。

5.在用于活体疗法之前，如发现不合格水蛭(检出致病菌)，必须再对同一个批次净养水蛭重新采取上述步骤3进行杀毒灭菌处理，直至未检出致病菌时才视为检测水蛭产品合格。挑选合格批次的水蛭供水蛭活体疗法使用，运输过程中要求无菌容器分装，确保在每一个环节水蛭体表和体内都达到医疗无致病菌标准。

6.试验结果

实验结果详见表1。

表1、消毒灭菌水蛭与非消毒灭菌水蛭的存活率与致病菌率对比

注：每周存活率％＝每周存活数量/水蛭总数量×100％；；致病菌率％＝每周检出致病菌的水蛭数量/水蛭总数×100％；对照组为非消毒灭菌实验，处理组为3次重复相同方式的消毒灭菌处理，各组N＝10。

从表1中可以看出，在水蛭经过消毒灭菌处理后平均存活率高达97.5％，与对照组相比无明显差异，说明处理组经药物灭菌处理后对水蛭存活基本没有影响；同时也可以看出，在采取水蛭体表和体内灭菌处理的4个周以后，水蛭的平均无致病菌率仍可达95％，而对照组则是100％携带致病菌。更重要的是，经过药物处理后的第三和第四周，携带致病菌的水蛭数量为零，这充分显示出通过本方法可以简单快速的获得无致病菌的水蛭，为水蛭活体疗法在临床治疗应用提供安全保障，也为医疗风险评估提供科学依据。

对比例1

参照申请公布号CN 105684996 A、发明名称为“一种医用级吸血水蛭养殖方法”的中国专利具体实施方式部分的阻断病原体、采用4万单位庆大霉素的生理盐水浸泡、喂食灭菌后的猪血饲料、在洁净的室内空间里投放大菌落益生菌的养殖水体中饲养。取日本医蛭30条与实施例1中处理试验中相同数量的菲牛蛭，在相同条件下分别对致病菌率和存活率指标进行检测比较试验，结果见表2。

表2、实施例1与对比例1致病菌率和存活率指标对比

注：N＝30

由表2可知，实施例1与对比例1在水蛭平均存活率分别为97.5％和96.7％，两者差异不大；而水蛭携带致病菌情况两者差异显著，实施例1平均致病菌率仅为5％；对比例1则平均致病菌率高达93.1％。因此，对比例1方法达不到医用级水蛭灭菌消毒要求。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种医用水蛭的灭菌消毒方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将水蛭浸泡于高铁酸钾溶液中15～20min，无菌水冲洗3次，每次5min；随即移至矿质水营养液中净养1～2天，然后饲喂含有氯霉素类抗生素的无菌脱纤维牛血，之后移至矿质水营养液中净养6～8天；

所述矿质水营养液包括氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁、碳酸氢钠、硫酸锌和无菌水；所述矿质水营养液中各组分的浓度为：氯化钠30～50mg/L，氯化钙20～40mg/L，硫酸镁10～20mg/L，硫酸亚铁10～20mg/L，碳酸氢钠5～15mg/L，硫酸锌0.01～0.10mg/L，无菌水补足；

步骤2：饲喂含有喹诺酮类抗生素的无菌脱纤维牛血，然后采用矿质水营养液净养6～8天；

步骤3：将水蛭移至含有氯霉素类抗生素或第三代头孢类抗生素的矿质水营养液中，净养6～8天；

步骤4：饲喂含有喹诺酮类抗生素的无菌脱纤维牛血，然后采用矿质水营养液净养6～8天。

2.根据权利要求1所述的灭菌消毒方法，其特征在于，所述矿质水营养液中各组分的浓度为：氯化钠40mg/L，氯化钙30mg/L，硫酸镁15mg/L，硫酸亚铁15mg/L，碳酸氢钠10mg/L，硫酸锌0.05mg/L，无菌水补足。

3.根据权利要求1所述的灭菌消毒方法，其特征在于，步骤1中所述水蛭为经饥饿处理的水蛭，所述饥饿处理的时间为20～40天。

4.根据权利要求1所述的灭菌消毒方法，其特征在于，所述高铁酸钾溶液的浓度为15～25mg/L。

5.根据权利要求1所述的灭菌消毒方法，其特征在于，步骤1中所述含有氯霉素类抗生素的无菌脱纤维牛血为含有50～150mg/L氯霉素类抗生素的无菌脱纤维牛血。

6.根据权利要求1所述的灭菌消毒方法，其特征在于，步骤2或步骤4中所述含有喹诺酮类抗生素的无菌脱纤维牛血为含有80～120mg/L喹诺酮类抗生素的无菌脱纤维牛血。

7.根据权利要求1所述的灭菌消毒方法，其特征在于，步骤3中所述含有氯霉素类抗生素或第三代头孢类抗生素的矿质水营养液为含有50～150mg/L氯霉素类抗生素或含有50～150mg/L第三代头孢类抗生素的矿质水营养液。

8.根据权利要求1～7任一项所述的灭菌消毒方法，其特征在于，所述水蛭的一次饲喂量为1.5～2.5mL/条；所述氯霉素类抗生素为氯霉素；所述第三代头孢类抗生素为头孢曲松和/或头孢哌酮；所述喹诺酮类抗生素为环丙沙星和/或左氧氟沙星。