CN108434438A - 抗菌肽在制备治疗幽门螺杆菌病的药物中的用途以及药物组合物 - Google Patents

抗菌肽在制备治疗幽门螺杆菌病的药物中的用途以及药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗菌肽在制备治疗幽门螺杆菌病的药物中的用途以及药物组合物,涉及药物领域。发明人研究发现,氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的抗菌肽对幽门螺杆菌有较强的杀灭活性,可作为活性成分用于制备治疗幽门螺旋杆菌病的药物。包括该抗菌肽和蜂蜜的药物组合物,由于蜂蜜能够增强抗菌肽杀灭幽门螺杆菌的活性,使得该药物组合物抗幽门螺杆菌的作用更加显著。

Description

抗菌肽在制备治疗幽门螺杆菌病的药物中的用途以及药物组 合物
技术领域
本发明涉及药物领域,具体而言,涉及一种抗菌肽在制备治疗幽门螺杆菌病的药物中的用途以及药物组合物。
背景技术
幽门螺杆菌是上世纪80年代由澳大利亚两位科学家发现并于2005年获得诺贝尔生理学奖。目前,世界上有50%以上的人口感染有这种病原菌,其中20%的感染者将会引起慢性胃炎、消化性和十二指肠溃疡、胃癌和粘膜相关淋巴组织瘤的临床症状。世界卫生组织已把它列为Ⅰ类致癌原。在发展中国家更加广泛流行,我国有些地区人口感染率高达60%以上。
要杀灭病原微生物药物浓度必须达到最小杀菌浓度,幽门螺杆菌定植在人的胃黏膜上皮细胞,口服抗菌药物因胃的排空,药物在胃中滞留时间只能2-4小时,实际在1小时后药物存留在胃中的量已经显著减小,难以达到最小杀菌浓度,药物浓度达不到杀菌作用,在药物的选择压力下反而致使幽门螺杆菌对多种抗生素产生耐药性。因此,发现一种能增强抗菌药物杀菌动力学的试剂对幽门螺杆菌的治疗具有重大的价值。
目前,采用抗生素治疗幽门螺杆菌感染的方法中,细菌容易通过变异对抗生素产生抗性,即出现耐药菌。随着抗生素耐药菌株的增加、重新感染、并发症和高治疗费用及治疗依从性差等因素,使得抗生素无法对幽门螺杆菌感染进行根治。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种抗菌肽在制备治疗幽门螺杆菌病的药物中的用途,该抗菌肽对幽门螺杆菌有较强的杀灭活性,可作为活性成分用于制备治疗幽门螺旋杆菌病的药物。
本发明的第二目的在于提供一种抗幽门螺杆菌组合物,该组合物包括抗菌肽和蜂蜜,蜂蜜能够增强抗菌肽杀灭幽门螺杆菌的活性,使得该组合物抗幽门螺杆菌的作用显著。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
一种抗菌肽在制备治疗幽门螺杆菌病的药物中的用途,该抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种编码抗菌肽的基因在制备治疗幽门螺杆菌病的药物中的用途,该抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地,上述幽门螺杆菌病包括由幽门螺杆菌感染引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤、胃癌。
一种用于治疗幽门螺杆菌病的药物组合物,其包括如SEQ ID NO:1所示的抗菌肽、以及医药学上可接受的载体或辅料。
进一步地,在本发明较佳的实施例中,上述药物组合物还包括蜂蜜。
一种抗幽门螺杆菌组合物,其包括抗菌肽和蜂蜜。
进一步地,在本发明较佳的实施例中,上述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1~2所示。
其中,SEQ ID NO:1所示的抗菌肽,记为BLP-1,其序列为:GIGAS ILSAG KSALKGLAKG LAEHF AN。
SEQ ID NO:2所示的抗菌肽,记为PGQ,其序列为:GVLSN VIGYL KKLGT GALNAVLKQ。
进一步地,在本发明较佳的实施例中,上述抗菌肽与蜂蜜的质量比为1:1000~20000;优选地,该质量比为1:5000~15000;或者,该质量比为1:8000~12000;或者1:9000~11000。
进一步地,在本发明较佳的实施例中,上述蜂蜜选自椴树蜜、枇杷蜜、枣花蜜和五味子花蜜中的至少一种;优选地,上述蜂蜜为椴树蜜。
一种蜂蜜在提高抗菌肽的抗幽门螺杆菌活性的增效剂中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本公开内容提供了一种抗菌肽的新用途,该抗菌肽是从抗菌肽库中筛选出的具有强抗幽门螺杆菌活性的抗菌肽。实验表明,该抗菌肽能够杀灭幽门螺杆菌,说明其对幽门螺杆菌感染所致的疾病具有较好的疗效,有利于解决幽门螺杆菌感染治疗中出现的抗生素耐药及其副作用的巨大医学难题。
本公开内容提供了一种抗幽门螺杆菌组合物,该抗幽门螺杆菌组合物包括抗菌肽和蜂蜜。实验表明,蜂蜜自身虽然表现出一定的抑制幽门螺杆菌的作用,然而胃的排空和胃液的稀释,使得蜂蜜在胃中不可能长时间保持高浓度,因而使其对幽门螺杆菌的抑制作用是暂时的,其对幽门螺杆菌感染所致的疾病基本没有治疗作用。而当蜂蜜与具有抗幽门螺杆菌活性的抗菌肽混合使用时,蜂蜜能够增强抗菌肽杀灭幽门螺杆菌的活性,具有协同增效的作用,且具有口服安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实验例2中1-苯基萘胺荧光试验结果;
图2为实验例2中碘化丙啶荧光试验结果;
图3为实验例3中三种样品的杀菌动力学测试结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述:
实验例1
本实验例提供一种具有抗幽门螺旋杆菌活性的抗菌肽,其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
该抗菌肽的筛选和抗幽门螺杆菌的实验过程如下:
a.抗菌肽的筛选:抗菌肽如同抗生素具有自己独特的抗菌谱,不是所有的抗菌肽对幽门螺旋杆菌都具有抗菌活性,发明人通过实验研究,从数以万计的抗菌肽库中筛选出目标抗菌肽,序列为:GIGAS ILSAG KSALK GLAKG LAEHF AN,即SEQ ID NO:1所示的抗菌肽,记为BLP-1,并通过化学方法合成得到,纯度为95%。
b.幽门螺杆菌培养及细菌数的确定:配制培养基,将供试菌种接种于幽门螺杆菌液体培养基试管内,在放有微需氧产气袋的密闭培养罐中37℃震荡培养36h,将各菌种转移至幽门螺杆菌固体培养基进一步活化,用刮铲刮下菌苔用生理盐水制成0.5麦氏管细菌悬浊液,其中幽门螺杆菌的浓度为108CFU/mL。
c.检测抗菌肽的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度:取24支无菌的试管向每个试管加灭菌的幽门螺杆菌液体培养基1mL,分成3组,每组8支试管,用倍比稀释法,将抗菌肽依次稀释为最终药液浓度分别为128、64、32、16、8、4、2μg/mL。向每支1mL含不同药液浓度试管中加入108CFU/mL的幽门螺杆菌菌液10μL保证每支试管含幽门螺杆菌数为106CFU/mL,在放有微需氧产气袋的密闭培养罐中37℃震荡培养36h,观察试管浑浊状态,出现浑浊前的试管中抗菌肽的浓度即为最小抑菌浓度(MIC)。
将取5μL澄清试管中的培养物接种于固体培养基,在微需氧37℃培养36h,无菌落出现前一试管中的抗菌肽的浓度即为最小杀菌浓度。
检测结果:
抗菌肽BLP-1对幽门螺杆菌的最小抑菌浓度为:4μg/mL
抗菌肽BLP-1对幽门螺杆菌的最小杀菌浓度为:16μg/mL。
实验例2
本实验例提供抗菌肽BLP-1及包含该抗菌肽BLP-1的组合物的抗幽门螺杆菌活性试验:
A.1-苯基萘胺(1-N-phenyl-naphthylamine,NPN)荧光试验:
试验原理:1-苯基萘胺在水溶液中荧光较弱,然而当1-苯基萘胺渗透到细菌细胞壁外膜疏水环境后,其荧光增强。因此,根据1-苯基萘胺的荧光强弱程度,即可判断各样品穿透幽门螺杆菌细胞壁外膜的能力强弱。
试验过程:将50mL的对数生长期的幽门螺杆菌离心后,收集细胞悬浮在5mM N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸钠缓冲液(sodium N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid,HEPES,pH7.2),配制下述三种样品(4mL):
(1)1mL的幽门螺杆菌悬液+1mL40%浓度蜂蜜+1mL 5mM HEPES+1mL PBS(pH=7.2);
(2)1mL的幽门螺杆菌悬液+1mL 4μg/mL抗菌肽+1mL 5mM HEPES+1mL PBS(pH=7.2);
(3)1mL的幽门螺杆菌悬液+1mL 4μg/mL抗菌肽+1mL40%浓度蜂蜜+1mL 5mMHEPES。
调整OD600至0.5,每间隔30秒测上述三种样品的荧光度值,当荧光度值不在增加为止。其中,在本实施例中,40%浓度的蜂蜜为质量百分浓度,即100mg的水中溶解40mg的蜂蜜;在本实施例中,蜂蜜为椴树蜜。
测试结果如图1所示,由图1可知,抗菌肽本身具有一定的穿透幽门螺杆菌细胞壁外膜的能力,而蜂蜜+抗菌肽组的荧光密度显著增强,说明蜂蜜具有加强抗菌肽穿透幽门螺杆菌细胞壁外膜的能力。
B.碘化丙啶(propidium iodide,PI)荧光试验:
试验原理:碘化丙啶在溶液中无荧光,当细菌的细胞膜被破坏后,碘化丙啶能够进入细胞并与DNA结合发出红色的荧光。因此,根据溶液中荧光的强弱程度,即可判断各样品破坏幽门螺杆菌细胞膜的能力。
试验过程:用幽门螺杆菌悬浮液(OD600的光密度值0.5)配制下述三种样品(3mL):
(1)1mL的幽门螺杆菌悬液+1mL40%浓度蜂蜜+1mL PBS(pH=7.2);
(2)1mL的幽门螺杆菌悬液+1mL 12μg/mL抗菌肽+1mL PBS(pH=7.2);
(3)1mL的幽门螺杆菌悬液+1mL 12μg/mL抗菌肽+1mL40%浓度蜂蜜。
将上述三种样品在37℃下共浴1h,然后各加入1mL 200μM的PI在室温黑暗共浴5min,随后在荧光共聚焦显微镜下观察,结果如图2所示。
由图2可见,抗菌肽对幽门螺杆菌的细胞膜具有一定的破坏作用,蜂蜜对幽门螺杆菌的细胞膜没有破坏作用,而抗菌肽+蜂蜜组中荧光增多,由此说明蜂蜜具有增强抗菌肽破坏幽门螺杆菌细胞膜的能力。
C.杀菌动力学:
用最小杀菌浓度的抗菌肽溶于生理盐水和溶于40%的蜂蜜,研究其对幽门螺杆菌的杀菌动力学,具体分三种情况:
(1)含40%蜂蜜的培养基中幽门螺杆菌数为106CFU/mL;
(2)含16μg/mL抗菌肽的培养基中幽门螺杆菌数为106CFU/mL;
(3)含40%蜂蜜和16μg/mL抗菌肽的培养基中幽门螺杆菌数为106CFU/mL。
将上述三种样品充分混合后,采用在微需氧条件下,37℃,200r/min震荡培养,分别在5、20、30、45、60min时取5μL混合物(每个样品取3份)至固体培养基中在微需氧条件,37℃培养36h,观察并计算菌落生长状况。结果见图3。
由图3可见,蜂蜜+抗菌肽组对幽门螺杆菌的抑菌效果最强,抗菌肽组次之,蜂蜜组表现出非常轻微的抗幽门螺杆菌活性。
D.动物试验:
建立小鼠幽门螺杆菌感染动物模型,每组各10只,分别分为:不予治疗的对照组、单独口服40%的蜂蜜组、抗菌肽(60mg/kg体重)组、抗菌肽(60mg/kg体重)溶于40%的蜂蜜组,治疗1周后,处死小鼠,对各组小鼠中胃中幽门螺杆菌进行计数,结果见表1:
表1.各实验组中小鼠胃中幽门螺杆菌的计数结果
由表1可见,经最低杀菌浓度的抗菌肽治疗1周后,最低杀菌浓度的抗菌肽对小鼠胃中幽门螺杆菌的根除率为20%,小鼠胃中定植的幽门螺杆菌的对数值为4.89±0.58;而当最低杀菌浓度的抗菌肽与蜂蜜共同给药后,其对小鼠胃中幽门螺杆菌的根除率为100%,且在小鼠胃中没有检测到定植的幽门螺杆菌,由此说明,蜂蜜能够增强抗菌肽根除幽门螺杆菌的能力,提示包含抗菌肽和蜂蜜的药物组合物对幽门螺杆菌具有极强的根除能力。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明,然而应意识到,在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此,这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽科技学院
<120> 一种抗菌肽在制备治疗幽门螺杆菌病的药物中的用途以及药物组合物
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Ile Gly Ala Ser Ile Leu Ser Ala Gly Lys Ser Ala Leu Lys Gly
1 5 10 15
Leu Ala Lys Gly Leu Ala Glu His Phe Ala Asn
20 25
<210> 2
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Val Leu Ser Asn Val Ile Gly Tyr Leu Lys Lys Leu Gly Thr Gly
1 5 10 15
Ala Leu Asn Ala Val Leu Lys Gln
20

Claims (10)

1.一种抗菌肽在制备治疗幽门螺杆菌病的药物中的用途,其特征在于,所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种编码抗菌肽的基因在制备治疗幽门螺杆菌病的药物中的用途,其特征在于,所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述幽门螺杆菌病包括由幽门螺杆菌感染引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤、胃癌。
4.一种用于治疗幽门螺杆菌病的药物组合物,其特征在于,其包括如SEQ ID NO:1所示的抗菌肽、以及医药学上可接受的载体或辅料。
5.根据权利要求4所述的药物组合物,其特征在于,还包括蜂蜜。
6.一种抗幽门螺杆菌组合物,其特征在于,其包括抗菌肽和蜂蜜。
7.根据权利要求6所述的抗幽门螺杆菌组合物,其特征在于,所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1~2所示。
8.根据权利要求5所述的抗幽门螺杆菌组合物,其特征在于,所述抗菌肽与所述蜂蜜的质量比为1:1000~20000。
9.根据权利要求5所述的抗幽门螺杆菌组合物,其特征在于,所述蜂蜜选自椴树蜜、枇杷蜜、枣花蜜和五味子花蜜中的至少一种。
10.一种蜂蜜在提高抗菌肽的抗幽门螺杆菌活性的增效剂中的应用。
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