CN110078794A

CN110078794A - 一种抗菌肽及其应用

Info

Publication number: CN110078794A
Application number: CN201910354712.6A
Authority: CN
Inventors: 赵望泓; 梁东生; 梁靖恒
Original assignee: Southern Hospital Southern Medical University
Current assignee: Southern Hospital Southern Medical University
Priority date: 2019-04-29
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2039-04-29
Also published as: CN110078794B

Abstract

本发明公开了一种抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：7中任一种所示。本发明中的抗菌肽能更高效地抑制浮游状态和生物膜状态的变异链球菌的活性，在具有快速杀菌效果、低细胞毒性和高抗生物膜活性的同时，还具有合成简易和生产成本低的优点，可用于大量合成，有利于临床转化。

Description

一种抗菌肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种抗菌肽及其应用。

背景技术

龋病是在以细菌为主的多种因素影响下，牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种最常见的口腔疾病。它不仅影响着牙齿的美观和功能行使，还会继发牙髓炎、根尖周炎等严重的并发症，甚至可发展成为消化系统疾病、心血管疾病等全身系统性疾病的隐患。牙菌斑生物膜是龋病发生的始动因子，它是一个以细菌为主定植于牙齿表面的微生态环境，所含细菌的种类繁多，既包括致龋菌，也含有大量非致龋菌，并且细菌之间存在共生、竞争和拮抗作用。变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)作为最主要的致龋菌，其生长受到多种非致龋菌的影响。

目前防龋的方法主要有氟化物类、洗必泰类以及抗生素类等，但容易引起耐药、黏膜着色等副作用。所以，寻找安全有效的生态防龋方法是一个需要迫切解决的问题。

抗菌肽是由宿主产生的能抵御外界微生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子多肽类物质，具有独特的抗菌作用快速、不易形成耐药等生物学特性，不仅可抑制多种细菌、真菌、病毒，而且对传统抗生素耐药菌也有较好的抑制作用。

目前，抗菌肽在龋病防治领域的研究主要集中在天然抗菌肽及其衍生物方面，天然抗菌肽α-防御素、β-防御素、LL-37、nisin、histatin 5和pleurocidin，以及它们的衍生肽是目前研究较多的防治龋病的抗菌肽。同时，也出现了针对变异链球菌的靶向肽，比如CSPC16和G2、CSPM8与NRC-4组成的靶向肽，能特异性杀灭变异链球菌。

抗菌肽通常是阳离子肽，具有正电性、疏水性和两亲性，可通过多种机制发挥抗菌作用。一方面，可通过桶板模型、地毯模型、环形孔模型、分子电穿孔模型以及沉筏模型作用于菌膜，形成孔洞来破裂菌膜；另一方面，它还可以进入细菌内，通过抑制DNA复制、mRNA转录、蛋白质合成等，来抑制细菌的活性。另外，抗菌肽甚至对宿主细胞还有免疫调控的功能。

但是前面所说的这些天然抗菌肽及其衍生物，以及靶向抗菌肽现有技术，普遍具有以下两点缺点：(1)无论是天然抗菌肽及其衍生肽，还是靶向抗菌肽，它们都具有较长的肽链，这不但造成了合成消耗大、临床转化难的问题，而且由于空间位阻等因素的存在，本身的抗菌效果未必能得到充分的体现；(2)目前抗菌肽和靶向肽的抗菌区域都是采用本身与变异链球菌没有特殊关联的序列，所以它们只是具有单纯的抗菌作用，而不一定具有其他的防龋优势，比如抗变异链球菌生物膜形成的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗菌肽及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：7中任一种所示。

进一步地，抗菌肽的C端需要酰胺化修饰。

上述的抗菌肽在抑制变异链球菌活性中的应用。

一种变异链球菌抑菌剂，其制备原料中含有上述的抗菌肽。

上述的抗菌肽在杀菌中的应用，所述菌为变异链球菌。

一种变异链球菌杀菌剂，其制备原料中含有上述的抗菌肽。

上述的抗菌肽在抑制变异链球菌生物膜形成中的应用。

上述的抗菌肽在制备抑制变异链球菌生物膜形成的组合物中的应用。

上述的抗菌肽在清除成熟的变异链球菌生物膜中的应用。

上述的抗菌肽在制备清除成熟的变异链球菌生物膜的组合物中的应用。

上述的抗菌肽在制备防治龋病药物中的应用。

一种防治龋病药物，其制备原料中含有上述的抗菌肽。

本发明的有益效果是：

本发明中的抗菌肽能更高效地抑制浮游状态和生物膜状态的变异链球菌的活性，在具有快速杀菌效果、低细胞毒性和高抗生物膜活性的同时，还具有合成简易和生产成本低的优点，可用于大量合成，有利于临床转化。

附图说明

图1为1×和2×MBC LR-7对变异链球菌的杀菌时间曲线；

图2为LR-7、氯己定和红霉素对BHI培养基中的变异链球菌生物膜形成的抑制作用；

图3为LR-7、氯己定和红霉素对BHI培养基中的变异链球菌成熟生物膜的清除作用；

图4为LR-7对兔红细胞的溶血活性结果图。

具体实施方式

下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。

实施例1

一种抗菌肽LR-1，其氨基酸序列为：ATGTARKLLDAMA(SEQ ID NO：1)。

实施例2

一种抗菌肽LR-2，其氨基酸序列为：LTRTLRKLLRRMR(SEQ ID NO：2)。

实施例3

一种抗菌肽LR-3，其氨基酸序列为：LRRWLRKLLRRMR(SEQ ID NO：3)。

实施例4

一种抗菌肽LR-4，其氨基酸序列为：LTRTLWKLLRRMR(SEQ ID NO：4)。

实施例5

一种抗菌肽LR-5，其氨基酸序列为：LRRWLRWLLRRMR(SEQ ID NO：5)。

实施例6

一种抗菌肽LR-6，其氨基酸序列为：LWRWLRKLLRRMR(SEQ ID NO：6)。

实施例7

一种抗菌肽LR-7，其氨基酸序列为：LRRWLRWLLRWMR(SEQ ID NO：7)。

实施例1～7中的抗菌肽的C端需要酰胺化修饰。

以下效果验证实验中每个实验均至少设立三个复孔，以及各组计量资料数据均以“均数±标准差”(Mean±SD)的形式表示(除非特殊说明)。利用GraphPad Prism 7.0软件通过单因素方差分析或Kruskal-Wallis H检验的方法进行统计学分析，检验水准α＝0.05，P＜0.05代表具有统计学差异。

一、细菌敏感性实验

实验方法

按照临床和实验室标准协会(CLSI)的推荐指示，我们检测了实施例1～7中抗菌肽以及现有的抗菌肽的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC)。流程如下：在96孔板上用BHI肉汤对各个药物进行倍比稀释，然后加入BHI肉汤调整过的生长对数期的变异链球菌UA159，使最终总体积是200μL/孔，菌的终浓度为1×10⁶CFU/mL，以及抗菌肽的终浓度为1.6～200μg/mL。空白对照组仅有培基而不加入细菌。每组设立三个复孔。将96孔板置于37℃、厌氧环境中孵育24～48h之后，肉眼观察各孔的浑浊程度，其中第一个与空白对照组的浑浊程度无明显差异的孔，它所对应的药物浓度被视为各个药物的MIC。最后从所有肉眼无浑浊的孔中取150μL至BHI琼脂平板上均匀铺开，然后在37℃、厌氧环境中培养2～3d之后，其中第一个没有任何细菌生长的BHI琼脂平板所对应的孔，它所对应的药物浓度被视为各个药物的MBC。

实验结果

如表1所示，为了评估实施例1～7中抗菌肽的抗菌潜能，我们把它与现有的抗变异链球菌的抗菌肽进行抗菌活性的比较，包括了pleurocidin，β-防御素3来源的D1-23，广谱抗菌肽P-novispirin G10来源的G2，组胺素5来源的Dhvar4，以及LL-37。其中，除了LL-37无明显的抗变异链球菌UA159活性以外，其他现有的抗菌肽对变异链球菌UA159的抗菌活性(MICs)显示为4.6～100.4μΜ，而LR-7的MIC为3.2μΜ。也就是说，在抗变异链球菌方面，LR-7表现出优于现有的防治龋病的抗菌肽的抗菌活性。

表1实施例1～7中抗菌肽和现有抗菌肽的序列及抗变异链球菌的活性比较

二、杀菌-时效实验

实验方法

关于LR-7和阳性药物的杀菌动力学检测方法参考传统的杀菌-时效实验。首先在96孔板上用BHI肉汤对各种药物进行稀释，接着加入BHI肉汤调整过的生长对数期的变异链球菌UA159，使最终总体积是200μL/孔，菌的终浓度为1×10⁶CFU/mL，LR-7的终浓度均为1×和2×MBCs、以及氯己定和红霉素的终浓度均为它们各自对应的2×MBCs。快速混匀后便开始计时，在室温下孵育。最后分别在0min，0.5min，1min，1.5min，3min，5min，7min，10min，15min，20min，30min时各取20μL的混匀后的混合液到适量的PBS中稀释、涂板(BHI琼脂平板)。在37℃、厌氧环境中孵育2d之后，准确数出琼脂平板上各种药物在各个时间点存活的菌落数。结果用存活率表示，公式如下：存活率＝各个时间点的存活菌落数/0时的存活菌落数×100％。

实验结果

图1显示了LR-7抗浮游状态的变异链球菌UA159的杀菌能力是具有时间依赖性的，即随着时间的增加，它的杀菌能力越明显。当分别使用浓度为6.4μΜ和12.8μΜ(相当于1×和2×MBCs)的LR-7处理之后，3min内即可分别抑制93.2％、96.6％的变异链球菌的活性，10min内即可完全抑制全部变异链球菌的活性。然而，当分别使用浓度为2×MBCs的氯己定和红霉素后，它们也仅仅分别在本次实验的终点时间(30min)内抑制47.0％、11.4％的变异链球菌的活性。这些结果均表明了LR-7具有相当快速的抗变异链球菌的杀菌能力。LR-7对变异链球菌的杀菌效果强于氯己定和红霉素。

三、抑制变异链球菌生物膜形成的实验

实验方法

关于抗菌肽抑制生物膜形成的实验方法参考经典的结晶紫染色实验。首先在96孔板上用BHIS肉汤对LR-7及阳性药物氯己定和红霉素进行稀释，使其终浓度均为它们各自对应的0.6×、0.8×、1×、2×、4×和8×MICs，接着加入BHIS肉汤调整过的生长对数期的变异链球菌UA159，菌的终浓度为1×10⁶CFU/mL，使最终总体积是200μL/孔。单纯培基和菌液混合液不加入药物作为阴性对照组，而空白对照组仅有培基而不加入细菌。每组设立三个复孔。充分混匀后立即孵育至37℃、厌氧环境中。孵育24h之后，使用PBS小心移除未黏附的变异链球菌和加入100μL无水甲醇/孔固定5min，然后在室温下使用0.1％(w/v)结晶紫溶液对生物膜进行5min的染色，接着使用PBS至少漂洗三次，直至空白对照组的孔无任何着色。最后加入200μL/孔的96％乙醇，在室温、避光和振荡的条件下溶解至少半小时之后使用酶标仪在波长为595nm时检测其OD值。结果用生物膜形成率表示，公式如下：存活率＝(实验组生物膜形成的平均OD₅₉₅-空白对照组生物膜形成的平均OD₅₉₅)/(阴性对照组生物膜形成的平均OD₅₉₅-空白对照组生物膜形成的平均OD₅₉₅)×100％。

实验结果

鉴于对变异链球菌生物膜形成的抑制作用在龋病的防治中具有重要地位，我们检测了LR-7的最小生物膜抑制的浓度(Minimum biofilm inhibitory concentration，MBIC)。如图2所示，LR-7、氯己定和红霉素呈剂量依赖性抑制变异链球菌UA159生物膜形成。当使用浓度为0.8×MIC的LR-10处理24h时，变异链球菌UA159生物膜的形成将会被完全抑制。尽管LR-7和氯己定的MBCI数值均是2×MIC，但LR-7的实际抑制生物膜形成的效果更好，比如在0.6×MIC时，LR-7能够抑制61.1％的变异链球菌UA159生物膜形成，而氯己定仅仅能够抑制它的2.3％。相反地，红霉素需要提高浓度至4×MIC才能完全抑制变异链球菌UA159生物膜的形成。

四、清除成熟的变异链球菌生物膜的实验

实验方法

验证抗菌肽的抗成熟的变异链球菌生物膜的能力所采用的实验方法参考前人的经验总结。首先在96孔板中加入200μL/孔BHI肉汤调整过的生长对数期的变异链球菌UA159，菌的终浓度为1×10⁶CFU/mL。在37℃、厌氧环境中孵育24h之后，小心移除未黏附的变异链球菌，然后加入200μL/孔的BHIS肉汤稀释后的各种药物，使LR-7、氯己定和红霉素的终浓度均为它们各自对应的0、1×、2×、4×、8×和10×MICs。每组设立三个复孔。充分混匀后立即孵育至37℃、厌氧环境中。孵育24h之后，通过以下方法获取成熟的变异链球菌生物膜中的活细胞：用无菌枪头反复多次刮取96孔板中的生物膜至对应的EP管，然后在封闭状态下进行持续5s的超声，以彻底打散生物膜和完全释放生物膜中的活细胞。最后各取20μL的混匀后的混合液到适量的PBS中稀释、涂板(BHI琼脂平板)。在37℃、厌氧环境中孵育2d之后，准确数出琼脂平板上LR-7在各个浓度对应的存活的菌落数。结果用存活菌落数的lg形式表示。

实验结果

如图3所示，LR-7、氯己定和红霉素呈剂量依赖性清除成熟的变异链球菌UA159生物膜。当使用浓度为1×、2×、4×、8×、10×、12×和16×MICs的LR-7处理24h时，分别抑制了1.6％、3.8％、15.3％、15.6％、51.6％、63.4％和75.1％的生物膜中变异链球菌UA159的活性。而浓度为16×MICs的氯己定和红霉素仅分别抑制了大约65.8％和29.5％的生物膜中变异链球菌UA159的活性。也就是说，LR-7比氯己定和红霉素更能有效地清除成熟的变异链球菌生物膜。

五、溶血实验

实验方法

预先分别使用PBS或等渗葡萄糖磷酸(Isotonic glucose phosphate，IGF)缓冲液轻轻地清洗新鲜兔红细胞三遍(离心条件是1000×g，4℃，10min)，最后分别重悬在PBS或IGF缓冲液中。后续操作：在96孔板上分别使用PBS或IGF缓冲液对LR-7进行倍比稀释，然后加入上述PBS或IGF缓冲液重悬过的新鲜兔红细胞，使最终总体积是200μL/孔，兔红细胞的最终比例为2％，抗菌肽的终浓度为3.1～100μg/mL。另外，0.5％Triton X-100组被设立阳性药物组，阴性对照组仅有兔红细胞而不加入药物，以及空白对照组仅有缓冲液而不加入兔红细胞和药物。每组设立三个复孔。将96孔板置于37℃、含5％CO₂的潮湿环境中孵育1h之后，肉眼及镜下确认阳性药物组的兔红细胞已经全部破裂溶解。经离心(1000×g，4℃，10min)，小心转移180μL/孔上清到对应的新96孔板中。使用酶标仪在波长为405nm时检测其OD值，该值反映的是释放至胞外的血红蛋白的量。结果用溶血率表示，公式如下：溶血率＝(实验组平均OD₄₀₅-空白对照组平均OD₄₀₅)/(阳性药物组平均OD₄₀₅-空白对照组平均OD₄₀₅)×100％。

实验结果

如图4所示，1×MIC的LR-7溶血率约为38％，而2×MIC的LR-7溶血率约为49％。不过，考虑到以下两个方面：(1)漱口水的推荐使用时间是5分钟内；(2)LR-7在3min内即可抑制90％以上的变异链球菌，因此我们可以预测到短时间内使用LR-7即可达到高效抗菌效果，也不至于对哺乳细胞产生影响。因此，若短时间内使用LR-7，它仍保持有良好的生物相容性。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学南方医院

<120> 一种抗菌肽及其应用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Ala Thr Gly Thr Ala Arg Lys Leu Leu Asp Ala Met Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Leu Thr Arg Thr Leu Arg Lys Leu Leu Arg Arg Met Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Leu Arg Arg Trp Leu Arg Lys Leu Leu Arg Arg Met Arg

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Leu Thr Arg Thr Leu Trp Lys Leu Leu Arg Arg Met Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Leu Arg Arg Trp Leu Arg Trp Leu Leu Arg Arg Met Arg

1 5 10

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Leu Trp Arg Trp Leu Arg Lys Leu Leu Arg Arg Met Arg

1 5 10

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Leu Arg Arg Trp Leu Arg Trp Leu Leu Arg Trp Met Arg

1 5 10

Claims

1.一种抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：7中任一种所示。

2.根据权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于：抗菌肽的C端需要酰胺化修饰。

3.权利要求1或2所述的抗菌肽在抑制变异链球菌活性中的应用。

4.一种变异链球菌抑菌剂，其特征在于：其制备原料中含有权利要求1或2所述的抗菌肽。

5.权利要求1或2所述的抗菌肽在杀菌中的应用，所述菌为变异链球菌。

6.一种变异链球菌杀菌剂，其特征在于：其制备原料中含有权利要求1或2所述的抗菌肽。

7.权利要求1或2所述的抗菌肽在抑制变异链球菌生物膜形成中的应用。

8.权利要求1或2所述的抗菌肽在清除成熟的变异链球菌生物膜中的应用。

9.权利要求1或2所述的抗菌肽在制备防治龋病药物中的应用。

10.一种防治龋病药物，其特征在于：其制备原料中含有权利要求1或2所述的抗菌肽。