CN113336826B - 抗菌肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗菌肽及其应用，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。所述抗菌肽具有比母肽更高的抗变异链球菌活性和抗变异链球菌生物膜活性，能更高效地抑制浮游状态和生物膜状态的变异链球菌的活性，且毒性低，生物相容性好，具有一定的防龋优势。另外，抗菌肽具有较少的氨基酸和较短的肽链，在其快速杀菌、低细胞毒性和高抗生物膜活性的同时，还具有合成简易和生产成本低的优点，可用于大量合成，使其在微生物抑制剂、抗菌药物以及添加剂等方面显示很好的应用前景。

Description

抗菌肽及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗菌肽及其应用。
背景技术
龋病是在以细菌为主的多种因素影响下，牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种最常见的口腔疾病，其不仅影响牙齿的美观和功能，还会引起牙髓炎、根尖周炎等严重的并发症，甚至可发展成为高血压、糖尿病、心血管疾病等全身系统性疾病的隐患。牙菌斑生物膜是龋病发生的始动因子，它是一个以细菌为主定植于牙齿表面的微生态环境，所含细菌的种类繁多，其中变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)是目前公认最主要的致龋菌。
抗菌肽(Antimicrobial peptides)是一类小分子多肽类物质，具有分子量小、无免疫原性、热稳定性良好、具有较强的生物活性，不仅可杀灭革兰氏阳性/阴性细菌、真菌、病毒，而且对传统抗生素耐药菌亦有较好的抑制作用等特点。目前，天然抗菌肽LL-37、nisin、Histatin 5和pleurocidin等以及它们的衍生肽是目前研究较多的抗菌肽。其中，Histatins5是存在于人类唾液中的一类天然抗菌肽，可对白色念珠菌发挥有效的杀伤作用。1997年，Helmerhorst等根据抗真菌肽Histatin5的活性结构区域，设计并合成了多种类似物，Dhvar4是Histatin5最具代表性的类似物之一。但现有的抗菌肽包括了以下两点缺点：(1)无论是天然抗菌肽及其衍生肽，还是靶向抗菌肽，它们都具有较长的肽链，这不但造成了合成消耗大、临床转化难的问题，而且由于空间位阻等因素的存在，本身的抗菌效果未必能得到充分的体现；(2)目前抗菌肽和靶向肽的抗菌区域都是采用本身与变异链球菌没有特殊关联的序列，所以它们只是具有单纯的抗菌作用，而不一定具有其他的防龋优势，比如抗变异链球菌生物膜形成的活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗菌肽，具有更高的抗变异链球菌活性和抗变异链球菌生物膜活性，能更高效地抑制浮游状态和生物膜状态的变异链球菌的活性，且毒性低，生物相容性好，具有一定的防治和治疗龋齿优势。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
本发明的第二个方面，提供一种核酸分子，编码本发明第一方面所述的多肽。
本发明的第三个方面，提供一种载体，含有本发明第二方面所述的核酸分子。
本发明的第四个方面，提供一种细胞，含有本发明第三方面所述的载体。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞非植物或动物品种。
本发明的第五个方面，提供本发明第一方面所述多肽或本发明第二方面所述核酸分子或本发明第三方面所述载体或本发明第四方面所述细胞在以下(I)-(VI)至少一项中的应用：
(I)制备抑菌剂；
(II)制备抑制牙菌斑生物膜形成的制剂；
(III)制备清除成熟牙菌斑生物膜的制剂；
(IV)制备药物；
(V)制备添加剂；
(VI)制备口腔用品。
在本发明的一些实施方式中，所述菌为变异链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis，E.faecalis)、远缘链球菌(Streptococcussobrinus，S.sobrinus)、戈登链球菌(Streptococcus gordonii，S.gordonii)、血链球菌(Streptococcus sanguinis，S.sanguinis)。
在本发明的一些优选实施方式中，所述菌为变异链球菌。
在本发明的一些实施方式中，所述添加剂为食品添加剂、饲料添加剂、化妆品添加剂或卫生产品添加剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物为以下(I)-(III)中任意一种：
(I)抑制口腔致病菌的药物；
(II)预防口腔疾病的药物；
(III)治疗口腔疾病的药物。
在本发明的一些实施方式中，所述口腔致病菌为变异链球菌、粪肠球菌、远缘链球菌、戈登链球菌、血链球菌。
在本发明的一些优选实施方式中，所述口腔致病菌为变异链球菌。
在本发明的一些实施方式中，所述口腔疾病为龋齿。
本发明的第六个方面，提供一种药物，所述药物包含本发明第一方面所述的多肽。
在本发明的一些实施方式中，所述药物为抑制口腔致病菌的药物。
在本发明的一些实施方式中，所述口腔致病菌为变异链球菌、粪肠球菌、远缘链球菌、戈登链球菌、血链球菌。
在本发明的一些优选实施方式中，所述口腔致病菌为变异链球菌。
在本发明的一些实施方式中，所述药物为预防或治疗口腔疾病的药物。
在本发明的一些优选实施方式中，所述口腔疾病为龋齿。
在本发明的一些实施方式中，所述药物还包含药学上可添加的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为注射剂、散剂、胶囊剂、片剂、膏剂、栓剂、气雾剂、口服剂、丸剂、滴剂、缓释片、混悬剂、颗粒剂、口含剂、冲剂、滴剂、丹剂、粉剂、溶液剂、霜剂、贴剂、锭剂或膜剂。
本发明的第七个方面，提供一种口腔用品，所述口腔用品包含本发明第一方面所述的多肽。
在本发明的一些实施方式中，所述口腔用品包括牙膏、漱口水、牙贴、口腔敷料、口腔喷剂。
本发明的有益效果是：
本发明通过进一步改造母肽Dhvar4来构建出仅有14个氨基酸的线性抗菌肽，即KR-1和KR-2，抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，还提供编码抗菌肽的核酸分子以及包含上述核酸分子的表达载体或重组细胞。所述抗菌肽具有比母肽更高的抗变异链球菌活性和抗变异链球菌生物膜活性，能更高效地抑制浮游状态和生物膜状态的变异链球菌的活性，且毒性低，生物相容性好，具有一定的防龋优势，而且对同时兼具对粪肠球菌、远缘链球菌、戈登链球菌、血链球菌等细菌的抗菌性。另外，抗菌肽具有较少的氨基酸和较短的肽链，在其快速杀菌、低细胞毒性和高抗生物膜活性的同时，还具有合成简易和生产成本低的优点，可用于大量合成，使其在抑菌剂、抑制或清除牙菌斑制剂、口腔用品、药物以及添加剂等方面显示很好的应用前景。
附图说明
图1为Dhvar4及其衍生肽KR-1和KR-2的螺旋示意图。其中A图为Dhvar4的螺旋示意图；B图为KR-1的KR-1螺旋示意图；C图为KR-2的螺旋示意图。
图2为KR-1对S.mutans ATCC 25175的杀菌时效曲线。其中A图中KR-1的浓度为12.5μg/mL；B图中KR-1的浓度为25μg/mL。
图3为KR-1对S.mutans生物形成膜抑制效果。
图4为KR-1、CHX破坏已形成的S.mutans ATCC 25175生物膜实验。
图5为KR-1对S.mutans成熟生物膜的影响。
图6为KR-1对兔红细胞的溶血活性。
图7为KR-1对牙龈成纤维细胞的毒性。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本实施例中的统计分析标准：每个实验均至少设立三个复孔，以及各组计量资料数据均以“均数±标准差”(Mean±SD)的形式表示(除非特殊说明)。利用GraphPad Prism7.0软件通过单因素方差分析或Kruskal-Wallis H检验的方法进行统计学分析，检验水准α＝0.05，P＜0.05代表具有统计学差异。
实施例1 KR-1的分子设计与序列分析
通过Prabi网站(https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)以Dhvar4序列作为模版。通过Heliquest网站(http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/)获得Dhvar4的极性面和非极性面上氨基酸的信息，根据两亲性正电性α-螺旋型抗菌肽的设计理念，使用疏水性氨基酸替代亲水性氨基酸，由此构建了Dhvar4的2个衍生肽序列KR-1、KR-2，分析获得Dhvar4的极性面和非极性面上氨基酸的信息后，使用色氨酸替代丝氨酸以及使用色氨酸替代丝氨酸和碳端的酪氨酸，分别构建Dhvar4的衍生肽序列，序列见表1，螺旋示意图见图1，其中A图为Dhvar4的螺旋示意图，B图为KR-1的螺旋示意图，C图为KR-2的螺旋示意图。
表1 Dhvar4及其衍生肽的序列，理化性质及抗菌活性
Figure BDA0003121386270000041
实施例2细菌敏感性实验
1)使用二倍稀释法在96孔微量滴定板中对Dhvar4及其衍生肽进行抗菌活性测定，分别检测其分别检测其最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MICs)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBCs)。在96孔板上用BHI肉汤将抗菌肽二倍稀释至合适浓度后加入生长对数期的变异链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)ATCC 25175，细菌终浓度为1×106CFU/mL。37℃厌氧环境中培育16-24h，最低浓度的无浑浊孔为MIC，并从所有澄清实验孔中取50μL等分试样至BHI平板上，37℃厌氧环境孵育48h，无细菌生长的最低浓度为MBC。结果见表1。可以看出，相对于Dhvar4，KR-1的MIC和MBC值都显著减少，抗菌性能大大提高。
2)仍通过二倍稀释法在96孔板中检测目标抗菌肽的最小抑菌浓度(MICs)和最小杀菌浓度(MBCs)进行抗菌活性评价。配置KR-1二倍稀释液，用BHI肉汤调节生长对数期的细菌悬浮液(粪肠球菌(Enterococcus faecalis，E.faecalis)ATCC29212、远缘链球菌(Streptococcus sobrinus，S.sobrinus)ATCC33478、戈登链球菌(Streptococcusgordonii，S.gordonii)ATCC10558、血链球菌(Streptococcus sanguinis，S.sanguinis)JCM5708)并1：1加入抗菌肽稀释液中，每孔液体终体积为200.0μL，细菌终浓度为1.0×106CFU/mL，抗菌肽终浓度为6.5-200μg/mL。使用BHI肉汤作为空白对照组。37℃，厌氧孵育16-24h，肉眼观察96孔板各实验孔的浑浊程度，无浑浊的最低浓度作为MIC。从所有澄清实验孔中取50.0μL等分试样至BHI平板上，37℃下厌氧孵育48h，完全抑制细菌生长的最低浓度为MBC。对所有菌株进行3次MICs和MBCs测定。结果见表2。表明实施例1中的抗菌肽对远缘链球菌、戈登链球菌、血链球菌和粪肠球菌也有较好的抗菌性。
表2 KR-1的抗菌活性
种属 编号 MIC(μg/mL) MBC(μg/mL)
远缘链球菌 ATCC 33478 100 >200
戈登链球菌 ATCC 10558 12.5 100
血链球菌 JCM 5708 25 100
粪肠球菌 ATCC 29212 >200 >200
实施例3杀菌-时效实验
使用杀菌-时效实验评估抗菌肽对口腔中细菌的短效杀菌作用。使用无菌BHI肉汤将目标抗菌肽分别稀释至S.mutans所对应的1×MBCs和2×MBCs，即12.5和25μg/mL，加入生长对数期，终浓度为1×106CFU/mL的细菌，终体积为200μL。37℃孵育0、1、3、5、10、20、30分钟后取出等分试样(10.0μL)至PBS中稀释后在BHI琼脂上涂板，37℃厌氧孵育48h计数存活菌落数，构建了抗菌肽的杀菌时效曲线。结果图2，图2中A图为KR-1的浓度为12.5μg/mL；图2中B图为KR-1的浓度为25μg/mL。
可以看出MBC(12.5μg/mL)浓度的KR-1作用下，5分钟内可降低约95％的S.mutansATCC 25175，2MBC(25μg/mL)浓度的KR-1作用下趋势类似，其对于S.mutans ATCC 25175的作用更加迅速，1min内即可下降约98％。
实施例4抑制变异链球菌生物膜形成的实验
本实施例进一步探讨KR-1对S.mutans ATCC 25175生物膜形成的抑制作用。
实验方法如下：在96孔板中使用BHIS肉汤将各组药物倍比稀释，实验组为KR-1，阳性对照组为常用根管消毒药物-氯己定(chlorhexidine，CHX)，阴性对照组仅有细菌而不含药物，空白对照组为仅有培养基而不含细菌。各组药物终浓度为各自对S.mutans ATCC25175的0×，0.6×，0.8×，1×，2×MICs，再将生长对数期的细菌加入其中，细菌终浓度为1×106CFU/mL，每孔终体积为200μL。充分混匀后于37℃、厌氧环境(80％N2、10％CO2和10％H2)下培养24h。培养后小心去除上层清液，并用PBS轻柔冲洗，去除未黏附的细菌，向每个实验孔中加入100μL甲醇固定5min，固定后每孔加入0.1％(w/v)结晶紫溶液染色15min，使用PBS洗至空白对照组孔内无着色。自然风干，每孔中加入200μL 95％乙醇，避光震荡30min使生物膜充分溶解，检测595nm时各孔的OD值。结果用生物膜形成率表示，公式如下：生物膜形成率＝(实验组平均OD-空白对照组平均OD)/(阴性对照组平均OD-空白对照组平均OD)×100％。每组设立三个复孔。
结果见图3。从图3可以看到，KR-1可有效抑制S.mutans生物膜形成，抑制效果呈浓度依赖性。当KR-1的作用浓度为0.6×MIC时，S.mutans生物膜形成率仅约为11％，与阳性对照药物CHX作用效果相当。而当作用浓度增大至0.8×MIC，KR-1对S.mutans生物膜的抑制效果优于CHX。
实施例5清除成熟的变异链球菌生物膜的实验
本实施例探究KR-1对已形成的S.mutans ATCC25175生物膜作用。
实验方法如下：使用BHIS肉汤调整生长对数期的S.mutans ATCC 25175至最终浓度为1×106CFU/mL，向每孔加入200μL菌液，于37℃的厌氧环境(80％N2、10％CO2和10％H2)中培养24h。将各组药物分别稀释至其对S.mutans ATCC 25175的1×，2×，4×，8×和10×MICs。取细菌培养板，小心去除上清，并用PBS洗去未黏附的S.mutans ATCC 25175，向培养好的生物膜中加入各浓度梯度的药物，于37℃的厌氧环境(80％N2、10％CO2和10％H2)中培养24h，去除上清，用无菌枪头刮取生物膜，使用PBS冲洗，置于EP管中，超声震荡，使生物膜破裂。取液体适量至PBS中稀释，在BHI琼脂上涂板，于37℃的厌氧环境(80％N2、10％CO2和10％H2)中培养48h后，数菌落进行计数，结果用生物膜中存活菌落数的log10形式表示。每组设立3个复孔。
结果见图4。从图4可以看出，KR-1与CHX对S.mutans ATCC 25175成熟生物膜的作用呈现剂量依赖性，随着药物浓度增大，细菌数量减少。当使用浓度为1×、2×、4×、8×和10×MICs的KR-1处理已形成的S.mutans ATCC 25175生物膜24h时，其中分别有0.19-、1.20-、1.65-、2.16-、3.03-log10的细菌数量降低，而经CHX作用的S.mutans ATCC 25175细菌存活数降低量分别为0.05-、0.61-、1.21-、1.32-、1.61-log10，与0×组对比具有显著差异。
实施例6对已形成的S.mutans ATCC25175生物膜后活/死菌分布观察
用BHIS肉汤调整生长对数期的S.mutans ATCC25175至终浓度为1×106CFU/mL，将无菌细胞爬片放入6孔板，向其中加入1mL菌液，37℃、厌氧环境(80％N2、10％CO2和10％H2)中孵育24h。培养后去除上清，小心清洗未黏附细菌，用BHIS肉汤将KR-1、CHX调整至终浓度为它们各自对S.mutans ATCC25175的10×MICs，分别作为实验组和阳性对照组，培养基作为阴性对照组。混匀后置于37℃、厌氧环境(80％N2、10％CO2和10％H2)中孵育24h。培养后去除上清，PBS轻洗去除未黏附细菌，自然风干后向其中加入适量提前配置好的SYTO-9/PI染料，避光染色15min。用PBS轻洗去除多余染料，自然风干，用镊子轻轻取出细胞爬片，组织面向下，置于载玻片上，再用防荧光淬灭剂封片，每张爬片使用约20μL。使用激光共聚焦显微镜观察(Confocal laser scanning microscopy，CLSM)各组药物处理后S.mutans ATCC25175形成的生物膜的变化，
Figure BDA0003121386270000071
9是绿色的核酸荧光染料，染色活菌生物膜，PI为红色荧光染料，染色死菌生物膜分布区域。随机选择3个视野拍照。
结果见图5，共聚焦显微镜(CLSM)观察结果示，染料
Figure BDA0003121386270000072
9和PI的混合物分别对带有完整细胞膜的活细菌染色为荧光绿色，对带有损坏细胞膜的死细菌染色荧光红色。阴性对照组中，S.mutans ATCC 25175能形成较致密而厚的生物膜，红色荧光信号较弱。当在已形成的S.mutans生物膜中加入KR-1和CHX后，细菌生物膜活性明显降低，红色荧光信号增多，而且生物膜较疏松。
实施例7溶血实验
用PBS缓冲液将新鲜兔血红细胞轻轻洗涤三遍，1000g，4℃离心10min后重悬于PBS缓冲液中。使用PBS对抗菌肽二倍稀释后加入兔血红细胞重悬液，溶液终体积为200μL/孔，抗菌肽终浓度为6.25-100μg/mL。阳性对照组为0.5％Triton X-100溶液。在37℃、含5％CO2的细胞培养箱孵育1h后离心，取上清测定波长为405nm时各实验孔OD值，每组设立三个副孔。结果用溶血率表示，公式如下：溶血率＝(实验组平均OD405-空白对照组平均OD405)/(阳性药物组平均OD405-空白对照组平均OD405)×100％。
其中KR-1作用于新鲜兔红细胞后，兔红细胞破裂，血红蛋白释放到胞外的量，可以反映抗菌肽对真核生物细胞的毒性作用。结果见图6，可以看出，KR-1比阳性对照组药物1％Triton-X 100溶液具有更低的对新鲜兔红细胞的溶血活性；抗菌肽对兔红细胞的溶血性呈剂量依赖性，随着浓度的升高，溶血活性也增大。在有效浓度时，即MIC浓度下，6.25μg/mLKR-1作用于兔血红细胞的溶血率仅约为0.35％；在最低杀菌浓度时，12.5μg/mL KR-1的溶血率也不超过10％。
实施例8细胞毒性实验
将生长状况良好的第3代人牙龈成纤维细胞(HGFs)接种至96微孔板中，接种浓度为5×103细胞/孔，37℃、含5％CO2的恒温细胞培养箱中培养24h至细胞贴壁。移除上清后加入经二倍稀释的KR-1抗菌肽溶液，浓度范围为6.25-100μg/mL，培养24h后去除上清。加入10％CCK-8溶液孵育2h。使用酶标仪检测各孔OD值，检测波长450nm。每组设立三个复孔。
结果见图7，当使用浓度不高于12.5μg/mL(相当于2×MIC)的抗菌肽处理时，72h内HGFs存活率均在60％以上，产生较低的细胞毒性。阳性药物阿霉素(Doxorubicin)72h可降低大约70％的HGFs活性。抗菌肽处理组过48h之后，细胞存活率升高，而阿霉素处理组作用72h细胞存活率持续下降。
综上所述，通过以上实施例可以看出，本实施例1中制备的抗菌肽具有比母肽更高的抗菌性，杀菌快速，细胞毒性低以及高抗生物膜性活性。能够抗变异链球菌活性和抗变异链球菌生物膜活性，更高效地抑制浮游状态和生物膜状态的变异链球菌的活性，且毒性低，生物相容性好，具有一定的防龋优势，而且对同时兼具对粪肠球菌、远缘链球菌、戈登链球菌、血链球菌等细菌的抗菌性。也可以很好地应用于牙膏、漱口水、牙贴、口腔敷料、口腔喷剂等口腔用品、添加剂以及药物等产品中。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学南方医院
<120> 抗菌肽及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Lys Arg Leu Phe Lys Lys Leu Leu Phe Trp Leu Arg Lys Tyr
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Lys Arg Leu Phe Lys Lys Leu Leu Phe Trp Leu Arg Lys Trp
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Lys Arg Leu Phe Lys Lys Leu Leu Phe Ser Leu Arg Lys Tyr
1 5 10

Claims (11)

1.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种核酸分子，编码权利要求1所述的多肽。
3.一种载体，含有权利要求2所述的核酸分子。
4.一种细胞，含有权利要求3所述的载体。
5.权利要求1所述多肽或权利要求2所述核酸分子或权利要求3所述载体或权利要求4
所述细胞在以下(I)-(VI)至少一项中的应用：
(I)制备抑菌剂；
(II)制备抑制牙菌斑生物膜形成的制剂；
(III)制备清除成熟牙菌斑生物膜的制剂；
(IV)制备药物；
(V)制备添加剂；
(VI)制备口腔用品；
所述菌为变异链球菌、粪肠球菌、远缘链球菌、戈登链球菌或血链球菌；
所述药物为以下(I)-(III)中任意一种：
(I)抑制口腔致病菌的药物；
(II)预防口腔疾病的药物；
(III)治疗口腔疾病的药物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菌为变异链球菌。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述添加剂为食品添加剂、饲料添加剂、化妆品添加剂或卫生产品添加剂。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述口腔疾病为龋齿。
9.一种药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1所述的多肽。
10.一种口腔用品，其特征在于，所述口腔用品包含权利要求1所述的多肽。
11.根据权利要求10所述的口腔用品，其特征在于，所述口腔用品包括牙膏、漱口水、牙贴、口腔敷料、口腔喷剂。
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