CN104774250A - 一种抗菌功能多肽及其制备方法和应用 - Google Patents
一种抗菌功能多肽及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗菌功能多肽及其制备方法和应用,属于抗菌技术领域。所述抗菌多肽包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列及其盐或酯。本发明的多肽通过对特定种类氨基酸的特定排列以形成α螺旋结构,螺旋结构接触并作用于细菌细胞壁,造成细胞壁穿孔,细菌死亡,从而起到抗菌作用。该抗菌肽合成方便,成本较低,效果较好且安全可靠。且蛋白质类抗菌药物可以有效降低细菌耐药性的发生,在代替抗生素成为主流抗菌药物方向上有巨大潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗菌技术,特别涉及一种抗菌功能多肽及其制备方法和应用。
技术背景
龋病是一种感染性疾病,也是人类最常见的口腔疾病。不加干预的龋病会进展为牙髓病和根尖周病。由于龋病发病率高,流行区广,严重影响口腔及全身健康,世界卫生组织已将其列为人类重点防治的三大非传染性疾病之一,仅次于心血管疾病和肿瘤。
龋病是一种牙体硬组织多因素疾病,微生物、饮食、宿主和时间这四种因素相互作用导致龋病的发生,大量证据已经表明,细菌的存在是龋病发生的先决条件。口腔内常见的致病菌有变异链球菌、放线菌、乳杆菌、粪肠球菌等,这些致病菌在龋病及牙髓病、根尖周病的发生、发展中起着重要作用。防治龋病、牙髓病、根尖周病,感染控制是重要的治疗原则。
20 世纪 40 年代青霉素的发现使人类几乎可以征服所有的感染类疾病,其对各种感染性疾病的控制、预防和治疗等方面作出了巨大贡献。但随着“传统抗生素”的广泛和长期使用、滥用,使得细菌通过各种变异获得耐药性,耐药菌株越来越多,使现用抗生素失效。抗微生物制剂如洗必泰、四环素等,的确可直接作用于细菌而预防龋病,但长期使用易导致口腔菌群失调,耐药菌出现,牙齿染色等明显的毒副作用。
因此,寻找和开发新型不易对细菌产生耐药性的抗菌药物成为了一个热点问题。但新型合成抗生素药物一方面研究进展缓慢,并且存在抗菌谱窄、应用范围有限和毒性等问题;另一方面,人类对自身健康和环保问题认识的不断提高,对药物副作用的了解越来越多,不少合成抗生素被发现有潜在的致癌、致畸和致突变作用,使新型化学合成抗生素的开发难度越来越大。
抗菌肽是广泛存在于自然界动植物体内的一类具有抗菌活性的多肽类物质,由 12-50 个氨基酸残基组成,大多数为阳离子抗菌肽,目前已发现的天然抗菌肽已超过2000种。在面临抗药性和筛选新的抗生素极端困难的情况下,抗菌肽因其独特的生物活性以及不同于传统抗生素的特殊作用机制引起了人们极大关注,可望成为新一代的抗菌药物。与传统的抗生素相比,阳离子抗菌肽具有分子量低、抗菌谱广、毒副作用较低、热稳定性好、抗菌机理独特、无耐药性等优点,有望克服当前抗菌药物的耐药性强、毒副作用大等系列难题。
但天然抗菌肽的短板是分子量较大,提纯或生产成本高,长链多肽在体内药物代谢过程中易被干扰,在临床应用上受到一定限制。因此,研发和人工合成小分子抗菌肽具有重要的意义。
发明内容
针对上述问题,本发明通过对天然抗菌肽进行深入研究、总结其抗菌原理和机制并通过严密的科学推理,创新性的构建了一种可有效杀菌的多肽。
本发明通过以下技术方案来实现:
一种抗菌功能多肽,包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。这种多肽分子量小,结构稳定且简单。杀菌效果好,范围广。
进一步的,所述多肽的C端经过酰胺化修饰。C端酰胺化能使抗菌肽的抗菌活性更为广谱。
进一步的,所述多肽具有α螺旋结构。所述多肽通过对特定种类氨基酸的特定排列以形成α螺旋结构,螺旋结构接触并作用于细菌细胞壁,造成细胞壁穿孔,细菌死亡,从而起到抗菌作用。所述序列中的两亲性氨基酸和疏水氨基酸通过排列让其分别位于α-螺旋结构的不同区域,形与成水和脂类物质都有具有亲和力的结构,这种两亲性结构是抗菌肽发挥抗菌作用的基础,改变其螺旋度会影响抗菌肽的活性。
本发明还提供一种上述抗菌功能多肽的制备方法,包括以下步骤:按照SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列,用Fmoc保护第一个氨基酸的氨基,然后将被Fmoc保护的氨基酸连接到固相载体Wang树脂上,然后脱掉氨基保护基;然后将氨基被Fmoc保护的第二个氨基酸在缩合剂的活化作用下与已连接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键;重复上述肽键形成反应,使肽链从C端向N端生长,直至最后一个氨基酸接入;切割得到目标多肽。
作为可选方式,在上述制备方法中,先将第一个氨基酰胺化,再用Fmoc保护其氨基并进行后续步骤。
作为可选方式,在上述制备方法中,在所述肽键形成反应中采用HBTU作为缩合剂,采用NMM作为活化剂。
作为可选方式,在上述制备方法中,所述切割具体为:用TFA切割液裂解,去除树脂和氨基酸保护基团
本发明还提供了一种抗菌药物或药物组合物或药物制剂,其特征在于,包含上述的抗菌功能多肽或其药学上可接受的盐或酯。进一步的,还可以包括药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明还提供了一种上述抗菌功能多肽的应用,其特征在于,将所述抗菌功能多肽或其药学上可接受的盐或酯用于制备抗菌药物。
本说明书中公开的所有特征,或公开的所有方法或过程中的步骤,除了互相排斥的特征和/或步骤以外,均可以以任何方式组合。
本发明的有益效果:
本发明所述抗菌功能多肽具有高效抗菌作用,可在正常浓度、短时间内杀灭口腔内常见致病菌,且对体外人牙龈成纤维细胞几乎无毒性,而且多肽分子量小,结构稳定且简单。杀菌效果好,范围广靠。
该抗菌肽合成方便,成本较低,效果较好且安全可靠。且蛋白质类抗菌药物可以有效降低细菌耐药性的发生,在代替抗生素成为主流抗菌药物方向上有巨大潜力。
附图说明:
图1为实施例3中所述圆二色光谱分析结果图。
图2为实施例5中所述杀菌曲线的部分测定结果图,其中,A: S.mutans、B: S.mitis、C: S.gordonii、D: S.salivarius、E: S.sanguis、F: S. sobrinus。
图3为实施例5中所述杀菌曲线的另一部分测定结果图,其中G: A.naeslundii、H: A.viscosus、I: L.acidophilus、J: L.casei、K: L.fermentatae。
图4为实施例6中所述杀菌实验的SEM照片,其中(A,B)为Streptococcus mutans, (C,D)为S.mitis,(E,F)为S.gordonii,(G,H)为S.salivarius,(I,J)为S.sanguinis,(K,L)为 S.sobrinus;阴性对照组:A,C,E,G,I,K;多肽处理20min组:B,D,F,H,J,L.。
图5为实施例7中所述杀菌实验的激光共聚焦显微镜观察图。活菌染成绿色,死菌染成红色。观察红绿色比即为死活菌比。
图6为实施例8中所述人牙龈成纤维细胞增殖检测结果柱状图。
图7为实施例8中所述人牙龈成纤维细胞增殖情况由体式显微镜观察、采图。
具体实施方式:
以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改,以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进,均应包括在本发明的保护范围内。本发明人工合成的小分子抗菌肽是由12个氨基酸分子组成,在下述实施例中记为GH12。
实施例1
一种抗菌多肽,氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;SEQ ID NO.1:GLLWHLLHHLLH。
按照以下方法制备:
1、选用Fmoc-His(Trt)-Wang Resin作为树脂(载体);
2、用DCM将树脂充分溶胀;
3、用适当浓度的DBLK(六氢吡啶+DMF),将Fmoc-保护基团脱出;
4、用DMF清洗数遍,洗去DBLK;
5、称取适合的缩合剂和活化剂(HBTU,NMM)以及C端第二个Fmoc-保护氨基酸(Fomc-Leu-OH)进行偶联;
6、茚三酮检测法进行检测确保连接比较完全;
7、用DMF清洗几遍,洗去残留的各种残基和活化剂缩合剂;
8、依SEQ ID NO.1氨基酸序列进行偶联,方法参照步骤3-7;
9.将所有的氨基酸连接结束后采用步骤3,4方法脱去最后的Fmoc-保护基团;
10.用TFA切割液裂解,去除树脂和氨基酸保护基团,得到粗品;
11.送质谱确认产品正确(分子量1487.83符合理论值);
12.粗品送纯化分离,提高纯度。
实施例2
一种抗菌多肽,氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示:SEQ ID NO.1:GLLWHLLHHLLH,所述多肽的C端经过酰胺化修饰。C端酰胺化能使抗菌肽的抗菌活性更为广谱。
参照实施例1中所述方法进行制备,区别仅在于:先将第一个氨基酰胺化,再用Fmoc保护其氨基并进行后续步骤。
实施例3 多肽的圆二色光谱分析
圆二色( Circular dichroism 简称CD) 光谱是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。本实验用于测量多肽的结构,以验证其设计原理的有效性。通过查阅文献可知,圆二色光谱分析α-螺旋结构在紫外光波长靠近192nm有一正的谱带, 在222和208nm处表现出两个负的特征肩峰谱带。可以通过观察圆二色谱光谱谱带确认α-螺旋结构的出现。
实验仪器
Jasco J-1500 CD Spectrometer(日本)
实验步骤
25°C条件下,测量容器透光长度1mm,紫外光波长范围190nm至240nm。分别对实施例1和2中制得的GH12样品进行检测,每个样品扫描10次取平均值。样品多肽浓度0.2mg/ml,分别溶于溶液A:0.02M PBS溶液;B:含有25mM SDS的0.02M PBS溶液C:含有50%TFE(v/v)的0.02M PBS溶液。
所得数据通过公式计算出摩尔椭圆率 绘制图表如图1所示。
由图像曲线可以看出在表面活性剂(SDS)和常用化工溶剂(TFE)的参与下,多肽光谱图呈现了典型的α-螺旋结构,说明多肽在溶液中的二级结构为α-螺旋,验证了多肽的设计原理,从结构上解释并证明了多肽的杀菌能力。
实施例4 最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定
最小抑菌浓度 MIC(Minimal inhibitory concentration) 是指在体外试验中,抗菌药物能抑制培养基中细菌生长的最低浓度。最小杀菌浓度 MBC(Minimal bactericidal concentration) 指在体外试验中,抗菌药物能使活菌生长减少99%以上的最小浓度。MIC与MBC是药物抗菌活性的指标,显示出药物抑杀病原微生物的能力。实验采用细菌为变异链球菌(Streptococcus mutans UA159)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)ATCC6249、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)DL1、血链球菌(Streptococcus sanguis)ATCC10556、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)ATCC13419、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)6715、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus ATCC14931)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei ATCC393)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentatae ATCC9338)、粘性放线菌(Actinomyces viscosus ATCC15987)、内氏放线菌(Actinomyces naeslundii ATCC12104)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis ATCC29212)。阳性对照为洗必泰(CHX chlorhexidine),又称醋酸氯已定,作为强效杀菌药物在临床上广泛应用。但是洗必泰的缺陷在于味苦、口感差,对口腔黏膜有刺激性,且长期使用会使口腔内牙体组织和修复体着色。
MIC、MBC测定实验步骤如下:
1、挑取单菌落于10mL BHI液体培养基中37℃恒温厌氧培养罐(80%N2 、10%H2 、10%CO2)过夜培养。
2、吸取100μL菌液于10mL BHI液体培养基中置于恒温厌氧培养罐(80%N2、10%H2 、10%CO2)过夜培养,将菌液稀释至2×10 6 CFU/mL备用。、
3、多肽采用2倍稀释法加入U形96孔板,每孔20μL。
4、每孔加入80μL BHI培养基、100μL备用菌液,使多肽最终浓度为512μg/mL~0.5μg/mL。
5、96孔板置于37℃恒温厌氧培养罐(80%N2、10%H2、10%CO2)培养24h。
6、MIC为孔板内澄清的最低多肽浓度。
7、吸取澄清孔内100μL菌液涂布于BHI平板,37℃恒温厌氧培养罐(80%N2、10%H2 、10%CO2)过夜培养48h。
8、MBC为平板上无菌落生长的最低多肽浓度。
9、洗必泰(CHX)作为阳性对照,无菌去离子水作为阴性对照。
10、实验至少重复3次。
结果数据如表1
实施例5:杀菌曲线的测定
1、挑取单菌落于10mL BHI液体培养基中37℃过夜培养。
2、吸取100μL菌液于10mlBHI液体培养基中过夜培养,将菌液稀释至2×106CFU/mL备用。
3、多肽以无菌去离子水稀释后加入24孔板,每孔200μL。
4、每孔加入800μL BHI培养基、1mL备用菌液,使多肽最终浓度为至4MBC、2MBC、MBC浓度。
5、24孔板置于恒温厌氧培养罐培养。
6、各时间点(0min,1min,5min,10min,20min,30min,1h,2h,3h,4h,5h,6h)吸取100μL菌液并稀释后涂布于BHI平板,37℃过夜培养48h后计算菌落数。
7、洗必泰(浓度为MBC)作为阳性对照,无菌去离子水作为阴性对照。
8、实验重复3次。
结果如图2和3所示,时间为横坐标,纵坐标表示每毫升所含菌落数目,随着时间的增加,菌落数目的变化表明了细菌生长情况。从图中可看出,和CHX同为MBC浓度,多肽能在3~4小时内杀灭细菌,多肽浓度越高,杀菌用时越短。高浓度的抗菌肽在短时间内强效杀灭细菌,和洗必泰相比,杀菌能力强且用时短,应用前景十分可观。
实施例6 多肽对口腔常见链球菌杀菌作用的扫描电镜观察
菌株:变异链球菌(Streptococcus mutans)UA159、缓症链球菌(Streptococcus mitis)ATCC6249、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)DL1、血链球菌(Streptococcus sanguis)ATCC10556、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)ATCC13419、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)6715由口腔疾病研究国家重点实验室提供。
试剂:多肽溶液、BHI液体培养基、无菌去离子水、PBS缓冲液。
培养环境:37℃厌氧环境培养(80%N2, 10%H2, 10% CO2)。
实验方法
挑取单菌落于10mL BHI液体培养基中37℃过夜培养。
吸取100μL菌液于10m L BHI液体培养基中培养4~6h至对数中期,将菌液稀释至2×108 CFU/mL备用。
多肽以无菌去离子水稀释后加入15ml离心管,每管1mL。
每管加入4mLBHI培养基、5mL备用菌液,使多肽最终浓度为至64μg/mL。
离心管置于恒温厌氧培养罐培养24h。
无菌去离子水作为阴性对照。
4500×g离心力离心5min收集细菌沉淀,实验组菌沉淀PBS缓冲液清洗2次后重悬于100μL的PBS缓冲液,阴性对照组菌沉淀重悬于10mlPBS缓冲液。
吸取5μL菌悬液滴于无菌玻璃片表面,37℃风干固定,置于24孔板,每孔内加入1mL2.5%戊二醛溶液,4℃过夜。
玻片用PBS缓冲液清洗2次,每次在PBS缓冲液中浸泡10min,使用乙醇梯度脱水(36%,50%, 75%处理30min, 90%和100%处理30min 2次)
玻片干燥喷金后扫描电镜观察。
结果如图4所示:显示了GH12作用24h后细菌的形态改变。对照组(A, C, E, G, I,K)显示大部分细菌细胞膜完整,表面无凹陷、破裂,而对照组(B,D,F,H,J,L)可见大量细菌的细胞膜表面出现凹陷,甚至破裂,导致胞浆流出,菌体塌陷。从微观上可以看出细菌在经过多肽处理后,主要是细胞壁受损,符合多肽的α-螺旋结构杀菌原理,多肽接触细菌后由α-螺旋结构在细菌的细胞壁上打孔,导致细菌破裂最终死亡。
实施例7多肽对口腔常见链球菌杀菌作用的激光共聚焦显微镜观察
菌株:变异链球菌(Streptococcus mutans)UA159、缓症链球菌(Streptococcus mitis)ATCC6249、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)DL1、血链球菌(Streptococcus sanguis)ATCC10556、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)ATCC13419、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)6715由口腔疾病研究国家重点实验室提供。
试剂:多肽溶液(5120μg/ml)、BHI液体培养基、无菌去离子水、0.85%NaCl溶液、LIVE/DEAD?BacLightTM Bacterial Viability Kits L7012。
培养环境:37℃厌氧环境培养(80%N2, 10%H2, 10% CO2)。
3.2 实验方法
⑴ 挑取单菌落于10mlBHI液体培养基中37℃过夜培养。
吸取100μL菌液于10mlBHI液体培养基中培养4~6h至对数中期,将菌液稀释至2×108CFU/mL备用。
⑵ 多肽以无菌去离子水稀释后加入15ml离心管,每管1mL。
⑶ 每管加入4mL BHI培养基、5mL备用菌液,使多肽最终浓度为至64μg/mL。
⑷ 无菌去离子水作为阴性对照。
⑸ 离心管置于恒温厌氧培养罐培养5min,20min,1h,3h 后4,500 g离心力离心5min收集细菌沉淀,0.85%NaCl溶液清洗2次后重悬于100μL0.85%NaCl溶液。
⑹ 将LIVE/DEAD?试剂盒中的SYTO 9 和 Propidium iodide以1:1混匀后吸取0.3μL混合染液于100μL菌悬液中,避光培养15min。
实验结果
LIVE/DEAD?试剂盒中的SYTO 9可以进入所有死活菌中,而Propidium iodide仅能进入死菌,使死菌染色。如图5所示,对照组为正常细菌(A、C、E、G、I、K),不加抗菌肽的阴性对照,大部分细菌为绿色荧光的活菌,红色荧光的死菌数量较少。而实验组(B、D、F、H、J、L)为抗菌肽处理细菌20min后,绿色荧光的活菌数量极少,几乎为红色荧光的死菌。
实施例8 多肽对人牙龈成纤维细胞增殖的影响
在四川大学医学伦理学会审批后,于临床取年轻健康患者的牙龈组织。用组织块培养法培养及传代,传至第4~6代用于实验。牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts )以下简称为HGFs。
(1) HGFs 接种 96 孔板中,每孔 0.5×105个细胞,培养覆盖面积大约为50%。使用20%胎牛血清(FBS)DMEM培养基培养。
(2) 用浓度为4 ug/ml 、8 ug/ml 、16 ug/ml 、32 ug/ml 、64 ug/ml 、128 ug/ml 、256ug/ml的多肽分别处理细胞5min、1h、2h。处理后弃去上清液,用预热的PBS冲洗后加入200ul培养液继续培养。每组处理时间+浓度为3复孔。
(3)多肽处理过的和未处理(阴性对照)的细胞在CO2培养箱中(5% CO2 95%空气100%湿度37°C恒温)培养。
(4)按照Am-blue试剂盒指导手册对于24h、48h、72h每个时间点进行操作。
(5)使用酶标仪在 570nm 处读取数值。
所得数据为每孔内液体吸光度,吸光度越高,说明细胞数目越多,细胞增殖情况越好。由所得数据绘制得到图6。在多肽处理浓度为128ug/ml时,处理时间5min、60min、120min所得的数据趋势可看出,多肽处理对细胞增殖有一定影响,且有时间依赖性,处理时间越长,受影响越大。使用独立样本t检验计算后,P值均大于0.05,均无统计学意义,说明多肽处理后对细胞增殖几乎无影响。由生长曲线可知,128ug/ml多肽处理后在1小时内大多数细菌都已死亡,但此浓度多肽对细胞毒性几乎没有,说明该肽在杀菌时间内对细胞影响轻微,十分有临床应用价值。图7为多肽处理浓度为128ug/ml时,体式显微镜采图所得图像。多肽处理对细胞增殖未见明显影响,观察药物处理组细胞增殖几乎和阴性对照组相同,细胞形态也未见明显变化。
实施例3~8中的各实验结果对应的多肽样品是按照实施例2所述方法制备的抗菌多肽。对于按照实施例1所述方法制备的抗菌多肽样品同样进行了实施例3~8所述的各项测试,结果显示:按照实施例1所述方法制备的抗菌多肽同样具有α-螺旋结构,也同样具有显著的抗菌效果,但与按照实施例2所述方法制备的抗菌多肽相比,未经酰胺化处理的抗菌多肽对部分细菌的抗菌抑菌效果略逊于实施例2中制备的第一个氨基经酰胺化处理的抗菌多肽。实施例2中制备的第一个氨基经酰胺化处理的抗菌多肽显示出更光谱和高效的抗菌抑菌作用。可能的原因是酰胺化处理使α-螺旋结构更稳定,且具有正电性的酰胺化阳离子基团有助于增强抗菌作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例,对本发明而言仅是说明性的,而非限制性的;本领域普通技术人员理解,在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变,修改,甚至等效变更,但都将落入本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种抗菌功能多肽及其制备方法和应用
<130> 0
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Leu Leu Trp His Leu Leu His His Leu Leu His
1 5 10
Claims (10)
1.一种抗菌功能多肽,其特征在于,包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗菌功能多肽,其特征在于,所述多肽的C端经过酰胺化修饰。
3.根据权利要求1所述的抗菌功能多肽,其特征在于,所述多肽具有α螺旋结构。
4.一种如权利要求1所述的抗菌功能多肽的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:按照SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列,用Fmoc保护第一个氨基酸的氨基,然后将被Fmoc保护的氨基酸连接到固相载体Wang树脂上,然后脱掉氨基保护基;然后将氨基被Fmoc保护的第二个氨基酸在缩合剂的活化作用下与已连接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键;重复上述肽键形成反应,使肽链从C端向N端生长,直至最后一个氨基酸接入;切割得到目标多肽。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,先将第一个氨基酰胺化,再用Fmoc保护其氨基并进行后续步骤。
6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,在所述肽键形成反应中采用HBTU作为缩合剂,采用NMM作为活化剂。
7.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述切割具体为:用TFA切割液裂解,去除树脂和氨基酸保护基团。
8.一种抗菌药物,其特征在于,包含如权利要求1~3中任意一个所述的抗菌功能多肽。
9.根据权利要求8所述的抗菌药物,其特征在于,还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
10.一种权利要求1~3中任意一个所述的抗菌功能多肽的应用,其特征在于,将所述抗菌功能多肽用于制备抗菌药物。
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