CN103599069A

CN103599069A - 一种由pH敏感性多肽修饰的靶向脂质体

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Publication number: CN103599069A
Application number: CN201310543868.1A
Authority: CN
Inventors: 何勤; 张倩玉; 刘亚圆
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2013-11-06
Filing date: 2013-11-06
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2033-11-06
Also published as: CN103599069B

Abstract

本发明涉及一种由具有pH敏感多肽修饰的抗肿瘤靶向脂质体，所述脂质体主要由磷脂、胆固醇、脂质-聚乙二醇和脂质-聚乙二醇-pH敏感多肽制成。所述pH敏感多肽在肿瘤组织的酸化环境中能暴露出增强的穿膜入胞的能力，介导脂质体在肿瘤部位高效入胞。

Description

一种由pH敏感性多肽修饰的靶向脂质体

技术领域

本发明涉及一种靶向脂质体，具体涉及一种具有pH敏感性多肽修饰的抗肿瘤靶向脂质体及其制备方法，属于药物制剂技术领域。

背景技术

恶性肿瘤的发病率和死亡率今年来呈逐年上升的趋势，成为严重威胁人类健康的疾病之一。尽管现下治疗肿瘤的手段多种多样，化疗仍然是最为常用的治疗手段。但是，化疗药物往往在正常组织和肿瘤组织间缺乏选择性，因此其治疗效果和应用范围常受到限制。

目前，肿瘤靶向的纳米递药体系的发展给肿瘤的治疗带来的新的突破。其中，脂质体作为一种具有良好生物相容性的纳米级载体得到了人们的广泛关注，而进行了PEG（聚乙二醇）修饰后的脂质体能发挥其隐形作用，更多地浓集于肿瘤部位。但是PEG化的脂质体常常由于其表面亲水性的PEG链立体位阻作用，阻碍脂质体的入胞能力。因此，穿膜肽作为一类能显著提高其所携带载体入胞能力的多肽，常常被研究者用来修饰于脂质体表面，以增强脂质体入胞能力。但是，由于穿膜肽往往缺乏选择性，在体内不同组织间的细胞穿透作用几乎广泛存在，引起较强毒副作用。因此，如何在正常组织中掩盖其穿膜作用而在肿瘤组织中暴露其穿膜作用成为研究热点。

近年来广泛的研究表明，肿瘤组织作为一种迅速增殖的组织，通常需要消耗更多的氧气和营养成分，导致肿瘤部位的pH值偏酸性。因此，可以利用肿瘤组织和正常组织的pH值不同来构建和研究载药体系。

组氨酸作为一种必需氨基酸在人类和哺乳动物内广泛存在，其结构中的咪唑环具有一定的质子接受能力（pKa约6.5），因此，在正常生理条件下，组氨酸呈负电；但在肿瘤组织中，组氨酸会因质子化效应转变为具有正电荷的氨基酸。

本发明人利用了肿瘤组织较低的pH值以及组氨酸这一特性，构建和研究了本发明的特定载药体系。

发明内容

本发明目的旨在于提供一种由pH敏感性多肽修饰构建而成的靶向脂质体载药体系；进一步地提供一种由pH敏感性多肽修饰构建而成的抗肿瘤靶向脂质体载药体系。

本发明的目的之一，将组氨酸对多肽序列中的某些碱性氨基酸（如亮氨酸）进行替换，藉此构建新型的具有pH敏感性的多肽A。

本发明的目的在于提供了一种由pH敏感性多肽A修饰的Lipid（磷脂）而构建而成的靶向脂质体或抗肿瘤靶向脂质体。

本发明的目的在于提供了一种抗肿瘤靶向脂质体，其特征在于包含磷脂、胆固醇、Lipid-PEG、Lipid-PEG-A及活性剂。

其中，Lipid-PEG指的是磷脂-聚乙二醇，即聚乙二醇修饰的磷脂。

其中，Lipid-PEG-A即Lipid-PEG-pH敏感性多肽，指的是由pH敏感性多肽修饰的磷脂-聚乙二醇；A表示pH敏感性多肽。

本发明的目的在于将一条序列为LHLLHHLLHHLLHLL（下划线标识代表D型氨基酸）的具有pH敏感性的多肽（下文中将该多肽称为“A”）通过聚乙二醇链连接于脂质体表面，借以构建这种pH敏感性多肽修饰的靶向脂质体载药体系；其中，多肽序列中的H表示组氨酸，L表示亮氨酸。

该多肽序列中的组氨酸在酸性条件（pH 6.0~6.8）下，能发挥其质子化效应使多肽序列转变为正电荷；同时，它能在细胞膜表面形成α螺旋结构，有利于其入胞。因此，将该多肽修饰于脂质体表面也可相应地赋予脂质体以pH敏感性，以达到在正常组织的pH条件中（pH 7.4）穿膜作用被掩盖，细胞摄取降低；而在肿瘤组织的pH条件中穿膜作用（pH 6.0~6.8）能发挥其功效，达到肿瘤部位高效递药的目的。

本发明（包括实施例）所使用的多肽A均由上海强耀生物科技有限公司购得。

本发明所述的Lipid-PEG-A，是将该多肽A连接在PEG链末端得到，优选的连接方法是利用多肽巯基与PEG链末端的马来酰亚胺基团进行反应制得，也可以根据现有技术中记载的方法获得。

作为本发明的具体实施方案之一，本发明所述的由pH敏感多肽修饰的（抗肿瘤）靶向脂质体，包括磷脂、胆固醇、Lipid-PEG和Lipid-PEG-A；其中基于脂质体的总脂质的摩尔百分比计，磷脂10-80%，胆固醇10-80%，Lipid-PEG 1%-20%，Lipid-PEG-A 0.1%-15%；所述总脂质指的是各磷脂和胆固醇之和。

在某一个实施方案中，优选的，其中基于脂质体总脂质（其中，所述总脂质指的是各磷脂和胆固醇之和）的摩尔百分比计，磷脂30%-70%，胆固醇10%-35%，Lipid-PEG2%-10%，Lipid-PEG-A 0.1%-5%。

作为本发明的具体实施方案之一，本发明所述的由pH敏感多肽修饰的肿瘤靶向脂质体，主要由磷脂、胆固醇、Lipid-PEG和Lipid-PEG-A以及活性剂制成；其中基于脂质体的总脂质（包括胆固醇和各磷脂）的摩尔百分比计，磷脂10-80%，胆固醇10-80%，Lipid-PEG 1%-20%，Lipid-PEG-A 0.1%-15%；其中，按重量百分比算，活性剂占脂质体总脂质的0.1%-50%；所述总脂质指的是各磷脂和胆固醇之和。

在某一个实施方案中，优选的，其中基于脂质体总脂质（其中，所述总脂质指的是各磷脂和胆固醇之和）的摩尔百分比计，磷脂30%-70%，胆固醇10%-35%，Lipid-PEG2%-10%，Lipid-PEG-A 0.1%-5%，其中，按重量百分数计算，活性剂占总脂质的1%-5%。

本发明所述的磷脂包括但不限于：大豆磷脂(SPC)、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)、二肉豆蔻酰卵磷脂(DMPC)、二月桂酰卵磷脂(DLPC)、二硬酯酰卵磷脂(DPPC)，二棕榈酰卵磷脂(DPPC)、二硬脂酰卵磷脂(DSPC)、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂(MPPC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂(PMPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂(PSPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂(SPPC)、蛋黄卵磷脂(EPC)、氢化豆磷脂(HSPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二棕榈脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸(DPPS)、脑磷脂酰丝氨酸(PS)、脑神经鞘磷脂(BSP)、二棕榈酰神经鞘磷脂(DPSP)、二硬脂酰神经鞘磷脂(DSSP)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)中的任一种或任几种的混合，其中优选的为：大豆卵磷脂(SPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

本发明所述的Lipid-PEG和/或Lipid-PEG-A中的Lipid-PEG，包括但不限于，DSPE-PEG、DMPE-PEG、DPPE-PEG、DOPE-PEG、DLPE-PEG、Cholesterol-PEG；优选DSPE-PEG，上述Lipid-PEG均是采用本领域的常规方法制得或商业购买获得。

此外，本发明制备脂质体所用的Lipid-PEG和Lipid-PEG-CPP-A 中的PEG，其分子量为约200-约50000，优选的为约1000，约2000，约5000等。

任何活性剂，例如，治疗剂和/或显影剂都可以包括在本发明的脂质组合物中。本发明中所述的活性剂可以是抗肿瘤剂，包括但不限于烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、蒽环类抗生素、植物生物碱、紫杉醇衍生物、拓扑异构酶抑制剂、单克隆抗体、光敏剂、激酶抑制剂和韩波化合物。

本发明的目的在于提供了一种Lipid-PEG-A的制备方法，其制备步骤包括以下：

（1）取Lipid-PEG-Mal和多肽A置于圆底烧瓶中，加入有机溶剂溶解；

（2）室温避光反应24h，于水浴20-40℃下旋转蒸发仪上将反应液旋干得初产物；

（3）加入氯仿溶解后过滤，再于水浴20-40℃下旋转蒸发仪上将有机溶剂减压旋干即得Lipid-PEG-A。

本发明所述的Lipid-PEG-A中，脂质优选的是DSPE，PEG分子量优选为约2000。

本发明的目的之一是提供了一种pH敏感多肽修饰的（抗肿瘤）靶向脂质体的制备方法，具体操作如下：

（1）将磷脂，胆固醇，Lipid-PEG和Lipid-PEG-A各取适量，置于茄形瓶中，加入有机相溶剂进行溶解混合均匀，在旋转蒸发仪上将有机溶剂抽干；

（2）将茄形瓶置于真空干燥器中约0.5小时至约5小时，除去有机溶剂；

（3）向茄形瓶中加入磷酸盐缓冲液、葡萄糖或硫酸铵溶液等水化液，在37-60℃下水化约0.5-约5小时，用挤压过膜或超声等方法将脂质体粒径控制在100nm左右。

优选地，步骤（1）的有机溶剂选自氯仿、甲醇，优选的是氯仿。

作为本发明的优选实施方案之一，本发明所述的活性剂可在步骤（1）中加入，例如：（1）取活性剂、磷脂、胆固醇、Lipid-PEG、Lipid-PEG-A，置于茄形瓶中，加入有机溶剂溶解后，于水浴20-40℃下旋转蒸发仪上将有机溶剂抽干。

作为本发明的优选实施方案之一，本发明所述的活性剂，也可在步骤（3）制备空白脂质体之后制备后，通过本领域常规的孵育的方法装载到脂质体中。

本发明的目的在于提供了一种由pH敏感多肽修饰的靶向脂质体在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明的结构示意图。图中1为Lipid-PEG，2为多肽A。

图2为小鼠结肠癌细胞C26对CFPE标记的不同脂质体的摄取情况，其中1为PEG-Lip，为普通的PEG衍生化的脂质体，2为A-Lip，即由多肽A修饰的脂质体。

图3为载紫杉醇脂质体对耐药的人乳腺癌细胞MCF-7/ADR的抑制作用。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

实施例1. DSPE-PEG2000-A的制备

在25ml圆底烧瓶中，加入10ml氯仿，再加入DSPE-PEG2000-Mal 10.0mg，三乙胺3μL，再将多肽A （序列为LHLLHHLLHHLLHLL，序列中L为亮氨酸，H为组氨酸；其中下划线标识表示该氨基酸为D型氨基酸，）9.1mg溶解于5ml甲醇后加入圆底烧瓶，室温下避光反应48h，将反应液减压旋干得初产物，加入氯仿溶解后过滤，再减压旋干即得DSPE-PEG2000-A 15.0mg (89.3%)，为无色油状化合物。

实施例2. 由DSPE-PEG2000-A修饰的脂质体的制备

以大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-A为材料制备多肽A修饰的靶向脂质体。分别称取大豆磷脂1.42mg，胆固醇0.40mg，DSPE-PEG2000 0.28mg，DSPE-PEG2000-A 0.78mg，溶于适量氯仿中，37℃水浴下，减压旋转蒸发除去氯仿，形成均匀脂质膜，加入1ml PBS缓冲液水化1h，探头超声（5s，5s，15次）。再依次挤压通过400nm，200nm和100nm聚碳脂膜，得DSPE-PEG2000-A修饰的脂质体。

实施例3. 由DPPE-PEG-A修饰的脂质体的制备

以大豆磷脂、胆固醇、DPPE-PEG3000、DPPE-PEG3000-A为材料制备多肽A修饰的靶向脂质体。分别称取大豆磷脂1.42mg，胆固醇0.40mg，DPPE-PEG3000 0.26mg，DPPE-PEG3000-A 0.75mg，溶于适量氯仿中，37℃水浴下，减压旋转蒸发除去氯仿，形成均匀脂质膜，加入1ml PBS缓冲液水化1h，探头超声（5s，5s，15次）。再依次挤压通过400nm，200nm和100nm聚碳脂膜，得DPPE-PEG3000-A修饰的脂质体。

实施例4. 由DMPE-PEG-A修饰的脂质体的制备

以大豆磷脂、胆固醇、DMPE-PEG5000、DMPE-PEG5000-A为材料制备多肽A修饰的靶向脂质体。分别称取大豆磷脂1.42mg，胆固醇0.40mg，DMPE-PEG5000 0.30mg，DMPE-PEG5000-A 0.81mg，溶于适量氯仿中，37℃水浴下，减压旋转蒸发除去氯仿，形成均匀脂质膜，加入1ml PBS缓冲液水化1h，探头超声（5s，5s，15次）。再依次挤压通过400nm，200nm和100nm聚碳脂膜，得DMPE-PEG5000-A修饰的脂质体。

实施例5. 由DOPE-PEG-A修饰的脂质体的制备

以大豆磷脂、胆固醇、DOPE-PEG2000、DOPE-PEG3000-A为材料制备多肽A修饰的靶向脂质体。分别称取大豆磷脂1.42mg，胆固醇0.40mg，DOPE-PEG2000 0.29mg，DOPE-PEG3000-A 0.80mg，溶于适量氯仿中，37℃水浴下，减压旋转蒸发除去氯仿，形成均匀脂质膜，加入1ml PBS缓冲液水化1h，探头超声（5s，5s，15次）。再依次挤压通过400nm，200nm和100nm聚碳脂膜，得DOPE-PEG-A修饰的脂质体。

实施例6. CFPE标记的脂质体的制备

按实施例2中的配方，加入大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-A，溶于适量氯仿中，再加入荧光标记磷脂CFPE 20μg，37℃水浴下，减压旋转蒸发除去氯仿，形成均匀脂质膜，加入1ml PBS缓冲液水化1h，探头超声（5s，5s，15次）。再依次挤压通过400nm，200nm和100nm聚碳脂膜，得CFPE标记的多肽A修饰的脂质体。

实施例7. 包载抗肿瘤药物紫杉醇的脂质体的制备

按实施例2中的配方，加入大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-A，再加入紫杉醇100μg，溶解于氯仿中，37℃水浴下，减压旋转蒸发除去氯仿，形成均匀脂质膜，加入1ml PBS缓冲液水化1h，探头超声（5s，5s，15次）。再依次挤压通过400nm，200nm和100nm聚碳脂膜，得到包载抗肿瘤药物紫杉醇的多肽A修饰的脂质体。

实施例8. 小鼠结肠癌细胞C26对脂质体的摄取

表1：各组脂质体的处方

表1中，PEG-LIP表示普通的PEG衍生化的脂质体，A-LIP表示修饰有多肽A的脂质体。

按照表1的处方，并按实施例3中所述制备标记了CFPE的脂质体，将小鼠结肠癌细胞C26以1×10⁵/孔的密度接种于六孔板上，培养24小时后，加入已将pH值调整为7.4和6.3的培养基，并加入相应的如实施例3中所述制备的CFPE标记的脂质体，37℃下孵育2小时，随后用冷PBS清洗三次，并用流式细胞仪进行测量。

测量结果如图2所示：修饰有多肽A的脂质体在pH 6.3下的细胞摄取相较其它组有显著提高；而其余各组（包括普通的PEG衍生化的脂质体在pH 7.4和pH 6.3下以及修饰多肽A的脂质体在pH 7.4下）之间的摄取都较低，且无显著差异，说明修饰有多肽A的脂质体体现出pH敏感性，能在pH降低的情况下显著提高脂质体被小鼠结肠癌细胞的摄取。

实施例9. 载紫杉醇脂质体对耐药的人乳腺癌细胞MCF-7/ADR的抑制作用

将耐药的人乳腺癌细胞MCF-7/ADR以1×10⁵/孔的密度接种于六孔板上，培养24小时后，加入已将pH值调整为7.4和6.3的培养基，并加入相应的包载有抗肿瘤药物紫杉醇的脂质体，37℃下孵育24小时，随后用冷PBS清洗三次，用MTT实验检验包载抗肿瘤药物紫杉醇脂质体对细胞的抑制作用。

结果如图3所示：在各紫杉醇浓度下，修饰有多肽A的脂质体在pH 6.3的条件下相较于pH 7.4时能更为显著地抑制细胞的活性，显示出了明显的pH敏感性，在pH 6.3的情况下能更好地抑制人乳腺癌细胞的生长。

Claims

1.一种由pH敏感性多肽修饰的靶向脂质体，其特征在于将一条序列为LHLLHHLLHHLLHLL（下划线标识代表D型氨基酸）的具有pH敏感性的多肽A通过聚乙二醇链连接于脂质体表面，构建具有pH敏感性多肽修饰的靶向脂质体。

2.根据权利要求1所述的一种由pH敏感性多肽修饰的靶向脂质体，其特征在于包含磷脂、胆固醇、Lipid-PEG、Lipid-PEG-A。

3.根据权利要求1所述的一种由pH敏感性多肽修饰的抗肿瘤靶向脂质体，其特征在于包含磷脂、胆固醇、Lipid-PEG、Lipid-PEG-A及活性剂。

4.一种由pH敏感性多肽修饰的靶向脂质体，其特征在于包含磷脂、胆固醇、Lipid-PEG和Lipid-PEG-A；其中基于脂质体的总脂质的摩尔百分比计，磷脂10-80%，胆固醇10-80%，Lipid-PEG 1%-20%，Lipid-PEG-A 0.1%-15%；其中，所述总脂质指的是各磷脂和胆固醇之和。

5.根据权利要求书4所述的脂质体，其特征在于用于修饰Lipid-PEG的pH敏感多肽配体序列为LHLLHHLLHHLLHLL，其中L为亮氨酸，H为组氨酸，其中下划线标识表示该氨基酸为D型氨基酸。

6.一种由pH敏感性多肽修饰的抗肿瘤靶向脂质体，其特征在于主要由磷脂、胆固醇、Lipid-PEG和Lipid-PEG-A以及活性剂制成；其中基于脂质体的总脂质的摩尔百分比计，磷脂10-80%，胆固醇10-80%，Lipid-PEG 1%-20%，Lipid-PEG-A 0.1%-15%；其中，按重量百分比算，活性剂占脂质体总脂质的0.1%-50%；所述总脂质指的是各磷脂和胆固醇之和。

7.根据权利要求1-6所述的靶向脂质体，其特征在于所述磷脂包括所有类型的磷脂，包括但不限于大豆磷脂、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油；优选大豆磷脂。

8.根据权利要求1-7所述的靶向脂质体，其特征在于所述活性剂可以是抗肿瘤剂，包括但不限于烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、蒽环类抗生素、植物生物碱、紫杉醇衍生物、拓扑异构酶抑制剂、单克隆抗体、光敏剂、激酶抑制剂和含铂化合物。

9.根据权利要求1-8所述的pH敏感多肽修饰的（抗肿瘤）靶向脂质体在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。