CN104530438A - 基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药用高分子聚合物材料技术领域，公开了一种基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物及制备方法和应用。该多肽聚合物具有公式(1)所示结构：mPEG-R-Chol(1)。本发明多肽聚合物为聚乙二醇单甲醚亲水修饰、胆固醇疏水修饰的多肽pH响应两亲性三嵌段聚合物材料，在水溶液中自组装为纳米胶束，有效包载水难溶性药物，可应用于医药领域，特别适用于制备水难溶性抗癌药物的靶向载药系统。且其拓扑结构可调控，合成工艺简单，可通过调节具有pH响应的多肽含量调控药物的释放速率，满足不同药物的释放要求。本发明的多肽聚合物的临界聚集浓度较低，仅为1.8～4.8mg/L，因而其载药胶束的稳定性高。
Description
技术领域
本发明属于生物医药用高分子聚合物材料技术领域，特别涉及一种基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物及制备方法和应用。
背景技术
癌症(cancer)或恶性肿瘤(malignant neoplasm)是由于细胞生长增值控制机制失常而引起的疾病。世界卫生组织指出，目前在全球每年癌症夺去700多万人的生命，而且这一数字还会快速上升，到2030年可能将超过1310万，在我国，每年因癌症死亡病例达270万之多，新发肿瘤病例约为312万例，平均每天8550人，全国每分钟有6人被诊断为癌症。癌症已被列为人类面临的“第二号杀手”，癌症日益成为危害人类生命健康的主要杀手。目前癌症的治疗主要分为手术治疗、放射治疗和化学治疗三种方法，其中化学治疗是最重要最有效的治疗手段。但存在以下几个问题：(1)药物溶解性差：绝大多数抗癌药物，例如紫杉醇，喜树碱，阿霉素等，均表现为疏水性，在血液循环中会发生沉淀聚集，极大地降低了药物利用度和治疗效果；(2)毒副作用大：因药物在血液循环中无选择性的进入体内细胞包括恶性肿瘤细胞和正常组织细胞，而绝大多数药物具有较强毒性，例如阿霉素具有心脏毒性，使得正常组织细胞受到伤害，对机体产生较为严重的副作用，造成白细胞、红细胞及血小板数量的减少，恶心，呕吐以及脱发等，甚至危及生命；(3)肿瘤(癌细胞)耐药性：在化疗初期，患者体内癌细胞对抗癌药物有所反应，出现肿瘤体积减小等缓解现象，但是随着肿瘤的耐药性机制作用的增强，最终往往导致化疗的失败、病人死亡的结果。因而对于这类抗癌药物的应用仍然面临巨大挑战。
由两亲性聚合物形成的纳米核/壳结构胶束作水难溶性抗癌药物的载体，可以控制药物的释放。而且，胶束具有疏水的核，可高容量地包载疏水性药物，而亲水性的外壳可以防止药物的水解或酶解，起到稳定胶束结构、保护药物的作用，另外，围绕在疏水核周围的亲水性基团可以接枝某些抗体、寡糖等分子识别导向基团，便于实现给药系统的主动靶向功能，此外，胶束可以提高药物的表观水溶性，避免体内网状内皮系统(RES)的吞噬或被肝脾等组织吸收，因而有利于延长胶束在血液中的循环时间和在肿瘤组织部位的积累，提高药物在特定部位的活性，从而有效提高药效，降低副作用；胶束具有较低的临界胶束浓度，较大的增溶空间，结构稳定，且依据聚合物疏水链段的不同性质可以通过化学、物理以及静电等作用包裹药物，对水难溶性药物有明显的增溶效果。
一个成功的抗癌药物载药体系必须具有较高的药物包载量，在人体血液循环环境中较长期的稳定状态，良好的靶向功能，毒副作用小，生物相容性好等特点。pH响应性聚合物胶束由于可以在人体正常pH环境下保持致密结构，减少药物的渗漏，而在弱酸环境(肿瘤细胞)下发生溶胀或解离从而促进药物快速释放，因而被认为是难溶性抗癌药物靶向治疗的理想载体。研究已经表明，癌细胞由于较快的细胞分离导致无氧呼吸，产生大量乳酸等酸性物质，使得癌细胞周围环境pH相对于体内正常值偏低，大约在6.5-7.0之间，而细胞内溶酶体和内涵体的pH值更低，大约在5.0-6.5之间。肿瘤的酸性环境可以作为信号用于触发载药胶束的快速药物释放，促进细胞内吞胶束及其细胞器靶向。
当pH发生变化时，带胺基、吡啶或者咪唑基等碱性基团的弱碱性聚合物或带羧基基团的弱酸性聚合物的离子化状态发生改变，导致其在水中的溶解性发生变化。常用的弱碱性聚合物聚(N,N-二乙基胺基乙基甲基丙烯酸酯)[poly(N,N-diethylaminoethyl methacrylate),PDEA]、聚组氨酸[poly(L-histidine),Phis]、聚(4-乙烯基吡啶)[poly(4-vinylpyridine),PVP]和聚(β-胺基酯)[poly(β-aminoesters)]等在碱性或中性条件下不溶于水，而在酸性条件下，由于碱性基团发生质子化而带正电，发生相转变，引起其胶束结构变化，从而实现载药体系在正常环境下保持稳定，而在弱酸pH环境下则有较好的释放效率，因此可用作难溶性抗癌药物靶向治疗的载体。
组氨酸(histidine)中含有咪唑基团，其等电点为6.0，该基团在pH<6.0环境中很容易捕获质子而带正电，表现为亲水性，可快速释放药物；而在pH>6.0环境中只能部分捕获质子，表现为疏水性，一方面可增加载药量，另一方面可防治药物在此环境中的释放。Lee[Journal of Controlled Release,2003,90(3):363-374]利用聚组氨酸(polyHis)的pH敏感性制备了两亲性的polyHis-b-PEG胶束。在肿瘤组织的低pH环境下，组氨酸咪唑基团上的孤对电子被质子化，使胶束带正电，因此，很容易与带负电的肿瘤细胞膜融合，从而释放包封于其内的药物，使药物有效地靶向肿瘤组织。与其他氨基聚合物相比，聚组氨酸易降解且其水解产物基本无毒。Kim[Small,2008,4(11):2043-2050]等制备了pH敏感的两亲性高分子poly(His-co-Phe)-b-poly(ethylene glycol)和poly(L-lactic acid)-b-poly(ethylene glycol)，所形成的纳米胶束用来作为药物载体，表现出满足要求的pH敏感性能，在pH 7.4下药物释放缓慢，在pH 5.5时，药物释放明显加快。Guo等制备了两种pH敏感的两亲性胆固醇修饰的多肽聚合物His5Arg10-Chol和His10Arg10-Chol及其自组装胶束用作阿霉素的载体材料，载药胶束表现出良好的药物控释性能，且聚合物材料毒性较低，但是仍存在载药量较低的缺点。
从现有的研究报道来看，如何有效提高载药量并且缓解或消除突释现象；如何有效降低载体材料的毒副作用，仍是当前面临的两个最主要的难题。通常的胶束载药体系，分为外部保护层和内部载药核，使得载药内核同时起到了pH响应的作用，使得胶束的pH响应和胶束通胀以及药物释放处在几乎同时的过程，药物释放速率过快，突释效应明显，又会使其载药能力下降，使得整个载药体系的药物效果不理想。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物。该聚合物分子在水溶液中自组装为纳米胶束，有效包载水难溶性药物，可应用作为水难溶性抗癌药物的靶向载药系统。
本发明另一目的在于提供一种上述基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的制备方法。本发明制备方法先合成胆固醇修饰多肽的两嵌段聚合物，再在多肽一侧修饰亲水性聚乙二醇单甲醚，即得到pH响应两亲性三嵌段聚合物材料。
本发明再一目的在于提供上述基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物在医药领域中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物(mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol)，具有公式(1)所示结构：
mPEG-R-Chol (1)
其中，mPEG为氨基聚乙二醇单甲醚，结构式：n＝44；
Chol为胆固醇甲酰基，结构式为：
R为多肽，结构式：或
R1为：R2为x＝4～30；R3为：
本发明所述的聚合物的数均分子量为4794～7002g/mol。
本发明还提供了一种上述基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的制备方法，包括以下具体步骤：
(1)制备中间产物D：将单体A、催化剂B和溶剂混合，搅拌反应后再滴加单体C溶液，继续反应，得到中间产物D；
(2)将步骤(1)制备得到的中间产物D、催化剂E、脱水剂F和溶剂混合，搅拌反应，再加入单体G溶液，继续反应，得到基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物。
所述的单体A为多肽，具有如下式(2)～(4)所示结构中的一种：
其中，x＝4～30。
所述的单体C为胆固醇甲酰氯，其结构式如下式(5)：
所述单体G为氨基聚乙二醇单甲醚，其结构式如下式(6)：
其中，n＝44。
步骤(1)中所用单体A和单体C的质量比优选为1:(5～15)。
步骤(2)中所用中间产物D和单体G的质量比优选为1:(5～15)。
步骤(1)中所述的催化剂B为本领域常用的酰胺合成催化剂即可，如有机碱等，优选为三乙胺。公知地，酰胺合成过程中加入有机碱等催化剂用于除去反应生成的酸类物质，以促进反应的进行，因此其用量为大量过量即可。优选与单体A的质量比为(10～20):1。
步骤(2)中所述的催化剂E为本领域常用的任意改进酰胺化以及肽偶联反应催化剂即可，优选为N-羟基琥珀酰亚胺。公知地，反应过程中酰胺键形成时，可运用碳二亚胺方法活化羰基基团，使反应顺利进行，优选与中间产物D的质量比为(0.8～1.2):1。
步骤(2)中所述的脱水剂F为本领域常用的脱水剂即可，优选为二环己基碳二亚胺。公知地，反应过程中，减少产物的量可以有效推进反应的顺利进行，提高产物产率，本发明利用脱水剂脱去反应生成的水，以促进反应的进行。优选与中间产物D的质量比为(0.8～1.2):1。
步骤(1)和(2)所述的溶剂为本领域常用的有机溶剂即可，优选为二甲基甲酰胺(DMF)，所述单体C溶液的溶剂为本领域常用的有机溶剂即可，优选为二甲基甲酰胺，所述的单体G溶液的溶剂为本领域常用的有机溶剂即可，优选为二甲基甲酰胺。
优选地，步骤(1)中搅拌反应的时间优选为0.5～1h。
步骤(1)中所述继续反应的时间优选为48～96h，更优选为60～80h。
步骤(2)中所述搅拌反应的时间优选为0.5～1h。
步骤(2)中所述继续反应的时间优选为24～72h，更优选为40～56h。
上述反应过程在室温下进行即可，优选在惰性气体保护和无水条件下进行。反应结束后，可通过除去催化剂、过滤、透析、冻干等操作纯化制备得到的中间产物D及最终产物。
所述除去催化剂指将反应后的溶液置于透析袋中，在介质二甲基甲酰胺中透析48h，然后将介质换做去离子水继续透析48h。
上述本发明的基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物在水溶液中自组装为纳米胶束，有效包载水难溶性药物，可应用于医药领域，特别适用于制备水难溶性药物的胶束载药系统中。
本发明还提供了一种基于本发明的基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的水难溶性药物的胶束载药系统，具体通过将本发明的基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物和水难溶性药物溶于有机溶剂中，搅拌6～12h后用pH缓冲液透析24～48h后冷冻干燥得到。
所述的有机溶剂可为本领域常用任意有机溶剂，优选为二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或丙酮。
所述pH缓冲液优选为pH值7～9的缓冲溶液。
所述水难溶性药物是指在1L水中溶解度小于或等于1g的药物。
上述水难溶性药物的胶束载药系统可用于注射给药方式，通过肿瘤细胞与正常细胞环境pH差异调节和控制药物在正常偏碱性或者中性环境中缓慢或者不释放，在弱酸性的肿瘤环境中较快速释放。
本发明的机理为：
本发明采用疏水材料胆固醇修饰具有pH响应性的以聚组氨酸为主体骨架的多肽得到两嵌段聚合物，再采用亲水性的聚乙二醇单甲醚修饰多肽的另一侧，得到亲水/pH敏感/疏水三嵌段的多肽聚合物。该聚合物分子在水溶液中自组装为纳米胶束，有效包载水难溶性药物，可用于制备水难溶性抗癌药物的靶向载药系统。且本发明的聚合物分子结构可以通过调节多肽组成方便地调节其自组装胶束中pH响应区域，提高载药量，使pH响应-胶束溶胀-药物释放呈现为一个逐步的过程，从而提高胶束的pH响应灵敏度及释放效率，改善胶束载药体系的控释性能，同时也可以有效缓解突释。本发明多肽聚合物的胶束壳层的较长的亲水嵌段形成胶束外壳，可以提高胶束壳层密度，增强胶束表面的亲水性，有利于胶束稳定性、增强抗蛋白和血小板吸附能力，延长胶束在体内的循环时间，从而改善胶束载药体系的控释性能。载药胶束注射给药后，在正常弱碱性人体环境中，由于疏水材料胆固醇和pH响应嵌段多肽同为疏水，胶束内核紧密、结构稳定，药物释放量少，从而保护药物。随着pH变化，到达弱酸性条件下，组氨酸的咪唑基团质子化，胶束表面带上正电，有利于通过细胞膜，进入肿瘤细胞，且多肽的质子化使胶束发生溶胀，药物释放速率加快。可以通过调节聚合物材料中pH响应嵌段的含量，适应不同的释放要求。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明的聚合物分子在水溶液中自组装为纳米胶束，有效包载水难溶性药物，可应用作为水难溶性抗癌药物的靶向载药系统。
(2)本发明的亲水/pH敏感/疏水三嵌段的多肽聚合物，既有效提高胶束载药量，又有效调节聚合物材料的pH响应范围，使胶束不但能迅速响应环境pH值的变化，而且有效的缓解突释和控制药物释放。
(3)本发明的多肽聚合物可通过调节聚合物分子材料中具有pH响应功能的多肽含量来调控药物的释放速率，满足不同药物的释放要求。
(4)本发明的多肽聚合物的临界聚集浓度较低，仅为1.8～4.8mg/L，因而其载药胶束的稳定性高。
(5)本发明的多肽聚合物的拓扑结构可调控；合成工艺简单，产率较高。
附图说明
图1为实施例1的基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的制备反应式。
图2为实施例1中mPEG-NH2的核磁共振氢谱，溶剂为氘代氯仿。
图3为实施例1中中间产物D的核磁共振氢谱，溶剂为重水。
图4为实施例1中mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol的核磁共振氢谱，溶剂为重水。
图5为实施例6中mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol的临界胶束浓度测试曲线。
图6为实施例7中mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol的pKb值的测试曲线。
图7为实施例8中空白胶束的粒径随pH变化图。
图8为实施例8中空白胶束的电位随pH变化图。
图9为实施例9中载药胶束的扫描电镜图和透射电镜图。
图10为实施例10中mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol载阿霉素胶束的体外释放曲线。
图11为实施例11中空白胶束对HepG2和NIH 3T3的毒性曲线图。
图12为实施例11中载药胶束以及游离阿霉素对HepG2作用24h后的毒性曲线图。
图13为实施例11中载药胶束以及游离阿霉素对HepG2作用48h后的毒性曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的制备
基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的制备反应式见图1。
(1)具有公式(2)所示结构多肽的制备采用常规的固相合成多肽制备方法即可，可由以下方法制备得到：将2-氯三苯甲基氯树脂(2-ChlorotritylChloride Resin)放入反应管中，加入二氯甲烷(15mL/g)，振荡30min。抽滤除去溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Cys(Trt)-OH氨基酸，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，再加入10倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺，振荡60min，用甲醇封闭，加含有20％哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液(15mL/g)，混合15min，分别用N,N-二甲基甲酰胺溶液和二氯甲烷溶液润洗两次。加入三倍摩尔量的氨基酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，十倍摩尔量的N,N-二异丙基乙胺，反应30min。分别再用N,N-二甲基甲酰胺溶液和二氯甲烷溶液润洗两次。重复上述氨基酸的加入反应过程，从右到左依次连接序列中的半胱氨酸和组氨酸。反应完成后，分别用N,N-二甲基甲酰胺溶液和二氯甲烷溶液以及甲醇清洗两次，抽干10min。将配置好的溶液(三氟乙酸基95％；水1％；甲基丙烯酸二乙氨基乙酯2％；三异丙基硅烷2％)加入到反应中，混合120min。将上述反应液用氮气吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。用高效液相色谱将粗品提纯。收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
(2)合成中间产物D(多肽-胆固醇)：于50mL的干燥茄形瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气-抽真空三次，排除其中氧气。用注射器将步骤(1)制备得到的多肽(20mg，5.69×10-3mmol)二甲基甲酰胺溶液迅速注入圆底烧瓶中，然后加入催化剂TEA(11.9μL，85.35×10-3mmol)，搅拌30min，使溶液混合均匀。将胆固醇(25.55mg，56.9×10-3mmol)二甲基甲酰胺溶液用注射器缓慢逐滴加入到反应瓶中。在室温、氩气保护下反应72h。反应结束后，将反应液在14000rpm转速下离心2min，除去副产物与未反应的原料，取上层清液置于透析袋中(MWCO3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，换液4次，除去胆固醇等杂质，继而将透析液换成去离子水，继续透析48h，换液8次，除去有机溶剂和水溶性杂质，然后收集透析后的溶液，冷冻干燥，得到纯化后的胆固醇修饰多肽中间产物，进行核磁分析，见图3。Mn＝3948，PDI＝1.35。
(3)合成三嵌段pH响应聚合物mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol：于50mL的干燥茄形瓶中装入搅拌子，中间产物D(13.8mg，3.51×10-3mmol)，催化剂N-羟基琥珀酰亚胺(0.4mg，3.51×10-3mmol)和脱水剂二环己基碳二亚胺(0.72mg，3.51×10-3mmol)，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气-抽真空三次，排除其中氧气。采用注射器加入10mL无水DMF作为溶剂，搅拌30min，使溶液混合均匀。将mPEG-NH2(70.2mg，35.1×10-3mmol)溶解于10mL无水DMF中，在搅拌下，缓慢逐滴加入到反应瓶中。在室温、氩气保护下，搅拌反应48h。反应结束后，将反应液在14000rpm转速下离心2min，除去副产物与未反应的原料，取上层清液置于透析袋中(MWCO3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，换液4次，除去胆固醇等杂质，继而将透析液换成去离子水，继续透析48h，换液8次，除去有机溶剂和水溶性杂质，然后收集透析后的溶液，冷冻干燥，得到mPEG修饰的胆固醇接枝多肽聚合物，进行核磁分析，溶剂为重水，见图4。Mn＝5980，PDI＝1.40。
对mPEG-NH2进行核磁共振分析，溶剂为氘代氯仿，结果见图2。
实施例2：基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的制备
(1)公式(3)所示多肽的制备采用常规的固相合成多肽制备方法即可，可由以下方法制备得到：将2-氯三苯甲基氯树脂(2-Chlorotrityl Chloride Resin)放入反应管中，加入二氯甲烷(15mL/g)，振荡30min。通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Cys(Trt)-OH氨基酸，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，再加入10倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺，振荡60min。用甲醇封闭。加含有20％哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液(15mL/g)，混合15min，分别用N,N-二甲基甲酰胺溶液和二氯甲烷溶液润洗两次。加入三倍摩尔量的氨基酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯，十倍摩尔量的N,N-二异丙基乙胺，反应30min。分别再用N,N-二甲基甲酰胺溶液和二氯甲烷溶液润洗两次。重复上述氨基酸的加入反应过程，从右到左依次连接序列中的氨基酸，接完第9个氨基酸后，投入三倍摩尔过量的特殊原料Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，三倍摩尔过量的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯，加入反应管，立刻加入N,N-二异丙基乙胺十倍过量.反应30min。重复上述氨基酸的加入反应过程，从右到左依次连接序列中的氨基酸，直到结束。将配置好的溶液(三氟乙酸基95％；水1％；甲基丙烯酸二乙氨基乙酯2％；三异丙基硅烷2％)加入到反应中，混合120min。将上述反应液用氮气吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。用高效液相色谱将粗品提纯。收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
(2)合成中间产物D(多肽-胆固醇)：于50mL的干燥茄形瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气-抽真空三次，排除其中氧气。用注射器将步骤(1)制备得到的多肽(21.3mg，5.69×10-3mmol)溶液迅速注入圆底烧瓶中，然后加入催化剂TEA(7.6μL，56.9×10-3mmol)，搅拌30min，使溶液混合均匀。将胆固醇(12.78mg，28.45×10-3mmol)溶液用注射器缓慢逐滴加入到反应瓶中。在室温、氩气保护下反应48h。反应结束后，将反应液在14000rpm转速下离心2min，除去副产物与未反应的原料，取上层清液置于透析袋中(MWCO3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，换液4次，除去胆固醇等杂质，继而将透析液换成去离子水，继续透析48h，换液8次，除去有机溶剂和水溶性杂质，然后收集透析后的溶液，冷冻干燥，得到纯化后的胆固醇修饰多肽中间产物。Mn＝4025，PDI＝1.55。
(3)合成三嵌段pH响应聚合物mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol：于50mL的干燥茄形瓶中装入搅拌子，中间产物D(16.1mg，3.51×10-3mmol)，催化剂N-羟基琥珀酰亚胺(0.32mg，2.81×10-3mmol)和脱水剂二环己基碳二亚胺(0.58mg，2.81×10-3mmol)，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气-抽真空三次，排除其中氧气。采用注射器加入10mL无水DMF作为溶剂，搅拌30min，使溶液混合均匀。将mPEG-NH2(35.1mg，17.55×10-3mmol)溶解于10mL无水DMF中，在搅拌下，缓慢逐滴加入到反应瓶中。在室温、氩气保护下，搅拌反应72h。反应结束后，将反应液在14000rpm转速下离心2min，除去副产物与未反应的原料，取上层清液置于透析袋中(MWCO3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，换液4次，除去胆固醇等杂质，继而将透析液换成去离子水，继续透析48h，换液8次，除去有机溶剂和水溶性杂质，然后收集透析后的溶液，冷冻干燥，得到mPEG修饰的胆固醇接枝多肽聚合物。Mn＝6258，PDI＝1.61。
实施例3：基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的制备
(1)公式(4)所示多肽的制备采用常规的固相合成多肽制备方法即可，可由以下方法制备得到：将2-氯三苯甲基氯树脂(2-Chlorotrityl Chloride Resin)放入反应管中，加入二氯甲烷(15mL/g)，振荡30min。通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-Cys(Trt)-OH氨基酸，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解，再加入10倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺，振荡60min。用甲醇封闭。加含有20％哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液(15mL/g)，混合15min，分别用N,N-二甲基甲酰胺溶液和二氯甲烷溶液润洗两次。投入三倍摩尔过量的特殊原料Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，三倍摩尔过量的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯，加入反应管，立刻加入N,N-二异丙基乙胺十倍过量，反应30min。加含有20％哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液(15mL/g))，混合15min，分别用N,N-二甲基甲酰胺溶液和二氯甲烷溶液润洗两次。投入六倍摩尔过量的特殊原料Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，六倍摩尔过量的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯，加入反应管，立刻加入N,N-二异丙基乙胺十倍过量，反应30min。重复上述步骤，耦合为赖氨酸的四臂结构。重复实施案例中耦合组氨酸的步骤，上从右到左依次连接序列中的氨基酸，直到结束。将配置好的溶液(三氟乙酸基95％；水1％；甲基丙烯酸二乙氨基乙酯2％；三异丙基硅烷2％)加入到反应中，混合120min。将上述反应液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。用高效液相色谱将粗品提纯。收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
(2)合成中间产物D(多肽-胆固醇)：于50mL的干燥茄形瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气-抽真空三次，排除其中氧气。用注射器将步骤(1)制备得到的多肽(23.9mg，5.69×10-3mmol)溶液迅速注入圆底烧瓶中，然后加入催化剂TEA(15.8μL，0.1138mmol)，搅拌30min，使溶液混合均匀。将胆固醇(38.3mg，85.35×10-3mmol)溶液用注射器缓慢逐滴加入到反应瓶中。在室温、氩气保护下反应48h。反应结束后，将反应液在14000rpm转速下离心2min，除去副产物与未反应的原料，取上层清液置于透析袋中(MWCO3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，换液4次，除去胆固醇等杂质，继而将透析液换成去离子水，继续透析48h，换液8次，除去有机溶剂和水溶性杂质，然后收集透析后的溶液，冷冻干燥，得到纯化后的胆固醇修饰多肽中间产物。Mn＝4491，PDI＝1.47。
(3)合成三嵌段pH响应聚合物mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol：于50mL的干燥茄形瓶中装入搅拌子，中间产物D(20.6mg，3.51×10-3mmol)，催化剂N-羟基琥珀酰亚胺(0.48mg，4.21×10-3mmol)和脱水剂二环己基碳二亚胺(0.86mg，4.21×10-3mmol)，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气-抽真空三次，排除其中氧气。采用注射器加入10mL无水DMF作为溶剂，搅拌30min，使溶液混合均匀。将mPEG-NH2(105.3mg，52.65×10-3mmol)溶解于10mL无水DMF中，在搅拌下，缓慢逐滴加入到反应瓶中。在室温、氩气保护下，搅拌反应24h。反应结束后，将反应液在14000rpm转速下离心2min，除去副产物与未反应的原料，取上层清液置于透析袋中(MWCO 3500-4000Da)，透析液采用DMF，透析48h，换液4次，除去胆固醇等杂质，继而将透析液换成去离子水，继续透析48h，换液8次，除去有机溶剂和水溶性杂质，然后收集透析后的溶液，冷冻干燥，得到mPEG修饰的胆固醇接枝多肽聚合物。Mn＝6502，PDI＝1.67。
实施例4：基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的制备
(1)合成中间产物D(多肽-胆固醇)：于50mL的干燥茄形瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气-抽真空三次，排除其中氧气。用注射器将具有公式(2)所示结构的多肽(制备方法同实施例1，20mg，5.69×10-3mmol)溶液迅速注入圆底烧瓶中，然后加入催化剂TEA(15.8μL，0.1138mmol)，搅拌30min，使溶液混合均匀。将胆固醇(38.3mg，85.35×10-3mmol)溶液用注射器缓慢逐滴加入到反应瓶中。在室温、氩气保护下反应96h。反应结束后，将反应液在14000rpm转速下离心2min，除去副产物与未反应的原料，取上层清液置于透析袋中(MWCO3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，换液4次，除去胆固醇等杂质，继而将透析液换成去离子水，继续透析48h，换液8次，除去有机溶剂和水溶性杂质，然后收集透析后的溶液，冷冻干燥，得到纯化后的胆固醇修饰多肽中间产物。Mn＝3795，PDI＝1.49。
(2)合成三嵌段pH响应聚合物mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol：于50mL的干燥茄形瓶中装入搅拌子，中间产物D(13.8mg，3.51×10-3mmol)，催化剂N-羟基琥珀酰亚胺(0.48mg，4.21×10-3mmol)和脱水剂二环己基碳二亚胺(0.86mg，4.21×10-3mmol)，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气-抽真空三次，排除其中氧气。采用注射器加入10mL无水DMF作为溶剂，搅拌30min，使溶液混合均匀。将mPEG-NH2(105.3mg，52.65×10-3mmol)溶解于10mL无水DMF中，在搅拌下，缓慢逐滴加入到反应瓶中。在室温、氩气保护下，搅拌反应48h。反应结束后，将反应液在14000rpm转速下离心2min，除去副产物与未反应的原料，取上层清液置于透析袋中(MWCO 3500-4000Da)，透析液采用DMF，透析72h，换液4次，除去胆固醇等杂质，继而将透析液换成去离子水，继续透析48h，换液8次，除去有机溶剂和水溶性杂质，然后收集透析后的溶液，冷冻干燥，得到mPEG修饰的胆固醇接枝多肽聚合物。Mn＝4794，PDI＝1.44。
实施例5：基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的制备
(1)合成中间产物D(多肽-胆固醇)：于50mL的干燥茄形瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气-抽真空三次，排除其中氧气。用注射器将具有公式(2)所示结构的多肽(制备方法同实施例120mg，5.69×10-3mmol)溶液迅速注入圆底烧瓶中，然后加入催化剂TEA(15.8μL，0.1138mmol)，搅拌30min，使溶液混合均匀。将胆固醇(38.3mg，85.35×10-3mmol)溶液用注射器缓慢逐滴加入到反应瓶中。在室温、氩气保护下反应96h。反应结束后，将反应液在14000rpm转速下离心2min，除去副产物与未反应的原料，取上层清液置于透析袋中(MWCO3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，换液4次，除去胆固醇等杂质，继而将透析液换成去离子水，继续透析48h，换液8次，除去有机溶剂和水溶性杂质，然后收集透析后的溶液，冷冻干燥，得到纯化后的胆固醇修饰多肽中间产物。Mn＝3771，PDI＝1.47。
(2)合成三嵌段pH响应聚合物mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol：于50mL的干燥茄形瓶中装入搅拌子，中间产物D(13.8mg，3.51×10-3mmol)，催化剂N-羟基琥珀酰亚胺(0.48mg，4.21×10-3mmol)和脱水剂二环己基碳二亚胺(0.86mg，4.21×10-3mmol)，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氩气-抽真空三次，排除其中氧气。采用注射器加入10mL无水DMF作为溶剂，搅拌30min，使溶液混合均匀。将mPEG-NH2(105.3mg，52.65×10-3mmol)溶解于10mL无水DMF中，在搅拌下，缓慢逐滴加入到反应瓶中。在室温、氩气保护下，搅拌反应24h。反应结束后，将反应液在14000rpm转速下离心2min，除去副产物与未反应的原料，取上层清液置于透析袋中(MWCO3500Da)，透析液采用DMF，透析48h，换液4次，除去胆固醇等杂质，继而将透析液换成去离子水，继续透析48h，换液8次，除去有机溶剂和水溶性杂质，然后收集透析后的溶液，冷冻干燥，得到mPEG修饰的胆固醇接枝多肽聚合物。Mn＝6070，PDI＝1.62。
实施例6
荧光探针法测定实施例1产物mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol的临界胶束浓度。
(1)配制芘溶液：用丙酮将芘配制成6×10-5M的溶液。
(2)称取10mg实施例1制备得到的mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol溶于5mL丙酮，逐滴加入到100mL去离子水中，挥发丙酮后得到0.1mg/mL溶液，随后稀释成一系列浓度(0.0001～0.1mg/mL)。取20支10mL容量瓶，每支加入0.1mL芘溶液，然后分别加入上述不同浓度的聚合物溶液配成样品液。样品液中芘的浓度为6×10-7M。
(3)荧光光谱测试：以373nm作为发射波长，测试样品液在300～350nm的激发光谱，取I338/I334比值对浓度对数logC作图，见图5，曲线转折点即为临界胶束浓度值。测得mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol的临界胶束浓度为4.79mg/L。
实施例7
通过酸碱滴定法检测本发明多肽聚合物的pKb值。称取10mg实施例1制备得到的mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol溶解在10mL去离子水中得到聚合物溶液，采用稀盐酸溶液调节pH至3。在室温、搅拌下缓慢滴加NaOH(0.1mol/mL)，检测pH变化情况，其检测曲线见图6。测得mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol的pKb值为6.1。
实施例8
制备mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol的空白胶束，并表征其粒径及电位随pH变化的情况。采用透析法制备空白胶束。准确称取20mg实施例1制备得到的mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol溶于50mL二甲基甲酰胺中，室温下搅拌2h，转入透析袋(MWCO3500Da)，用1L去离子水透析48h，前12h，每2h更换一次透析介质，后36h，没6h更换一次透析介质。将胶束溶液经孔径为0.8μm的过滤头过滤后冷冻干燥。将空白胶束依次加入预配好的不同pH值的PBS缓冲溶液中，放置0.5h。采用动态光散射法测mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol粒径及电位随pH值的变化。见图7和图8。
实施例9
采用透析法制备载药胶束。准确称取10mg阿霉素，20mg实施例1制备得到的mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol溶于50mL二甲基甲酰胺中，滴加TEA(0.02mL)于室温下搅拌2h后，转入透析袋(MWCO3500Da)，用1L去离子水透析48h，前12h，每2h更换一次透析介质，后36h，每6h更换一次透析介质。将胶束溶液经孔径为0.8μm的过滤头过滤后冷冻干燥。采用SEM和TEM观察其形貌为球形，见图9。
实施例10
体外释放实验：精确称取3mg实施例9制备得到的载药胶束粉末，置于透析袋(MWCO3500Da)中，然后分别加入3mL PBS缓冲溶液(pH 5.0和7.4)，封好透析袋，转入药物溶出仪，加入40mL PBS缓冲液。设定温度在37℃，搅拌速度为110rpm。每隔一定时间取样3mL，并加入3mL新鲜缓冲液。用紫外分光光度法测定不同时间释放液中阿霉素浓度，绘制其体外释放曲线。
图10是mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol的体外释放曲线，在正常环境中(pH7.4)，药物释放速度都很慢：3h释放低于22％，148h释放低于40％，有效保护药物在人体血液循环过程中的流失。在弱酸环境中(pH 5.0)，mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol载药胶束在1.5h就释放出40％，24h释放了65％，148h释放接近90％。
实施例11
分别利用实施例1、2和3制备得到的mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol按照实施例8和实施例9的方法制备空白胶束和载药胶束。
细胞毒性实验：将HepG2和NIH 3T3细胞(购买于ATCC)按1×104的密度平铺在96孔板上，加入200μL培养液，培养24h。将一定浓度的游离阿霉素(DOX)，空白胶束和载药胶束添加进入孔板中，更新培养介质。每个浓度平行重复3个。将孔板放入卵化器中，5％CO2和37℃，分别维持24h和48h。用180μL新鲜培养液和20μL MTT溶液替换孔板中介质，继续卵化4h，用200μL DMSO替换孔板介质。将孔板放在37℃摇床中振荡15min，然后利用酶标仪测定490nm出每个孔的吸光度A，计算细胞存活率，评价其细胞毒性。
图11是空白mPEG-b-PolyPeptides-b-Chol的细胞毒性图。由图可知，随着嵌段聚合物浓度的增大，细胞存活率有轻微下降，当聚合物浓度为400mg/L时，实施例1、2和3的多肽聚合物相对应的细胞存活率为97.7％，95.5％和95.4％，可见三种多肽聚合物材料对细胞的毒性均较低，细胞成活率较高，说明材料本身几乎不具有毒副作用。图12和图13(HepG2细胞)是游离阿霉素、三个实施例产物载药胶束和游离盐酸阿霉素24h和48h后的细胞毒性图。由图可知，24h和48h后，细胞存活率为50％(IC50)所对应的游离DOX和载药胶束的浓度分别为1.5mg/L，2.0mg/L，3.6mg/L，5.0mg/L，9.1mg/L(24h)和0.8mg/L，1.0mg/L，1.7mg/L，1.9mg/L，7.5mg/L(48h)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物，其特征在于具有公式(1)所示结构：
mPEG-R-Chol (1)
其中，mPEG为氨基聚乙二醇单甲醚，结构式：n＝44；
Chol为胆固醇甲酰基，结构式为：结构式为
R为多肽，结构式：*-R1-R2-R1-*、
R1为：R2为：x＝4～30；R3为：
2.一种根据权利要求1所述的基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤：
(1)制备中间产物D：将单体A、催化剂B和溶剂混合，搅拌反应后再滴加单体C溶液，继续反应，得到中间产物D；
(3)将步骤(2)制备得到的中间产物D、催化剂E、脱水剂F和溶剂混合，搅拌反应，再加入单体G溶液，继续反应，得到基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物；
所述的单体A为多肽，具有如下式(2)～(4)所示结构中的一种：
其中，x＝4～30；
所述的单体C为胆固醇甲酰氯，其结构式如下式(5)：
所述单体G为氨基聚乙二醇单甲醚，其结构式如下式(6)：
其中，n＝44。
3.根据权利要求2所述的基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所用单体A和单体C的质量比为1:(5～15)；步骤(2)中所用中间产物D和单体G的质量比为1:(5～15)。
4.根据权利要求2所述的基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的催化剂B为三乙胺；步骤(2)所述的催化剂E为N-羟基琥珀酰亚胺；步骤(2)所述的脱水剂F为二环己基碳二亚胺。
5.根据权利要求2所述的基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中搅拌反应的时间为0.5～1h；所述继续反应的时间为48～96h。
6.根据权利要求2所述的基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述搅拌反应的时间为0.5～1h；所述继续反应的时间为24～72h。
7.根据权利要求1所述的基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物在医药领域中的应用。
8.根据权利要求1所述的基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物在制备水难溶性药物的胶束载药系统中的应用。
9.一种基于权利要求1所述的基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物的水难溶性药物的胶束载药系统，其特征在于通过将所述的基于胆固醇修饰的pH响应多肽聚合物和水难溶性药物溶于有机溶剂中，搅拌6～12h后用pH缓冲液透析24～48h后冷冻干燥得到。
10.根据权利要求9所述的水难溶性药物的胶束载药系统，其特征在于：所述水难溶性药物是指在1L水中溶解度小于或等于1g的药物。
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|---|---|---|---|---|
| CN106565962A (zh) * | 2016-10-24 | 2017-04-19 | 东莞理工学院 | 一种胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物及其制备方法与应用 |
| CN106565962B (zh) * | 2016-10-24 | 2020-05-19 | 东莞理工学院 | 一种胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物及其制备方法与应用 |
| CN108014331A (zh) * | 2016-11-03 | 2018-05-11 | 四川大学 | 具有pH敏感的短肽修饰聚合物及其制备方法和用途 |
| CN108014331B (zh) * | 2016-11-03 | 2020-01-03 | 四川大学 | 具有pH敏感的短肽修饰聚合物及其制备方法和用途 |
| CN114805821A (zh) * | 2022-04-28 | 2022-07-29 | 上海摩漾生物科技有限公司 | 一种基于纤维素的可降解抗菌肽及其制备方法 |
| CN114805821B (zh) * | 2022-04-28 | 2023-02-03 | 上海摩漾生物科技有限公司 | 一种基于纤维素的可降解抗菌肽及其制备方法 |
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