CN101538368A

CN101538368A - 具有温度/pH双重敏感性质的共聚物及其制备和应用

Info

Publication number: CN101538368A
Application number: CN200910010116A
Authority: CN
Inventors: 乔明曦; 古建春; 陈大为; 胡海洋; 赵秀丽
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2009-01-16
Filing date: 2009-01-16
Publication date: 2009-09-23
Anticipated expiration: 2029-01-16
Also published as: CN101538368B

Abstract

本发明属于医药技术领域，公开一种新型温度/pH双敏自组装嵌段共聚物，聚组氨酸－聚乳酸羟基乙酸－聚乙二醇－聚乳酸羟基乙酸－聚组氨酸(OLH－b－PLGA－b－PEG－b－PLGA－b－OLH)，该共聚物符合温度/pH双敏聚合物的结构特点，分子结构中分别具有对温度变化产生响应的聚乳酸羟基乙酸－聚乙二醇－聚乳酸羟基乙酸(PLGA－b－PEG－b－PLGA)链节和对pH变化产生响应的低聚组氨酸链节。共聚物在室温下可溶解于水，形成自由流动的胶束溶液，在外界环境的温度和pH发生变化时，不同结构比例的共聚物可分别表现为：①溶液－凝胶的相转变；②胶束结构解离的响应行为。具有①响应行为的共聚物可作为注射式缓控释给药系统的载体；具有②响应行为的共聚物可作为胶束靶向给药系统载体。

Description

具有温度/pH双重敏感性质的共聚物及其制备和应用

技术领域

本发明属于医药材料技术领域，具体涉及一种新型的温度/pH双敏型共聚物，本发明还涉及用该聚合物制备温敏/pH双敏型凝胶给药体系和pH敏感型胶束给药体系。

背景技术

近年来，在生物材料和高分子化学科学高速发展的推动下，各种功能性高分子材料不断涌现，促使药物剂型和制剂的研究迅速发展并已经进入给药系统(Drug delivery system，DDS)时代，研制长效、高效、靶向等新型给药系统代表了药剂学科的发展方向。

环境敏感型聚合物(Environmentally sensitive polymers)是能够感知外界环境的物理或化学刺激(如温度、pH、光线或离子强度等变化)并作出响应的一类新型功能性高分子材料，也称为智能型聚合物(Intelligentpolymers or smart polymers)。这些智能型聚合物可以以多种形式存在：①水溶液；②吸附或键合在液-固界面；③物理或化学交联形成凝胶，在外界环境因素变化时可分别表现为溶液的相转变或分离、液-固界面亲水性和凝胶溶胀行为的可逆性变化，因此，在药物释放系统、活性酶包埋、蛋白质分子分离体系等领域具有广泛的用途。其中，采用环境敏感型聚合物作为药物传递系统的载体，可制成自调式释药系统，这种新型给药系统可通过感知生物系统环境因素或病变部位环境信息的变化，调节药物的释放过程，从而使药物在必要的时间和特定的部位释放，实现药物释放的定位、定时、定量控制。

由于温度和pH是生物系统与外界环境最重要的区别因素，因此温度和pH敏感型聚合物一直是新型药物载体研究的热点。温度敏感型聚合物PLGA-PEG-PLGA(Injectable biodegradable temperature-responsivePLGA-PEG-PLGA copolymers：Synthesis and effect of copolymercomposition on the drug release from the copolymer-based hydrogels.International Journal of Pharmaceutics.2005，294(1-2)：103-112)，PEG-PCL-PEG(Caprolactonic poloxamer analog：PEG-PCL-PEG.Biomacromolecules.2005，6(2)：885-890.)，室温下可溶解于水或水性介质形成自由流动的液体，温度升高至体温时发生相转变形成半固体的凝胶，缓慢释放药物。因此，可用于制备局部注射缓控释给药系统的载体。此类共聚物的优点是，(1)制备和给药过程简单；(2)具有生物降解性；(3)缓控释效果好。

尽管目前的温度敏感型聚合物具有上述优点，但也存在明显的弊端，(1)单一的温敏响应性导致其在制备、贮存或给药过程中易产生粘度增大的现象，从而给制备和给药过程带来困难；(2)形成的凝胶在降解过程中产生酸性物质，导致微环境pH降低，对局部组织和药物的稳定性产生不良影响。上述缺点限制了其在给药系统中的应用。

pH敏感聚合物(pH-sensitive polymers)的分子结构中通常具有酸性或碱性的可离子化基团，在环境pH变化时可发生质子化或去质子化作用，使聚合物的亲水性发生可逆变化。组氨酸分子结构中存在一个咪唑基团，其pK_a在6.5左右，具有pH敏感性。环境pH小于6.5时，可发生质子化作用，显亲水性；而pH大于6.5时则发生去质子化作用，显疏水性。聚组氨酸(poly(L-histidine)，PLH)在中性环境下(pH7.4)分子结构中同时存在质子化和去质子化的组氨酸分子，对环境的pH变化极为敏感。此外，PLH具有独特的膜融合作用，在内吞小泡或溶酶体的弱酸性环境下带正电荷，可以与内吞小泡或溶酶体膜产生静电相互作用致其破裂。上述特点使聚组氨酸成为优于其它类型的pH敏感聚合物(如磺胺类聚合物)的主要原因。

Lee等(Doxorubicin loaded pH-sensitive polymeric micelles for reversal ofresistant MCF-7 tumor.J Control Release.2005，103(2)：405-418.)合成了pH敏感聚组氨酸-聚乙二醇嵌段共聚物(poly(His-b-PEG))，共聚物自组装形成的胶束在pH 8时稳定存在，pH 5-7时组氨酸的质子化作用使胶束解离。Poly(His-b-PEG)共聚物可用于包裹抗肿瘤药物，通过EPR效应浓集在弱酸性的肿瘤部位后释药。Kim等(pH-induced micelle formation ofPoly(histidine-co-Phenylalanine)-block-poly(ethylene glycol)in aqueous media.Macromol Sci.2005，5：1118-1124.)将组氨酸与苯丙氨酸和PEG共聚，合成了pH敏感聚(组氨酸-苯丙氨酸)-聚乙二醇嵌段共聚物，通过改变组氨酸与苯丙氨酸的比例和链节的长度，调节共聚物的pK_a。Park等(N-acetyl histidine-conjugatedglycol chitosan self-assembled nanoparticles for intracytoplasmicdelivery of drugs：Endocytosis，exocytosis and drug release.JControl Release.2006，115(1)：37-45.)用pH敏感N-乙酰基组氨酸-乙二醇壳聚糖聚合物作为药物载体，在中性环境下(pH7.4)聚合物自组装形成以组氨酸为内核的球状胶束，胶束通过细胞内吞作用进入细胞后，在内吞小泡的弱酸性环境下，胶束解离，实现细胞质内释药。

上述pH敏感共聚物存在稳定性差，在血浆中容易发生药物泄露和对环境微小的pH变化响应不灵敏的缺点，导致其在给药过程中不能按设计要求输送药物至靶部位。

发明内容

本发明旨在提供一种新型的温度/pH双敏型共聚物，分别将其应用于制备温度/pH双敏型凝胶给药体系和pH敏感型胶束靶向给药体系。

此共聚物至少包含温度敏感性亲水和疏水单元和pH敏感性单元，其温度敏感性疏水单元可选用任何疏水性聚酯单体，优选PLGA或PCLA，亲水性单元优选PEG。pH敏感性单元采用聚组氨酸或其结构类似物，类似物中含有咪唑环且具有较好的降解性和生物相容性。当环境pH等于或高于其pK_a时，该物质表现为疏水性；当环境pH小于其pK_a时，该物质质子化，显示亲水性。本发明的共聚物常规结构为OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH、OLH-b-PLGA-b-PEG、OLH-b-PCLA-b-PEG-b-PCLA-b-OLH、OLH-b-PCLA-b-PEG。用嵌段共聚物OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH制备的空白胶束和载药胶束粒径较小且分布均匀，放置一个月后粒径均无显著变化，可以作为胶束载药系统的载体。

一种注射式植入温度/pH双敏型凝胶给药体系，其特征在于：具有五嵌段结构的共聚物OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH、OLH-b-PLA-b-PEG-b-PLA-b-OLH、OLH-b-PCLA-b-PEG-b-PCLA-b-OLH，疏水性嵌段OLH-b-PLGA、OLH-b-PLA、OLH-b-PCLA的分子量长度介于1000-8000，其中OLH/PLGA、OLH/PLA、OLH/PCLA的摩尔比介于0.02-50；PLGA与PCLA链段丙交酯/乙交酯的摩尔比介于0.01-100，丙交酯/己内酯的摩尔比介于0.01-100；具有三嵌段结构的共聚物OLH-b-PLGA-b-PEG、OLH-b-PCLA-b-PEG，疏水性嵌段OLH-b-PLGA、OLH-b-PCLA的分子量长度介于2000-10000，其中OLH/PLGA、OLH/PCL的摩尔比介于0.02-50，PLGA与PCLA链段丙交酯/乙交酯的摩尔比介于0.01-100，丙交酯/己内酯的摩尔比介于0.01-100；亲水性嵌段的PEG的长度介于800-10000之间，理想值介于1000-5000。

一种静脉注射pH敏感胶束靶向给药体系，其特征在于：具有五嵌段结构的共聚物OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH、OLH-b-PLA-b-PEG-b-PLA-b-OLH、OLH-b-PCLA-b-PEG-b-PCLA-b-OLH，疏水性嵌段OLH-b-PLGA、OLH-b-PCLA、OLH-b-PLA的分子链长度介于750-8000，其中OLH/PLGA、OLH/PCLA、OLH/PLA的摩尔比介于0.01-100，丙交酯/己内酯的摩尔比介于0.01-100；具有三嵌段结构的共聚物OLH-b-PLGA-b-PEG、OLH-b-PCLA-b-PEG，疏水性嵌段OLH-b-PLGA或OLH-b-PCLA的分子量长度介于1500-10000，其中OLH/PLGA或OLH/PCLA的摩尔比介于0.01-100，PLGA与PCLA链段丙交酯/乙交酯的摩尔比介于0.01-100，丙交酯/己内酯的摩尔比介于0.01-100；亲水性嵌段的PEG的分子链长度介于1000-20000，理想值在2000-20000之间。

综上所述，将该类聚合物用于制备药物的温度/pH双敏注射式植入型凝胶缓释给药体系，所含的组氨酸及其类似物可以中和PLGA降解过程中产生的酸性物质，提高蛋白质、核酸等不耐酸药物的稳定性和降低材料对周围组织的局部刺激性。本共聚物也可用于制备pH敏感型胶束靶向给药体系，所含的组氨酸或其类似物单元在肿瘤部位、溶酶体、内涵体等低pH环境下结合质子，促使胶束解离，实现肿瘤靶向及细胞内释药。

本发明所述的共聚物是局部递送的，其递送途径包括皮下、肌肉、关节腔、肿瘤部位和眼部，且其共聚物是静脉递送的。

本发明针对单一温度和pH敏感共聚物的缺点，分别以温度和pH敏感的生物可降解的材料为链段，设计并合成新型温度/pH双敏型共聚物。此类共聚物可分别作为局部注射用缓控释给药系统和静脉注射用胶束靶向给药系统载体。该共聚物对环境温度和pH同时变化产生响应，同时在聚合物中含有能够中和材料降解所产生的酸性物质的链段，解决单一温敏型聚合物的缺点。同时，由于在结构中引入了温敏型的疏水链段，增加了其在血浆中的稳定性和对局部微环境pH变化的响应能力，解决了单一pH敏感型共聚物的缺点。

附图说明

图1为PLGA-b-PEG-b-PLGA嵌段共聚物的合成反应式

图2为PLGA-b-PEG-b-PLGA的FT-IR谱图

图3为PLGA-b-PEG-b-PLGA的NMR谱图

图4为N^im-DNP-L-histidine carboxyanhydride hydrochloride的合成反应式

图5为N^im-DNP-L-histidine carboxyanhydride hydrochloride的FT-IR谱图

图6为N^im-DNP-L-histidine carboxyanhydride hydrochloride的NMR谱图

图7为OLH的合成反应式

图8为OLH的FT-IR谱图

图9为OLH的NMR谱图

图10为OLH的GPC测定图谱

图11为羧基化PLGA-b-PEG-b-PLGA的合成反应式

图12为羧基化PLGA-b-PEG-b-PLGA的FT-IR谱图

图13为OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH嵌段共聚物的合成反应式1

图14为OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH嵌段共聚物的合成反应式2

图15为OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH嵌段共聚物合成的脱保护反应式

图16为OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH嵌段共聚物的GPC测定图谱

图17为OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH的FT-IR谱图

图18为OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH的NMR谱图

图19为OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH空白胶束的粒径测定图谱

图20为OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH包载药物的胶束粒径测定图谱

图21为OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH包载葫芦素胶束不同pH条件下的释放曲线

具体实施方式

实施例1：温度/pH双敏性OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH的合成

(1)具有温度敏感性的PLGA-b-PEG-b-PLGA嵌段共聚物的合成

称取聚乙二醇(PEG1000或PEG1500)与丙交酯(LA)，乙交酯(GA)和催化剂异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)，其中PEG与LA和GA质量和的质量比为2∶5，LA与GA的摩尔比为5∶1，Sn(Oct)2为所有单体质量和的0.5％，装入干燥的聚合管中，经氮气除氧后，真空下封管，在150℃下反应8h，得到无色透明的半固体产物。所得粗产物用冷水(小于10℃)溶解后，加热至80℃沉淀共聚物，除去低分子水溶性共聚物和未反应的单体化合物，重复三次后将分离得到的共聚物在室温下减压干燥，得到纯化的PLGA-PEG-PLGA三元共聚物，收率90％以上，反应式如图1所示，产物的FT-IR谱图和NMR谱图如图2图3所示。

(2)具有pH敏感性的组氨酸低聚物OLH的合成

A.合成N^im-DNP-L-histidine carboxyanhydride hydrochloride(N^im-DNP-L-histidine NCA)

将充分干燥的N^α-CBZ-N^im-DNP-L-histidine 1g溶解在10ml THF中，在一定温度下缓慢滴加0.2ml的氯化亚砜，待其反应充分后过滤、重结晶，真空干燥待用，产率90％。

反应式、产物FT-IR及NMR分别见图4、5、6。

B.N^im-DNP-L-histidine NCA的聚合反应，合成OLH。

取充分干燥的N im-DNP-L-histidine NCA 1.0g溶解到25ml DMF中，加入计算量的引发剂异丙胺5μl，在氮气保护下进行聚合反应3天，反应结束后，水沉淀过滤，真空干燥得产物(通过改变单体与引发剂的比例，可以得到所需分子量的低聚物OLH)，产率85％。

反应式、产物FT-IR及NMR分别见图7、8、9。

GPC(凝胶渗透色谱)测定结果如下：

GPC测定图谱见图10。

C.具有pH/温度双重敏感性聚合物OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH嵌段共聚物合成

羧基化PLGA-b-PEG-b-PLGA的合成：将制得的温度敏感性的PLGA-b-PEG-b-PLGA

PLGA 5.0g溶解于25ml DMF中，加入其摩尔量5倍量的琥珀酸酐和少量吡啶，回流反应12小时后，除去过量的琥珀酸酐，用二氯甲烷萃取后，除去溶剂得产品，产率90％。

反应式、产物FT-IR分别见图11、12

因羧基活泼氢在NMR谱图上灵敏度不高，故未进行NMR谱图的测定。

OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH嵌段共聚物的合成：将制得的羧基化PLGA-b-PEG-b-PLGA 1mmol，1.5mmol的NHS和1.5mmol的DCC溶解到DMSO中，搅拌活化12小时，然后在氮气保护下与2mmol的OLH反应3天，透析冻干得产品，产率80％。

反应式见图13、14。

脱保护基：将制得的产物C 1.0mg溶解到25ml DMSO中，加入13ml2-巯基乙醇，室温反应1天，溶液加入冰乙醚沉淀，产物过滤后用乙醚洗涤，真空干燥两天得产物。

反应式见图15

通过GPC测定分子量显示所得的产物分子量为目标产物的分子量。

GPC测定结果如下：

GPC图谱见图16，OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH嵌段共聚物的FT-IR谱图和NMR谱图见图17和18。

实施例2：相转变温度(PIT)测定

分别称取两个比例的适量共聚物，溶解于pH7.4PBS溶液中，配制浓度为20％的共聚物溶液，将溶液转移至玻璃容器中，调节磁力搅拌的转速为200rpm，同时保持水浴缓慢升温，升温速率为1℃/min，记录澄清溶液形成凝胶的温度。用于注射缓释材料的温度共聚物的相转变温度为36℃，相转变pH为7.0-7.4，确保其在生理环境下以凝胶状态存在，可缓释药物。用于胶束靶向给药系统材料的相转变温度为59℃，确保其在生理环境下以溶液状态存在，可用于静脉注射给药。

实施例3：OLH-PLGA-PEG-PLGA-OLH空白胶束的制备

取10mg OLH-PLGA-PEG-PLGA-OLH放入小西林瓶中，加入20ml去离子水，磁力搅拌5小时制得空白胶束，胶束有淡蓝色乳光，粒径90nm左右，粒径分布较窄。

实施例4：OLH-PLGA-PEG-PLGA-OLH空白胶束的制备

取10mg OLH-PLGA-PEG-PLGA-OLH溶解于2ml DMF中，将其溶液放入透析袋中(截留分子量5000)，外面加入去离子水500ml透析48小时，在此期间每6小时更换一次透析液，制得空白胶束，胶束有淡蓝色乳光，平均粒径70.7nm，粒径分布较窄。空白胶束粒径分布见附图20。

实施例5：载有葫芦素OLH-PLGA-PEG-PLGA-OLH胶束的制备

依实施例4的方法制得空白胶束，加入过量的葫芦素，磁力搅拌溶解24小时，滤去游离的葫芦素，制得载有葫芦素的胶束。载药胶束有淡蓝色乳光，平均粒径85.2nm，粒径分布较窄。载药胶束粒径分布见附图21，

实施例6：载有葫芦素OLH-PLGA-PEG-PLGA-OLH胶束的药物释放

体外释放度测定：精密吸取适量载药胶束(约含3mg葫芦素)装入透析袋(截留分子量5000)内，置于1000ml pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中，37℃下搅拌(25rpm)，定时取出释放介质1mL，同时补充相应量的新鲜释放介质。HPLC法测定释放介质中的药物含量，按照如下公式计算累积释放度。

E_{r} = \frac{V_{e} Σ_{i - 1}^{n - 1} C_{i} + V_{0} C_{n}}{m_{drug}}

式中：E_r-葫芦素的累积释放量，％；V_e-PBS的置换体积；

C_i-第i次置换取样时释放出的药物浓度，μg/mL；V₀-释放介质的体积；md_rug-载药胶束中葫芦素的含量，mg。

释放介质pH值对葫芦素释放的影响：其它条件不变，将透析袋分别置于pH5.0，6.8，7.4的PBS中，依上述体外释放度测定方法分别测定葫芦素的累积释放度，考察释放介质pH值对药物释放的影响，结果见附图22。结果表明，共聚物胶束在中性pH条件下稳定，药物释放速率较低，在体外模拟体内肿瘤局部酸性pH条件下，释药速率增加。温度/pH双敏共聚物解决了单一pH敏感共聚物对pH变化响应不敏感的缺点。

Claims

1、一种具有温度/pH双重敏感性质的共聚物，其特征在于：所述的共聚物分子结构中具有温度敏感性的疏水和亲水单元和pH敏感性单元。

2、权利要求1所述的共聚物，其特征在于：所述的温度敏感性的疏水性单元包括聚丙交酯乙交酯、聚丙交酯、聚己内酯丙交酯、聚己内酯乙交酯、聚乙交酯，亲水性单元包括聚乙二醇；所述的pH敏感性单元采用聚组氨酸或其结构类似物。

3、权利要求2所述的共聚物，其特征在于：所述的聚组氨酸结构类似物的分子中含有咪唑环。

4、权利要求2或3所述的共聚物，其特征在于：所述的聚组氨酸结构类似物，当环境pH等于或高于其pKa时，该物质表现为疏水性；当环境pH小于其pKa时，该物质质子化，显示亲水性。

5、权利要求1所述的共聚物，其特征在于：常规结构为OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH、OLH-b-PLGA-b-PEG、OLHb-PLA-b-PEG-b-PLA-b-OLH、OLH-b-PCLA-b-PEG-b-PCLA-b-OLH、OLH-b-PCLA-b-PEG。

6、权利要求2所述的共聚物，用于制备一种注射式植入温度/pH双敏型凝胶给药体系，其特征在于：具有五嵌段结构的共聚物OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH、OLH-b-PLA-b-PEG-b-PLA-b-OLH、OLH-b-PCLA-b-PEG-b-PCLA-b-OLH，疏水性嵌段OLH-b-PLGA、OLH-b-PLA、OLH-b-PCLA的分子量长度介于1000-8000，其中OLH/PLGA、OLH/PLA、OLH/PCLA的摩尔比介于0.02-50；PLGA与PCLA链段丙交酯/乙交酯的摩尔比介于0.01-100，丙交酯/己内酯的摩尔比介于0.01-100；具有三嵌段结构的共聚物OLH-b-PLGA-b-PEG、OLH-b-PCLA-b-PEG，疏水性嵌段OLH-b-PLGA、OLH-b-PCLA的分子量长度介于2000-10000，其中OLH/PLGA、OLH/PCL的摩尔比介于0.02-50，PLGA与PCLA链段丙交酯/乙交酯的摩尔比介于0.01-100，丙交酯/己内酯的摩尔比介于0.01-100；亲水性嵌段的PEG的长度介于800-10000之间。

7、权利要求2所述的共聚物，用于制备一种静脉注射pH敏感胶束靶向给药体系，其特征在于：pH敏感性单元采用聚组氨酸的共聚物具有五嵌段结构的共聚物OLH-b-PLGA-b-PEG-b-PLGA-b-OLH、OLH-b-PLA-b-PEG-b-PLA-b-OLH、OLH-b-PCLA-b-PEG-b-PCLA-b-OLH，疏水性嵌段OLH-b-PLGA、OLH-b-PCLA、OLH-b-PLA的分子链长度介于750-8000，其中OLH/PLGA、OLH/PCLA、OLH/PLA的摩尔比介于0.01-100，丙交酯/己内酯的摩尔比介于0.01-100；具有三嵌段结构的共聚物OLH-b-PLGA-b-PEG、OLH-b-PCLA-b-PEG，疏水性嵌段OLH-b-PLGA或OLH-b-PCLA的分子量长度介于1500-10000，其中OLH/PLGA或OLH/PCLA的摩尔比介于0.01-100，PLGA与PCLA链段丙交酯/乙交酯的摩尔比介于0.01-100，丙交酯/己内酯的摩尔比介于0.01-100；亲水性嵌段的PEG的分子链长度介于1000-20000

8、权利要求7所述的共聚物，其特征在于：所述的共聚物是局部递送的。

9、权利要求8所述的共聚物，其特征在于：所述的递送途径包括皮下、肌肉、关节腔、肿瘤部位和眼部。

10、权利要求7或8的共聚物，其特征在于：所述的共聚物是静脉递送的。