CN106565962A - 一种胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物及其制备方法与应用，通过迈克尔加成法制备出具有pH响应性的大分子单体聚‑β氨基酯(PAE)，再通过迈克尔加成法制备出具有pH响应性的三嵌段两亲性中间产物PAE‑b‑PEG‑b‑PAE，最后将胆固醇接枝到PAE‑b‑PEG‑b‑PAE上，得到胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol‑g‑PAE‑b‑PEG‑b‑PAE‑g‑Chol。将该胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物应用于制备装载水难溶性药物胶束系统，其能在水溶液中自组装为结构稳定的纳米胶束，能高效包载水难溶性药物，通过调整聚合物中不同嵌段的比例，可有效调节其pH响应范围，使胶束不但能迅速、精确响应环境pH值的变化，而且能有效的缓解突释，控制药物释放速率。

Description

一种胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物及其制备方法 与应用
技术领域
本发明涉及一种化合物，尤其涉及一种胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物。
背景技术
随着科技的日新月异，尽管人类已经在药物开发和递送领域取得了显著的成果，但是癌症(肿瘤)仍是世界范围内致死率最高的杀手。肿瘤一旦形成，尤其是恶性肿瘤，其生长速度较快，且常转移至正常器官组织，造成脏器功能严重受损，最终导致患者死亡。目前，传统的治疗手段，包括手术切除和放射治疗，存在较多弊端，例如切除不净，复发率和转移率高，杀伤(死)癌细胞的同时，对正常组织细胞同样具有损害，毒副作用大等。因此，在临床治疗中，仍大多采用化学(药物)疗法，在维持药物疗效的基础上，尽量降低毒副作用。但是，化学疗法仍旧存在一些弊端，所采用的药物(阿霉素、喜树碱、顺铂、环巴胺和紫杉醇等)大多是疏水性药物，其水溶性差、生物利用度较低、疗效差、肿瘤迁移和复发率较高，将其通过化学修饰转变为亲水性药物(盐酸阿霉素)后，其毒副作用增大，特别是心脏毒性，明显增大，因此对于化学(药物)疗法在临床上的广发而有效的应用仍面临诸多问题。
为了克服以上难题，推进化学疗法在肿瘤临床治疗中的应用，药物递送体系受到人们越来越多的关注，尤其是近二十年来，随着纳米科技和材料技术的不断发展，纳米级的药物递送体系得到全世界各国研究学者的关注。药物递送体系对于小分子疏水药物有很好的增溶作用，能有效增大其水溶性，同时体系具有较高的稳定性，延长了药物在体内的循环时间，通过肿瘤的“增强渗透与滞留”(EPR)效应能有效在肿瘤组织出累积，提高药物的生物利用度，同时降低药物的毒副作用及其他不了反应，从而优化肿瘤治疗效果。在众多药物递送体系中，由两亲性高分子聚合物自组装形成的纳米级胶束颗粒是当今研究的一个热点。两亲性集合物在水溶液中自组装形成具有特殊核-壳结构的胶束颗粒，疏水性的内核与小分子疏水药物(例如阿霉素)通过疏水相互作用结合，处于胶束体系的内部，亲水性的外壳均匀分布在体系外层，增强体系的稳定性有效避免体系在体内循环过程中被网状内皮系统(RES)清除的同时，也能有效避免药物的失效(水解或酶解等)。同时，通过调节聚合物分子中嵌段比例以及拓扑结构，能对其宏观性能做相应的改变，从而优化整个药物递送体系。近年来，随着生物技术的不断发展，人们对肿瘤癌细胞的特性有了更加深入的了解，研究表明，由于旺盛的新陈代谢，导致癌细胞无氧呼吸加剧，糖酵解而产生大量乳酸，导致肿瘤组织处及肿瘤癌细胞内温度偏高、pH偏低。人体内环境正常pH值为7.4左右，而在肿瘤组织处其pH为6.5～7.2之间，而肿瘤细胞内pH值降低至4.0～6.5间。根据肿瘤微环境的此种特性，具有pH响应性的聚合物胶束体系近年来层出不穷。此类聚合物胶束药物递送体系能精确响应环境中pH值的变化，从而实现药物的控制释放，降低药物毒副作用，提高药物生物利用度，优化肿瘤治疗效果。基于以上理论，为了克服化学疗法中的多种弊端，需要开发一种聚合物纳米胶束作为药物载体，其能有效负载药物，降低毒副作用，优化治疗效果。
Krishnamurthy等制备了一种由聚乙二醇-脲基聚碳酸酯(PEG-b-PUC)和聚乙二醇-b-酸基聚碳酸酯(PEG-b-PAC)两种胶束混合而成的体系，用作抗癌药物苯乙双胍(Phenformin)的递送载体，所制备的药物胶束递送体系平均粒径为102nm，且分布较窄，其在血清中可稳定存在48h，体系稳定性较好，生物实验证明，载药胶束体系能有效杀死人类肺癌细胞，抑制肿瘤的生长和转移，相较单纯的药物，其毒副作用得到明显降低。Qiu等制备了一种pH敏感的两亲性聚合物聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-聚-β氨基酯(MPEG-PLA-PAE)用作抗癌药物姜黄素的递送载体，所制备的聚合物胶束能有效负载药物(载药量达16％)形成纳米载药体系，其粒径为128.4nm，通过体外释放实验研究得知，在pH 7.4的PBS缓冲溶液中，72h时药物的累计释放量不超过40％，且药物释放速率较慢，而随着环境pH值的降低(pH6.5)，72h时药物的累计释放量达到了56％，而载药胶束体系在pH 5.5的PBS缓冲液中，24h药物的累计释放量即超过了40％，释放速率较快，存在一定程度的突释，72h时药物累计释放量超过了68％。实验证明，所制备的聚合物胶束载药体系具有明显的pH敏感性能，从而达到药物控缓释的效果。作者继续通过生物实验证明，所制备的姜黄素胶束载药体系能有效杀死人类乳腺癌(MCF-7)细胞，较小肿瘤体积，抑制肿瘤细胞的生长，相比较游离药物姜黄素，其小鼠正常组织器官受损伤较小，毒副作用较低。
发明内容
针对上述不足，本发明的目的在于提供一种胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物，与其制备方法，以及其应用于制备装载水难溶性药物胶束系统的方法，进一步提高药物的装载效率与释放速度。
本发明为达到上述目的所采用的技术方案是：
一种胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物，其特征在于，其分子式为Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol，分子结构式为：
其中，n＝68，x＝10～35，y＝10～35。
优选地，胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物数均分子量为24277～54068g/mol。
一种胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备具有pH响应性的大分子单体聚-β氨基酯(PAE)：采用迈克尔加成法，将1,4-丁二醇二丙烯酸酯(BD)和3-氨基-1-丙醇(AP)加入到茄形反应瓶中，在惰性气体保护和无水条件下，搅拌，80-100℃，反应8-48h，冷却、沉淀、干燥，得到具有pH响应性的双键封端大分子单体PAE；
(2)合成两亲性三嵌段中间产物：采用迈克尔加成法，将大分子单体H2N-PEG-NH2加入到茄形反应瓶中，加入无水氯仿，得到澄清溶液，在惰性气体保护和无水条件下，将步骤(1)所制得的PAE的无水氯仿溶液缓慢滴加入反应瓶中，搅拌，55-75℃，反应24-72h，冷却、浓缩、沉淀、干燥，得到具有pH响应性的三嵌段两亲性中间产物PAE-b-PEG-b-PAE；
其中，H2N-PEG-NH2的分子结构式为：
(3)制备胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物：将步骤(2)所制得的中间产物溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)中，依次加入已溶解于无水DMF的催化剂三乙胺(TEA)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，充分搅拌使其混合均匀，将胆固醇氯甲酸酯(Chol)的DMF溶液缓慢加入到反应瓶中，在室温、氮气保护下反应12-48h，将反应液离心除去副产物及杂质，取上层清液透析，除去胆固醇等未反应的原料，将产物C冷冻干燥，得到胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol；
其中，Chol的分子结构式为：
其中，所述步骤(1)中反应物的摩尔份数配方如下：
BD 10～11份
AP 9～10份。
所述步骤(2)中反应物的摩尔份数配方如下：
H2N-PEG-NH2 9～10份
PAE 10～11份。
所述步骤(3)中反应物的摩尔份数配方如下：
所述步骤(1)中的沉淀、干燥具体为：向溶液中加入8～12倍体积的0℃正己烷进行沉淀，将所得产物A置于25-45℃、30-40mbar下真空干燥24-72h；
所述步骤(2)中的沉淀、干燥具体为：向旋转蒸发浓缩的溶液中加入8-12倍体积的0℃正己烷进行沉淀，将所得产物B置于25-45℃、30-40mbar下真空干燥24-72h。
所述步骤(3)中的离心具体为：除去不可溶的三乙胺盐酸盐等杂质，离心条件优选为转速12000～16000rpm、时间1～3min。
所述步骤(3)中的透析具体为将离心所得的上清液置于透析袋中，在介质DMF中透析24-72h，继而将介质换成去离子水，继续透析24-72h。
一种将权利要求7所述胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物应用于制备装载水难溶性药物胶束系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将水难溶性药物溶于有机溶剂中过夜处理，得到水难溶性药物溶液的有机溶液，同时将胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物溶于同一种有机溶剂中，待胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物完全溶解，得到胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物的有机溶液；
(2)将胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物的有机溶液与水难溶性药物的有机溶液混合，室温下搅拌4～6h后，用去离子水透析24h，过滤、冷冻干燥，得到装载水难溶性药物胶束系统。
其中，所述水难溶性药物指在1L水中溶解度小于或等于1g的药物，所述有机溶剂为二甲基亚砜或二甲基甲酰胺中的一种。
本发明的有益效果为：
(1)胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物分子能在水溶液中自组装为结构稳定的纳米胶束，能有效包载水难溶性药物。
(2)胶束外层亲水性的PEG具有无毒、无免疫原性和无抗原性等优点，在增加胶束稳定性的同时，延长胶束在血液中的循环时间。
(3)疏水胆固醇内核能够增强对难溶药物的包载能力增强，包载效率提高。
(4)中间层的PAE在pH 7.4时表现为疏水性，可与胆固醇共同组成胶束的疏水内核，这不仅可以防止药物突释，同时可以增强胶束内核的稳定性；在肿瘤组织弱酸性(pH5.0～7.0)条件下，PAE嵌段中的叔胺基发生质子化作用而表现为亲水性，胶束开始出现一定程度的溶胀；载药胶束若进入具有更低pH的内涵体和溶酶体中，PAE将完全质子化，此时胶束溶胀程度变大，胶束开始出现聚集甚至解离行为，通过“质子-海绵效应”将所包载的药物释放到肿瘤细胞中。达到精确响应体内循环过程中环境pH值的变化，在维持药物递送体系结构稳定、延长体内循环时间、增大药物递送体系在病灶部位的累积量的同时，也能有效的提高细胞摄取量，增大药物的生物利用度，优化肿瘤的治疗效果。
(5)通过调节聚合物中各嵌段的比例，可有效调节其pH响应范围，使胶束不但能迅速、精确响应环境pH值的变化，而且能有效的缓解突释，控制药物释放，满足不同药物的释放要求。
下面结合具体实施例来详细描述本发明，但并不是对本发明的进一步限制。
附图说明
图1位本发明胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol的化学式；
图2为本发明实施例1中PAE的1H-NMR图，溶剂为d-CDCl3；
图3为本发明实施例1中Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol的1H-N MR图中11号特征峰所指质子信号在Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol中位置的示意图；
图4为本发明实施例1中Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol的1H-NMR图，溶剂为d-CDCl3；
图5为本发明实施例1中Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol在不同pH值条件下的临界胶束浓度测试曲线；
图6为本发明应用实施例1中Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol自组装胶束的粒径与pH的关系；
图7为本发明应用实施例1中Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol自组装胶束的zeta电位与pH的关系；
图8为本发明应用实施例1中Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol的pKb值的测试曲线；
图9为本发明应用实施例1中载阿霉素胶束的体外释放曲线；
图10为本发明应用实施例1中Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol空白胶束对HepG2细胞的毒性曲线图；
图11为本发明应用实施例1中Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol载药胶束以及有利阿霉素对HepG2细胞作用24h后的毒性曲线图；
图12为本发明应用实施例1中Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol载药胶束以及有利阿霉素对HepG2细胞作用48h后的毒性曲线图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达到预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对本发明的具体实施方式详细说明。
实施例1
本发明实施例提供胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备具有pH响应性的大分子单体聚-β氨基酯(PAE)：于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，冷冻-抽真空-通氮气三次，依次用注射器将BD(2.075mL，11mmol)和AP(0.761mL，10mmol)加入到反应瓶中，在搅拌的条件下，100℃，反应8h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应性嵌段PAE，其合成反应式为：
其后，利用GPC(凝胶渗透色谱)测定其分子量，测得产率为90％，Mn(数均分子量)＝2750，Mw/Mn(多分散指数)＝1.33，利用核磁检测器结构，测得特征吸收峰如图2所示，证明聚-β氨基酯(PAE)已成功合成。
(2)合成两亲性三嵌段中间产物PAE-b-PEG-b-PAE：同样采用迈克尔加成法，于50mL的干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通单气-抽真空三次，排除其中氧气。用注射器将步骤(1)所制得的PAE(3.03g，1.1mmol)的10mL无水氯仿溶液注入到反应瓶中，将5mL大分子单体H2N-PEG-NH2(3g，1mmol)的无水氯仿溶液缓慢滴加入反应瓶中，搅拌，65℃，反应48h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到两亲性三嵌段中间产物PAE-b-PEG-b-PAE，合成反应式为：
其后，利用GPC测定其分子量，测得产率为80％，Mn＝34080，Mw/Mn＝1.41。
合成胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol：将步骤(2)制备的中间产物PAE-b-PEG-b-PAE(3.4g，0.1mmol)加入到氮气氛围保护的装有搅拌子的100m茄型瓶中，加入15mL无水二氯甲烷，搅拌30min充分溶解，得到澄清透明溶液，将10mL溶有胆固醇甲酰氯Chol(0.45g，1mmol)的无水二氯甲烷溶液用注射器加入到反应瓶中，搅拌10min使其充分混合，然后将5mL溶有4-二甲氨基吡啶DMAP(12.2mg，0.1mmol)和三乙胺TEA(0.21mL，1.5mmol)的无水二氯甲烷溶液缓慢滴加入反应瓶中，混合液在0℃、氮气保护下反应3h，转为室温条件下，持续反应24h，为除去可溶的三乙胺盐酸盐等杂质，在转速14000rpm下离心两分钟，其后将离心所得的上清液置于透析袋中，在介质DMF中透析48h，继而将介质换成去离子水，继续透析48h。将透析所得清液冷冻干燥，得到胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物。合成反应式为：
其后，利用GPC测定其分子量，测得产率为77％，Mn＝42570，Mw/Mn＝1.45。并进行核磁鉴定器结构，测得特征吸收峰如图3、图4所示，1其中11号特征峰与5、6号特征峰周围升高的杂峰皆证明了胆固醇(cholesterol)已经成功接枝到两亲性三嵌段聚合物PAE-b-PEG-b-PAE上。
利用荧光探针法测试实施例1制备得到的胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol在不同pH条件下的临界胶束浓度。
(1)芘溶液的配置：用丙酮溶解芘(Sigma-Aldrich)，配置浓度为12×10-5M的芘溶液。
(2)样品溶液的配置：称取5mg的Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol溶于10mL丙酮中，快速将溶液加入到50mL不同pH(7.4、6.5、6.0、5.0)的PBS缓冲溶液中，搅拌24h以挥发掉丙酮，得到浓度为0.1mg/mL的聚合物母液，稀释成一系列浓度(浓度范围为0.0001～0.1mg/mL)。取20支10mL容量瓶，分别加入0.1mL步骤(1)配置的芘溶液，然后分别加入上述不同浓度的聚合物溶液定容，摇匀，得到样品溶液。样品溶液中芘的浓度为12×10- 7M。
(3)荧光光谱测试：以373nm为发射波长，在300～350nm扫描样品溶液的荧光激发光谱。取波长为337nm和335nm的强度比值(I337/I335)对聚合物浓度对数作图，如图5所示，曲线突变点所对应的横坐标即为lg(CMC)。测得实施例1制备得到的Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol在不同pH(7.4、6.5、6.0、5.0)值的PBS缓冲液中的临界胶束浓度分别为5.5mg/L、12.6mg/L、17.4mg/L和26.6mg/L。
实施例2
本发明实施例提供另一胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol的制备方法，其包括如下步骤：
(1)制备具有pH响应性的大分子单体聚-β氨基酯(PAE)：于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，冷冻-抽真空-通氮气三次，依次用注射器将BD(2.075mL，11mmol)和AP(0.685mL，9mmol)加入到反应瓶中，在搅拌的条件下，100℃，反应8h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应性嵌段PAE，产率为86％，Mn＝2220，Mw/Mn＝1.48。
(2)合成两亲性三嵌段中间产物PAE-b-PEG-b-PAE：同样采用迈克尔加成法，于50mL的干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通单气-抽真空三次，排除其中氧气。用注射器将步骤(1)所制得的PAE(2.44g，1.1mmol)的10mL无水氯仿溶液注入到反应瓶中，将5mL大分子单体H2N-PEG-NH2(2.7g，0.9mmol)的无水氯仿溶液缓慢滴加入反应瓶中，搅拌，65℃，反应48h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到两亲性三嵌段中间产物PAE-b-PEG-b-PAE，产率为82％，Mn＝46790，Mw/Mn＝1.44。
(3)合成胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol：将步骤(2)制备的中间产物PAE-b-PEG-b-PAE(4.679g，0.1mmol)加入到氮气氛围保护的装有搅拌子的100m茄型瓶中，加入15mL无水二氯甲烷，搅拌30min充分溶解，得到澄清透明溶液，将10mL溶有胆固醇甲酰氯Chol(0.225g，0.5mmol)的无水二氯甲烷溶液用注射器加入到反应瓶中，搅拌10min使其充分混合，然后将5mL溶有4-二甲氨基吡啶DMAP(122mg，1mmol)和三乙胺TEA(0.07mL，0.5mmol)的无水二氯甲烷溶液缓慢滴加入反应瓶中，混合液在0℃、氮气保护下反应3h，转为室温条件下，持续反应24h，为除去可溶的三乙胺盐酸盐等杂质，在转速14000rpm下离心两分钟，其后将离心所得的上清液置于透析袋中，在介质DMF中透析48h，继而将介质换成去离子水，继续透析48h。将透析所得清液冷冻干燥，得到胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物，产率为77％，Mn＝54068，Mw/Mn＝1.57。
实施例3
本发明实施例提供另一胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol的制备方法，其包括如下步骤：
(1)制备具有pH响应性的大分子单体聚-β氨基酯(PAE)：于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，冷冻-抽真空-通氮气三次，依次用注射器将BD(1.887mL，10mmol)和AP(0.685mL，9mmol)加入到反应瓶中，在搅拌的条件下，100℃，反应8h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应性嵌段PAE，产率为86％，Mn＝3020，Mw/Mn＝1.32。
(2)合成两亲性三嵌段中间产物PAE-b-PEG-b-PAE：同样采用迈克尔加成法，于50mL的干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通单气-抽真空三次，排除其中氧气。用注射器将步骤(1)所制得的PAE(3.02g，1mmol)的10mL无水氯仿溶液注入到反应瓶中，将5mL大分子单体H2N-PEG-NH2(2.7g，0.9mmol)的无水氯仿溶液缓慢滴加入反应瓶中，搅拌，65℃，反应48h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到两亲性三嵌段中间产物PAE-b-PEG-b-PAE，产率为82％，Mn＝27661，Mw/Mn＝1.43。
(3)合成胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol：将步骤(2)制备的中间产物PAE-b-PEG-b-PAE(2.766g，0.1mmol)加入到氮气氛围保护的装有搅拌子的100m茄型瓶中，加入15mL无水二氯甲烷，搅拌30min充分溶解，得到澄清透明溶液，将10mL溶有胆固醇甲酰氯Chol(0.045g，0.1mmol)的无水二氯甲烷溶液用注射器加入到反应瓶中，搅拌10min使其充分混合，然后将5mL溶有4-二甲氨基吡啶DMAP(61mg，0.5mmol)和三乙胺TEA(0.14mL，1mmol)的无水二氯甲烷溶液缓慢滴加入反应瓶中，混合液在0℃、氮气保护下反应3h，转为室温条件下，持续反应24h，为除去可溶的三乙胺盐酸盐等杂质，在转速14000rpm下离心两分钟，其后将离心所得的上清液置于透析袋中，在介质DMF中透析48h，继而将介质换成去离子水，继续透析48h。将透析所得清液冷冻干燥，得到胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物，产率为77％，Mn＝30355，Mw/Mn＝1.46。
实施例4
本发明实施例提供另一胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol的制备方法，其包括如下步骤：
(1)制备具有pH响应性的大分子单体聚-β氨基酯(PAE)：于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，冷冻-抽真空-通氮气三次，依次用注射器将BD(1.887mL，10mmol)和AP(0.761mL，10mmol)加入到反应瓶中，在搅拌的条件下，100℃，反应8h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到pH响应性嵌段PAE，产率为85％，Mn＝2538，Mw/Mn＝1.27。
(2)合成两亲性三嵌段中间产物PAE-b-PEG-b-PAE：同样采用迈克尔加成法，于50mL的干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通单气-抽真空三次，排除其中氧气。用注射器将步骤(1)所制得的PAE(2.538g，1mmol)的10mL无水氯仿溶液注入到反应瓶中，将5mL大分子单体H2N-PEG-NH2(3g，1mmol)的无水氯仿溶液缓慢滴加入反应瓶中，搅拌，65℃，反应48h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到十倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在35℃、35mbar下真空干燥48h，得到两亲性三嵌段中间产物PAE-b-PEG-b-PAE，产率为84％，Mn＝22430，Mw/Mn＝1.30。
(3)合成胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol：将步骤(2)制备的中间产物PAE-b-PEG-b-PAE(2.243g，0.1mmol)加入到氮气氛围保护的装有搅拌子的100m茄型瓶中，加入15mL无水二氯甲烷，搅拌30min充分溶解，得到澄清透明溶液，将10mL溶有胆固醇甲酰氯Chol(0.225g，0.5mmol)的无水二氯甲烷溶液用注射器加入到反应瓶中，搅拌10min使其充分混合，然后将5mL溶有4-二甲氨基吡啶DMAP(12.2mg，0.1mmol)和三乙胺TEA(0.07mL，0.5mmol)的无水二氯甲烷溶液缓慢滴加入反应瓶中，混合液在0℃、氮气保护下反应3h，转为室温条件下，持续反应24h，为除去可溶的三乙胺盐酸盐等杂质，在转速14000rpm下离心两分钟，其后将离心所得的上清液置于透析袋中，在介质DMF中透析48h，继而将介质换成去离子水，继续透析48h。将透析所得清液冷冻干燥，得到胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物，产率为77％，Mn＝24277，Mw/Mn＝1.48。
实施例5
本发明实施例提供另一胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol的制备方法，其包括如下步骤：
(1)制备具有pH响应性的大分子单体聚-β氨基酯(PAE)：于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，冷冻-抽真空-通氮气三次，依次用注射器将BD(2.075mL，11mmol)和AP(0.685mL，9mmol)加入到反应瓶中，在搅拌的条件下，90℃，反应24h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到8倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在45℃、30mbar下真空干燥24h，得到pH响应性嵌段PAE。
(2)合成两亲性三嵌段中间产物PAE-b-PEG-b-PAE：同样采用迈克尔加成法，于50mL的干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通单气-抽真空三次，排除其中氧气。用注射器将步骤(1)所制得的PAE(2.44g，1.1mmol)的10mL无水氯仿溶液注入到反应瓶中，将5mL大分子单体H2N-PEG-NH2(2.7g，0.9mmol)的无水氯仿溶液缓慢滴加入反应瓶中，搅拌，55℃，反应72h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到8倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在45℃、30mbar下真空干燥24h，得到两亲性三嵌段中间产物PAE-b-PEG-b-PAE。
(3)合成胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol：将步骤(2)制备的中间产物PAE-b-PEG-b-PAE(11.698g，0.25mmol)加入到氮气氛围保护的装有搅拌子的100m茄型瓶中，加入15mL无水二氯甲烷，搅拌30min充分溶解，得到澄清透明溶液，将10mL溶有胆固醇甲酰氯Chol(1.80g，4mmol)的无水二氯甲烷溶液用注射器加入到反应瓶中，搅拌10min使其充分混合，然后将5mL溶有4-二甲氨基吡啶DMAP(183mg，1.5mmol)和三乙胺TEA(0.56mL，4mmol)的无水二氯甲烷溶液缓慢滴加入反应瓶中，混合液在0℃、氮气保护下反应3h，转为室温条件下，持续反应12h，为除去可溶的三乙胺盐酸盐等杂质，在转速16000rpm下离心1分钟，其后将离心所得的上清液置于透析袋中，在介质DMF中透析24h，继而将介质换成去离子水，继续透析24h。将透析所得清液冷冻干燥，得到胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物。
实施例6
本发明实施例提供另一胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol的制备方法，其包括如下步骤：
(1)制备具有pH响应性的大分子单体聚-β氨基酯(PAE)：于50mL干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，冷冻-抽真空-通氮气三次，依次用注射器将BD(1.887mL，10mmol)和AP(0.761mL，10mmol)加入到反应瓶中，在搅拌的条件下，80℃，反应48h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到12倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在25℃、40mbar下真空干燥72h，得到pH响应性嵌段PAE。
(2)合成两亲性三嵌段中间产物PAE-b-PEG-b-PAE：同样采用迈克尔加成法，于50mL的干燥茄型瓶中装入搅拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通单气-抽真空三次，排除其中氧气。用注射器将步骤(1)所制得的PAE(2.538g，1mmol)的10mL无水氯仿溶液注入到反应瓶中，将5mL大分子单体H2N-PEG-NH2(3g，1mmol)的无水氯仿溶液缓慢滴加入反应瓶中，搅拌，75℃，反应24h，将反应液冷却至室温后缓慢加入到12倍量(体积比)的冷正己烷中沉淀，沉淀在25℃、40mbar下真空干燥72h，得到两亲性三嵌段中间产物PAE-b-PEG-b-PAE。
(3)合成胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PE G-b-PAE-g-Chol：将步骤(2)制备的中间产物PAE-b-PEG-b-PAE(11.215g，0.5mmol)加入到氮气氛围保护的装有搅拌子的100mL茄型瓶中，加入15mL无水二氯甲烷，搅拌30min充分溶解，得到澄清透明溶液，将10mL溶有胆固醇甲酰氯Chol(3.375g，7.5mmol)的无水二氯甲烷溶液用注射器加入到反应瓶中，搅拌10min使其充分混合，然后将5mL溶有4-二甲氨基吡啶DMAP(18.3mg，0.15mmol)和三乙胺TEA(1.05mL，7.5mmol)的无水二氯甲烷溶液缓慢滴加入反应瓶中，混合液在0℃、氮气保护下反应3h，转为室温条件下，持续反应48h，为除去可溶的三乙胺盐酸盐等杂质，在转速12000pm下离心3分钟，其后将离心所得的上清液置于透析袋中，在介质DMF中透析72h，继而将介质换成去离子水，继续透析72h。将透析所得清液冷冻干燥，得到胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物。
应用实施例1
本发明实施例提供前述胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol用于制备装载水难溶性药物胶束系统的方法，及空白胶束的制备方法，具体为：
采用透析法制备载阿霉素(DOX)的聚合物胶束，具体方法如下：称取10mg DOX·HCl溶于20mL DMSO中，加入2倍摩尔当量的TEA，搅拌过夜得到DOX碱。取40mg实施例1制备得到的Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol溶于20mL DMSO中，待Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol完全溶解后，将Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol溶液加入到之前已制备好的DOX溶液中，继续搅拌6h后，转入透析袋进行透析，每2h更换一次去离子水，12h后每6h更换一次，共透析24h。透析完成后，将透析液用0.45μm过滤膜进行过滤，过滤液冷冻干燥后，得到红色粉末状固体即为DOX载药胶束。
空白胶束的制备方法：称取10mg DOX·HCl溶于20mL DMSO中，加入2倍摩尔当量的TEA，搅拌过夜得到DOX碱。继续搅拌6h后，转入透析袋进行透析，每2h更换一次去离子水，12h后每6h更换一次，共透析24h。透析完成后，将透析液用0.45μm过滤膜进行过滤，过滤液冷冻干燥后，得到空白胶束。
本发明提供的胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物载药、制备方法，及其制备的装载水难溶性药物胶束系统，其性能均显著优于现有产品或工艺。
采用动态光散射法(DLS)测定空白胶束和载药胶束的粒径、分布和zeta电位。空白胶束的粒径Dh为205.4nm，PDI为0.33，zeta电位为12.7mV。载药胶束的粒径Dh为217.2nm，PDI为0.35，zeta电位为14.1mV。
分别取20mg应用实施例1中制备的聚合物空白胶束溶于pH 9.2、8.1、7.4、7.0、6.8、6.5、6.0、5.5和5.0的PBS缓冲溶液中，采用动态光散射法(DLS)测定空白胶束在不同pH值条件下的粒径、分布和zeta电位，如图6和图7所示。由图可知，随着pH值的降低(9.2～7.4)，聚合物胶束粒径和zeta电位变化较小，颗粒体系较为稳定，随着pH的继续降低(7.4～5.0)，胶束大小和zeta电位快速增大，主要是由于pH敏感嵌段PAE的质子化作用，使其由疏水性嵌段逐渐变为亲水性嵌段，胶束颗粒溶胀，粒径和zeta电位增大。
采用电位滴定法确定实施例1聚合物中PAE嵌段的pKb值，具体步骤如下：50mg应用实施例1制备的Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol充分溶解于20mL丙酮中，在快速搅拌下快速加入到50mL去离子水中，室温下搅拌24h以挥发掉丙酮，得到最终浓度为1mg/mL的聚合物胶束溶液。用NaOH或HCl溶液(0.1M)调节胶束溶液的pH值，搅拌平衡一段时间至pH稳定，读取各pH值，如图8所示，得到pKb值的测试曲线，计算得出实施例1聚合物中PAE嵌段的pKb值为6.6左右。
分别称取15mg应用实施例1中制备的Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Ch ol载药胶束分散于5mL PBS缓冲液中，缓冲液pH值分别为7.4、6.5、6.0和5.0。将上述溶液置于透析袋中，转入45mL相同pH值的缓冲液中，置于药物溶出仪，在37℃，110rpm转速下进行体外释放。定时取样4mL进行紫外分析，并同时补加4mL新鲜缓冲液。用紫外分光光度法测定不同时间释放液中DOX浓度，绘制体外释放曲线，如图9所示。
由图9可知，载药胶束在正常组织环境(pH 7.4)下，DOX的释放速率非常慢，24h的累积释放量不超过30％，随后的释放速率基本趋于平稳，120h累计释放量低于40％。而在肿瘤组织的微酸性(pH 6.5和6.0)条件下，DOX的释放速率加快，24h的累积释放量超过50％以上，120h累计释放量超过60％。随着pH值的继续降低(pH 5.0)，DOX的释放速率明显加快，24h的累积释放量超过70％，120h累计释放量超过80％。说明随着pH值的降低，药物从载药胶束中释放的速率和累计释放量明显加快。
利用应用实施例1制备得到的Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol空白胶束和载药胶束进行细胞毒性评价。将HEPG2细胞(购买于ATCC)按1×104的密度平铺在96孔板上，加入200μL培养液，培养24h。将一定浓度的游离阿霉素(DOX)，空白胶束和载药胶束添加进入孔板中，更新培养介质。每个浓度平行重复3个。将孔板放入卵化器中，5％CO2和37℃，分别维持24h和48h。用180μL新鲜培养液和20μLMTT溶液替换孔板中介质，继续卵化4h，用200μLDMSO替换孔板介质。将孔板放在37℃摇床中振荡15min，然后利用酶标仪测定490nm出每个孔的吸光度A，计算细胞存活率，评价其细胞毒性。
图10是空白Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol的细胞毒性图。由图可知，随着聚合物浓度的增大，细胞存活率仍维持在较高水平，当聚合物浓度为400μg/mL时，细胞存活率仍在90％以上，可见此pH响应两亲性聚合物材料对细胞的毒性较低，说明材料本身几乎不具有毒副作用。图11和图12分别是游离阿霉素和聚合物载药胶束在24h和48h后的细胞毒性图。由图可知，随着时间和载药胶束浓度的增大，细胞成活率均呈现明显降低的趋势，特别是在48h、载药胶束浓度为2mg/mL时，细胞的成活率接近50％。
本发明的重点主要在于，使用该材料所制备的载药胶束外层亲水性的PEG具有无毒、无免疫原性和无抗原性等优点，在增加胶束稳定性的同时，延长胶束在血液中的循环时间；疏水胆固醇内核能够增强对难溶药物的包载性能；中间层的PAE在pH 7.4时表现为疏水性，可与胆固醇共同组成胶束的疏水内核，这不仅可以防止药物突释，同时可以增强胶束内核的稳定性；在肿瘤组织弱酸性(pH 5.0～7.0)条件下，PAE嵌段中的叔胺基发生质子化作用而表现为亲水性，胶束开始出现一定程度的溶胀；载药胶束若进入具有更低pH的内涵体和溶酶体中，PAE将完全质子化，此时胶束溶胀程度变大，胶束开始出现聚集甚至解离行为，通过“质子-海绵效应”将所包载的药物释放到肿瘤细胞中。通过调节聚合物中各嵌段的比例，可以调控药物的释放速率，满足不同药物的释放要求。其与以往的pH响应多嵌段两亲性聚合物相比，其载药效率与药物释放速率得到了进一步地提高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备具有pH响应性的大分子单体聚-β氨基酯(PAE)：采用迈克尔加成法，将1,4-丁二醇二丙烯酸酯(BD)和3-氨基-1-丙醇(AP)加入到茄形反应瓶中，在惰性气体保护和无水条件下，搅拌，80-100℃，反应8-48h，冷却、沉淀、干燥，得到具有pH响应性的双键封端大分子单体PAE；
(2)合成两亲性三嵌段中间产物：采用迈克尔加成法，将大分子单体H2N-PEG-NH2加入到茄形反应瓶中，加入无水氯仿，得到澄清溶液，在惰性气体保护和无水条件下，将步骤(1)所制得的PAE的无水氯仿溶液缓慢滴加入反应瓶中，搅拌，55-75℃，反应24-72h，冷却、浓缩、沉淀、干燥，得到具有pH响应性的三嵌段两亲性中间产物PAE-b-PEG-b-PAE；
其中，H2N-PEG-NH2的分子结构式为：
(3)制备胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物：将步骤(2)所制得的中间产物溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)中，依次加入已溶解于无水DMF的催化剂三乙胺(TEA)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，充分搅拌使其混合均匀，将胆固醇氯甲酸酯(Chol)的DMF溶液缓慢加入到反应瓶中，在室温、氮气保护下反应12-48h，将反应液离心除去副产物及杂质，取上层清液透析，除去胆固醇等未反应的原料，将产物C冷冻干燥，得到胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol；
其中，Chol的分子结构式为：
2.如权利要求1所述的胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中反应物的摩尔份数配方如下：
BD 10～11份
AP 9～10份。
3.如权利要求1所述的胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中反应物的摩尔份数配方如下：
H2N-PEG-NH2 9～10份
PAE 10～11份。
4.如权利要求1所述的胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中反应物的摩尔份数配方如下：
5.如权利要求1所述的胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的沉淀、干燥具体为：向溶液中加入8～12倍体积的0℃正己烷进行沉淀，将所得产物A置于25-45℃、30-40mbar下真空干燥24-72h；所述步骤(2)中的沉淀、干燥具体为：向旋转蒸发浓缩的溶液中加入10倍体积的0℃正己烷进行沉淀，将所得产物B置于25-45℃、30-40mbar下真空干燥24～72h。
6.如权利要求1所述的胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的离心具体为：除去不可溶的三乙胺盐酸盐等杂质，离心条件优选为转速12000～16000rpm、时间1～3min；所述步骤(3)中的透析具体为将离心所得的上清液置于透析袋中，在介质DMF中透析24～72h，继而将介质换成去离子水，继续透析24～72h。
7.一种实施权利要求1-6任一项所述方法制备出的胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物，其特征在于，其分子式为Chol-g-PAE-b-PEG-b-PAE-g-Chol，分子结构式为：
其中，n＝68，x＝10～35，y＝10～35。
8.如权利要求7所述的胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性共聚物，其特征在于，其数均分子量为24277～54068g/mol。
9.一种权利要求7所述胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物的应用，其特征在于，其用于制备装载水难溶性药物胶束系统，包括以下步骤：
(1)将水难溶性药物溶于有机溶剂中过夜处理，得到水难溶性药物溶液的有机溶液，同时将胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物溶于同一种有机溶剂中，待胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物完全溶解，得到胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物的有机溶液；
(2)将胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物的有机溶液与水难溶性药物的有机溶液混合，室温下搅拌4～6h后，用去离子水透析24h，过滤、冷冻干燥，得到装载水难溶性药物胶束系统。
10.如权利要求9所述的胆固醇接枝的pH响应三嵌段两亲性聚合物的应用其特征在于，所述水难溶性药物指在1L水中溶解度小于或等于1g的药物，所述有机溶剂为二甲基亚砜或二甲基甲酰胺中的一种。
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