CN110812494A - 叶酸修饰嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种带有叶酸修饰并以聚乙二醇‑b‑聚丙烯酸二乙氨基乙酯二嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒，它是聚乙二醇‑b‑聚丙烯酸二乙氨基乙酯二嵌段共聚物(PEG‑PDEAEA)与带有氨基的叶酸分子(FA‑NH2)这两个功能单体通过酰胺化反应组装成外壳聚合物(PEG‑PDEAEA‑FA)，再与四氯金酸(HAuCl4)混合后通过硼氢化钠(NaBH4)还原法合成的叶酸修饰嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP‑FA)。本发明提供了所述金纳米颗粒的制备方法以及金纳米颗粒用于制备靶向肿瘤细胞并杀伤肿瘤的药物的用途。

Description

叶酸修饰嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及用于肿瘤治疗的金纳米颗粒，特别涉及一种带有叶酸修饰并以聚乙二醇-b-聚丙烯酸二乙氨基乙酯二嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒，以及该金纳米颗粒的制备方法与用途。
背景技术
近年来医学纳米材料这一新兴领域快速发展，使用纳米材料作为抗癌药物载体，已被广泛的应用于药物输送、个性化药物研发等诸多方面(Shi et al.,2017)。其中，金纳米颗粒(AuNPs)作为研究最为热门的纳米材料之一，通过对其进行表面功能化的修饰，可以将不同的聚合物、蛋白质、多肽、小分子物质、DNA通过静电作用、共价或非共价结合等反应装载至其表面，而发挥独特的抗肿瘤作用(Biju,2014；Kumar et al.,2013；Nicol et al.,2015)。
然而，机体pH的变化及血清蛋白对AuNPs的吸附作用，将导致AuNPs发生聚集反应而被代谢到体外，因此寻找有效维持AuNPs稳定性的聚合材料显得尤为重要；另一方面，在构建稳定的金纳米颗粒材料后，如何介导其有效地靶向运送至肿瘤组织而发挥功能，亦成为了目前纳米材料抗肿瘤领域的另一大挑战。已有文献报道，利用新型嵌段共聚物可提高AuNPs的稳定和官能团功能化的发挥(Nicol et al.,2015)。同时，叶酸分子(FA)可成为较为理想的引导分子，介导聚合物-金纳米颗粒靶向运送到肿瘤组织，通过与肿瘤细胞表面的FR结合，促进肿瘤细胞对其的内吞作用而发挥金纳米颗粒的功能(Keyvan et al.,2018；Samadian et al.,2016)。但在新型金纳米颗粒构建及应用方面，目前并没有关于以叶酸分子(FA)修饰并采用聚乙二醇-b-聚丙烯酸二乙氨基乙酯二嵌段共聚物(PEG-PDEAEA)包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)的开发及其抗肿瘤的相关体内外研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的可用于肿瘤治疗的金纳米颗粒，是应用叶酸表面功能化修饰并以二亲性二嵌段共聚物包裹的新型金纳米颗粒，它能更加稳定、更加有效的靶向肿瘤和杀伤肿瘤。
本发明所述的叶酸修饰嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒是聚乙二醇-b-聚丙烯酸二乙氨基乙酯二嵌段共聚物(PEG-PDEAEA)与带有氨基的叶酸分子(FA-NH2)这两个功能单体通过酰胺化反应组装成外壳聚合物(PEG-PDEAEA-FA)，再与四氯金酸(HAuCl4)混合后通过硼氢化钠(NaBH4)还原法合成的叶酸修饰嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)。
本发明还提供了所述的叶酸修饰嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒的制备方法。
本发明所述的叶酸修饰嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
步骤A：聚乙二醇(PEG)的合成：将PEG-丙烯酸酯、偶氮二异丁腈(AIBN)和RAFT-COOH加入圆底烧瓶中，用橡胶隔膜帽密封烧瓶并通过氮气脱气20分钟，然后在60℃下搅拌20小时。通过在冷乙醚中终止反应并沉淀，最后在真空烘箱中干燥，得到含有12个重复单元分子量达5760Da的黄色油状PEG材料；
步骤B：PEG-PDEAEA两亲性嵌段共聚物的合成：在锥形瓶中将PEG溶解进2-(二乙氨基)丙烯酸乙酯(DEAEA)单体中，再加入AIBN并用橡胶隔膜帽封闭。通过氮气脱气20分钟，然后在60℃下搅拌24小时，通过在冷乙醚中终止反应并沉淀，最后在真空烘箱中干燥，获得粘液状的黄色油性物PEG-PDEAEA两亲性嵌段共聚物；
步骤C：FA-NH2的合成：将叶酸、二环己基碳二亚胺(DCC)和二甲基氨基吡啶(DMAP)分别加入封闭的圆底烧瓶并混合。然后将无水二甲基亚砜(DMSO)和无水吡啶加入烧瓶中并充分混合，再向烧瓶中加入乙二胺(DMSO:无水吡啶:乙二胺＝96:54:5)，溶液立即变浑浊。室温搅拌过夜，得到澄清的黄色溶液。将溶液以8000rpm离心，离心后用乙醚获得沉淀。并用乙醚洗3遍后，用四氢呋喃洗涤3遍。在真空烘箱中干燥最终获得FA-NH2黄色粉末；
步骤D：PEG-PDEAEA-FA的合成：将PEG-PDEAEA、FA-NH2、DCC和、DMAP加入密封的单颈圆瓶烧瓶中。将烧瓶用氮气脱气20分钟，然后在氮气条件下将无水DMSO和无水吡啶加入烧瓶中。将混合物在室温下搅拌反应3天后，在减压条件下除去吡啶，产物从石油醚中沉淀并用石油醚洗涤多次。利用四氢呋喃将产物重新溶解并用8000rpm离心以除去未反应的FA-NH2。通过旋转蒸发剩余的溶剂，并在真空环境下收集PEG-PDEAEA-FA黄色粘稠固体；
步骤E：AuNPP-FA的合成：预先制备50mM(20mg/mL)HAuCl4的储存溶液(在氮气保护下处理干燥的HAuCl4)。将NaBH4溶解在NaOH溶液(16.7mM)中制备50mM NaBH4/NaOH溶液，并且在制备后30分钟内使用。在常规的反应中，在离心管中将PEG-PDEAEA-FA溶于去离子水中形成混浊溶液，然后加入HAuCl4储备溶液。混合均匀后，将NaBH4/NaOH溶液倒入管中，立即振荡3分钟。溶液的颜色从黄色变为红色，表明AuNPP-FA的形成。将制备的AuNPP/AuNPP-FA溶液用透析管(MWCO＝3500Da)在4℃下透析12小时，并且每3小时更换一次水。然后将样品冻干，得到最终紫色固体产物。
根据本发明所述的金纳米颗粒的制备方法的进一步特征，所述的步骤A中，所加入的PEG-丙烯酸酯、偶氮二异丁腈(AIBN)和RAFT-COOH的比例为6:0.0342:0.375。
根据本发明所述的金纳米颗粒的制备方法的进一步特征，所述的步骤B中，所加入的PEG、DEAEA和AIBN的比例为5:50:0.082。
根据本发明所述的金纳米颗粒的制备方法的进一步特征，所述的步骤C中，所加入的叶酸、DCC和DMAP的比例为24.15:40:8。
根据本发明所述的金纳米颗粒的制备方法的进一步特征，所述的步骤D中，所加入的PEG-PDEAEA、FA-NH2、DCC和DMAP的比例为250:25:15:3。
根据本发明所述的金纳米颗粒的制备方法的进一步特征，所述的步骤D中，所加入的无水DMSO与无水吡啶的比例为2:1。
根据本发明所述的金纳米颗粒的制备方法的进一步特征，所述的步骤E中，NaBH4与NaOH溶液的质量体积比为189mg:10mL。
根据本发明所述的金纳米颗粒的制备方法的进一步特征，所述的步骤E中，PEG-PDEAEA-FA、去离子水和HAuCl4储备溶液的质量体积比为100mg:6mL:1mL。
本发明还提供了所述的叶酸修饰嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒的用途，具体是用于制备靶向肿瘤细胞并杀伤肿瘤的药物的用途。
本发明所述的叶酸修饰的嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)作为一种可注射的纳米材料，具有良好的稳定性。在体内外实验中证实能够有效地靶向肿瘤细胞并产生杀伤肿瘤的作用。通过小鼠模型的研究，进一步揭示本发明AuNPP-FA通过影响肿瘤细胞血管内渗过程抑制肿瘤转移。同时，本发明利用病理切片、血生化等指标检测证实AuNPP-FA在荷瘤小鼠中的应用具有安全性，未发现AuNPP-FA对小鼠重要脏器产生明显毒副作用。因此，本发明所构建的叶酸修饰的嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)在提高肿瘤靶向性、杀伤肿瘤细胞的同时，克服了全身给药带来的不良反应，在肿瘤治疗中展现出良好的应用前景。
本发明所述的AuNPP-FA经实验证实在发挥抗肿瘤过程中，可促进肿瘤血管正常化。通过免疫组化、免疫荧光、动物实验进一步发现AuNPP-FA诱导肿瘤血管正常化后，能促进T淋巴细胞的浸润，提高PD-L1抑制剂联合用药的抗肿瘤治疗疗效。
综上所述，本发明展现了叶酸修饰的嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)作为一种可注射的纳米材料用于抗肿瘤治疗的良好运用前景，在本身有效发挥抗肿瘤治疗的同时，可提高免疫治疗的疗效。
附图说明
图1是叶酸修饰的嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)的制备流程示意图。图1中，(a)PEG合成示意图；(b)PEG-PDEADE合成示意图；(c)FA-NH2合成示意图；(d)PEG-PDEAEA-FA合成示意图；(e)AuNPP-FA合成示意图。
图2是核磁共振氢谱检测(a)PEG(未纯化)，(b)PEG-PDEAEA(未纯化)，(c)PEG-PDEAEA(纯化后)及(d)PEG-PDEAEA-FA；傅氏转换红外线光谱检测(e)PEG、PEG-PDEAEA、PEG-PDEAEA-FA及(f)PEG-PDEAEA和PEG-PDEAEA-FA。如图2所示，在酰胺I和酰胺II带区域的红外线光谱证实FA通过酰胺化偶联。
图3是AuNPP-FA的透射电镜(TEM)检测结果图。图3中，(a)100nm，(b)50nm，(c)20nm及(d)10nm；(e)纳米金颗粒大小统计图。
图4是AuNPP-FA的肿瘤靶向性检测结果图。图4中，(a)BGC823细胞在AuNPP、AuNPP-FA或PBS处理后的TEM图像。黄色圆圈表示细胞质中含有AuNPP或AuNPP-FA的囊泡；(b)流式检测4T1、BGC823细胞对各类材料的摄取情况：PBS，AuNPP，AuNPP-FA，AuNPP-Cy3，AuNPP-FA-Cy3；(c)4T1-Luc乳腺原位癌小鼠腹腔注射Cy7标记的AuNPP、AuNPP-FA后，进行活体成像及不同时间点(3小时，6小时，24小时)AuNPP、AuNPP-FA在体内的荧光成像，分析不同时间点AuNPP、AuNPP-FA荧光强度的差异；(d)4T1-Luc乳腺原位癌小鼠腹腔注射Cy7标记的AuNPP、AuNPP-FA，3小时后取出主要脏器和肿瘤进行生物和离体荧光成像，分析肿瘤组织荧光强度AuNPP、AuNPP-FA的差异。
图5显示AuNPP-FA在体内外对肿瘤的影响。图5中，(a)克隆形成实验检测AuNPP-FA在体外对肿瘤细胞4T1和BGC823增殖的影响；荷瘤小鼠实验检测AuNPP-FA在体内对肿瘤生长和转移的影响(b)活体成像，(c)肿瘤重量，(d)肿瘤生长曲线，(e)肺转移数量及(f)肺转移的HE染色图像。
图6是AuNPP-FA的生物安全性实验结果。图6中，(a)荷瘤小鼠AuNPP-FA治疗14天后，小鼠心、肝、脾、肺、肾和小肠影响的HE染色图像；健康小鼠(Healthy)和4T1荷瘤小鼠，在PBS或AuNPP-FA处理后，(b)体重变化曲线及肝功能(c)丙氨酸转氨酶，(d)谷氨酸转氨酶，(e)总胆红素。
图7显示AuNPP-FA促进肿瘤血管正常化。其中，形态方面：(a)扫描电镜(SEM)检测，(b)小鼠肿瘤组织CD31+α-SMA免疫荧光双染，分析α-SMA阳性血管百分比差异；功能方面：肿瘤血管灌注(凝集素阳性血管百分比，图c)，渗透(葡聚糖阳性面积，图d)及组织缺氧情况检测(PIMO阳性区域，图e)。
图8显示AuNPP-FA与PD-L1联用的疗效。图8中，(a)免疫荧光检测AuNPP-FA处理后组织内T细胞(CD3CD8双阳性细胞)浸润的密度；AuNPP-FA与PD-L1抑制剂联合使用后，(b)肿瘤体积变化图，(c)肿瘤重量分析，(d)肺转移面积。
具体实施方式
实施例一：叶酸修饰的嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)的制备
本发明所述的叶酸修饰的嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)的制备流程图如图1所示。
首先通过合成PEG-PDEAEA、FA-NH2两个功能单体，通过酰胺化反应组装PEG-PDEAEA-FA，与四氯金酸(HAuCl4)混合后，经NaBH4将HAuCl4还原并在溶液中自组装成叶酸-嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒AuNPP-FA。类似的方法，我们还制备了AuNPP(不带有FA仅有嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒)。
表1：材料与仪器
名称 厂家
聚乙二醇甲醚丙烯酸酯低聚物 Sigma Aldrich(美国)
2-(二乙氨基)丙烯酸乙酯 Sigma Aldrich(美国)
叶酸 Sigma Aldrich(美国)
乙二胺 EMD Millipore(美国)
四氯金酸(III)水合物 Alfa Aesar(美国)
乙醚 Anachemia(加拿大)
石油醚 Anachemia(加拿大)
硼氢化钠 Sigma Aldrich(美国)
偶氮二异丁腈 Sigma Aldrich(美国)
二甲基亚砜(DMSO) Sigma Aldrich(美国)
Cy3-NH<sub>2</sub>/Cy7-NH<sub>2</sub> 西安昊然生物(中国)
戊二醛 Servicebio(中国)
乙醇、丙酮 国药集团化学试剂有限公司
SPI-Pon 812环氧树脂 SPI(中国)
透析袋(MWCO＝3500Da) Parmacia(瑞典)
真空烘箱(SZG-A) 中国
紫外可见分光光度计(Ultrospec 4300pro) 美国
核磁共振光谱仪(Avance 300spectrometer) 德国
动态光散射仪(Malvern Instruments) 英国
其余涉及纳米材料合成和实验所需化学物品，如无特殊说明，均购置于SigmaAldrich，并无需任何提纯，可直接使用。各类细胞培养处理所需耗材(培养皿、培养瓶、多孔板等)均购置于Thermo Scientific(中国)。
实验方法
(1)聚乙二醇(PEG)的合成
利用聚乙二醇甲醚丙烯酸酯低聚物作为反应单体，通过和RAFT-COOH引发RAFT聚合反应合成聚(乙二醇)侧链聚合物。即将PEG-丙烯酸酯、偶氮二异丁腈(Azobisisobutyronitrile,AIBN)和RAFT-COOH按比例(6:0.0342:0.375)加入圆底烧瓶中，用橡胶隔膜帽密封烧瓶并通过氮气脱气20分钟，然后在60℃下搅拌20小时。通过在冷乙醚中终止反应并沉淀，最后在真空烘箱中干燥，得到含有12个重复单元分子量达5760Da的黄色油状PEG材料。如图1(a)所示。
(2)PEG-PDEAEA两亲性嵌段共聚物的合成
利用上一步骤合成的PEG，促发PEG和2-(二乙氨基)丙烯酸乙酯(2-(diethylamino)ethyl acrylate,DEAEA)的聚合反应，从而合成PEG-PDEAEA二嵌段共聚物。具体过程为：在锥形瓶中将PEG溶解进DEAEA单体中，再加入AIBN并用橡胶隔膜帽封闭。PEG、DEAEA和AIBN的比例为：5:50:0.082。通过氮气脱气20分钟，然后在60℃下搅拌24小时，通过在冷乙醚中终止反应并沉淀，最后在真空烘箱中干燥，获得粘液状的黄色油性物PEG-PDEAEA两亲性嵌段共聚物。如图1(b)所示。
(3)FA-NH2的合成
将叶酸、二环己基碳二亚胺(Dicyclohexylcarbodi-imide,DCC)和二甲基氨基吡啶(Dimethylaminopyridine,DMAP)分别加入封闭的圆底烧瓶并混合(叶酸:DCC:DMAP＝24.15:40:8)。然后将无水二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和无水吡啶加入烧瓶中并充分混合，再向烧瓶中加入乙二胺(DMSO:无水吡啶:乙二胺＝96:54:5)，溶液立即变浑浊。室温搅拌过夜，得到澄清的黄色溶液。将溶液以8000rpm离心力离心后用乙醚获得沉淀。并用乙醚洗3遍后，用四氢呋喃洗涤3遍。在真空烘箱中干燥最终获得黄色粉末。如图1(c)所示。
(4)PEG-PDEAEA-FA的合成
将PEG-PDEAEA、FA-NH2、DCC和、DMAP加入密封的单颈圆瓶烧瓶中(PEG-PDEAEA:FA-NH2:DCC:DMAP＝250:25:15:3)。将烧瓶用氮气脱气20分钟，然后在氮气条件下将无水DMSO和无水吡啶加入烧瓶中(无水DMSO:无水吡啶＝2:1)。将混合物在室温下搅拌反应3天后，在减压条件下除去吡啶，产物从石油醚中沉淀并用石油醚洗涤多次。利用四氢呋喃将产物重新溶解并用8000rpm离心以除去未反应的FA-NH2。通过旋转蒸发剩余的溶剂，并在真空环境下收集黄色粘稠固体。如图1(d)所示。
(5)AuNPP、AuNPP-FA的合成
将四氯金酸(HAuCl4)分别与PEG-PDEAEA-FA或PEG-PDEAEA混合，利用NaBH4将HAuCl4还原并自组装为AuNPs。预先制备50mM(20mg/mL)HAuCl4的储存溶液(在氮气保护下处理干燥的HAuCl4)。将NaBH4溶解在NaOH溶液(16.7mM)中制备50mM NaBH4/NaOH溶液，并且在制备后30分钟内使用。NaBH4与NaOH溶液的配比为189mg:10mL。在常规的反应中，在离心管中将PEG-PDEAEA-FA溶于去离子水中形成混浊溶液，然后加入HAuCl4储备溶液(PEG-PDEAEA-FA:去离子水:HAuCl4储备溶液＝100mg:6mL:1mL)。混合均匀后，将NaBH4/NaOH溶液倒入管中，立即振荡3分钟。溶液的颜色从黄色变为红色，表明AuNPP/AuNPP-FA的形成。将制备的AuNPP/AuNPP-FA溶液用透析管(MWCO＝3500Da)在4℃下透析12小时，并且每3小时更换一次水。然后将样品冻干，得到紫色固体。如图1(f)所示为AuNPP-FA的制备示意图。
(6)带有Cy3/Cy7的AuNPP及AuNPP-FA的合成
把荧光染料Cy3-NH2/Cy7-NH2(1mg/mL)、PEG-PDEAEA、催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)放入到小烧瓶中。加入DMSO，密封避光搅拌24小时至各成分完全溶解。Cy3-NH2/Cy7-NH2:PEG-PDEAEA:EDC:NHS:DMSO＝10μl:10mg:21mg:15mg:2mL。后通过透析获得带有荧光的PEG-PDEAEA-Cy3/Cy7。将上述液体与AuNPP/AuNPP-FA(10μg/μl)混合(PEG-PDEAEA-Cy3/Cy7:AuNPP/AuNPP-FA＝1mL:250μl)，避光翻滚24h，通过在水中自组装形成带有荧光连接的含Cy3/Cy7的包裹胶束，最终合成带有Cy3/Cy7荧光的AuNPP和AuNPP-FA。
实验结果
根据上述制备流程，最终本发明制备得到叶酸-嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)，及后续验证所需材料：AuNPP、AuNPP-Cy3/Cy7、AuNPP-FA-Cy3/Cy7。对本发明制备的材料的基本特征验证，详见实施例二。
实施例二：本发明所述的叶酸-嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)的基本特征描述
(1)实施例一中PEG-PDEAEA-FA等组分的验证
通过核磁共振氢谱(1H NMR)和傅氏转换红外线光谱(FTIR spectra)检测，确定PEG-PDEAEA-FA及其前体(PEG、PEG-PDEAEA(未纯化/纯化))的化学结构。不同基团和功能部分的化学信号值如图2(a-d)所示。由于PEG-PDEAEA的侧链末端含有羧基结构，可通过酰胺化共价结合FA-NH2。检测结果显示，在6.0-8.5ppm间可见PEG-PDEAEA-FA的叶酸特征峰(参见图2(d))。同时，由图2(e-f)可见：1615cm-1处的峰是由仲酰胺的C＝O伸缩引发，1515cm-1处的峰是酰胺基上的C-N伸缩和N-H弯曲引发，均证明了叶酸通过酰胺化已成功共轭偶联至PEG-PDEAEA，形成PEG-PDEAEA-FA。
(2)AuNPP-FA的透射电子显微镜(TEM)观察
将AuNPP-FA粉末置于溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，混悬震荡，得到浓度为1mg/mL的AuNPP-FA混悬液，储存于常温。将2μl AuNPP-FA溶液吸取至TEM专用的铜载网上制样并静置固定。通过Hitachi TEM系统(电压80kV条件下)获取并拍摄AuNPP-FA的总体形态及显微结构，详见图3(a-d)。
实验结果
本发明所述的AuNPP-FA成功合成后，利用透射电子显微镜观察到AuNPP-FA为偏均匀单分散的球形金纳米颗粒；在PBS缓冲溶液中稳定存在，无明显的团聚现象；TEM照片显示AuNPs的平均直径为2.8±0.8nm，且分散良好、稳定且被聚合物包围。
实施例三：本发明所述的叶酸-嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)的肿瘤靶向性
为证明AuNPP-FA有效的肿瘤靶向性，利用透射电子显微镜、流式细胞分析仪检测了肿瘤细胞BGC823(胃癌细胞株)、4T1(乳腺癌细胞株)内吞AuNPP和AuNPP-FA的能力。
(1)在胃癌细胞株BGC823中AuNPP、AuNPP-FA的吸收积累
取生长状态良好胃癌细胞株BGC823细胞，经过胰酶消化、完全培养基终止消化、800转/分钟离心5分钟、1mL完全培养基重悬后接种细胞至6孔板中培养过夜，次日保证细胞融合度在70％左右；分别加入20μg/mL的PBS、AuNPP、AuNPP-FA刺激培养24小后，收集BGC823细胞，经过取材固定-脱水-包埋固化切片-染色观察等系列规范化细胞制片过程上机，进行透射电镜(TEM)分析，观察AuNPP和AuNPP-FA在细胞中的靶向摄取能力。如图4(a)所示，BGC823细胞质中AuNPP-FA被摄取的数量明显高于AuNPP组。
(2)不同细胞株中摄取各类金纳米颗粒的流式检测
取生长状态良好的4T1、BGC823细胞，经过胰酶消化、完全培养基终止消化、800转/分钟离心5分钟、1mL完全培养基重悬后接种细胞至6孔板中培养过夜，次日保证细胞融合度在70％左右；分别加入100μl/mL的PBS、AuNPP、AuNPP-FA、AuNPP-Cy3、AuNPP-FA-Cy3刺激培养4小时(后续操作均避光处理)；利用无EDTA的胰酶消化细胞，900转/分钟离心5分钟后，利用PBS洗涤2遍后500μl PBS重悬，送检上机，利用流式细胞分析仪检测两株肿瘤细胞对不同材料的吸收摄取情况。如图4(b)结果所示，肿瘤细胞对AuNPP-FA-Cy3的摄取(荧光强度)明显高于其他组(PBS、AuNPP、AuNPP-FA、AuNPP-Cy3)。
(3)乳腺癌荷瘤小鼠模型验证AuNPP-FA的肿瘤靶向性
取对数生长期并稳定表达萤火虫荧光素酶的鼠源性乳腺癌细胞株4T1(4T1-Luc)，经胰酶消化、重悬后，利用PBS稀释至1×107/mL；购买6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，利用剃毛机或无刺激性脱毛膏备皮后，医用酒精消毒3遍并在第四对右侧乳腺区域，切开腹壁皮肤约0.5-1cm暴露该乳腺脂肪垫；利用胰岛素针缓慢注入约100μl已制备好的细胞悬液，并缝合切口，各组5只；每日定时观察小鼠状态及肿瘤生长情况，当肿瘤体积达到100mm3以上时，可进行药物处理(对照组小鼠AuNPP-Cy7，实验组小鼠AuNPP-FA-Cy7，各200μl)。按时间点设定为3小时、6小时、24小时行活体成像和材料荧光检测。
活体成像：配制萤光素酶的底物，即VivoGloTM萤光素(P1043,Promega)。利用无菌生理盐水配制后，称取小鼠，在腹腔进针处用医用酒精消毒3遍后，按150mg/Kg比例注入定量的底物，后轻轻按压进针处，促进底物吸收；麻醉：利用无菌生理盐水稀释戊巴比妥钠溶液至浓度为1％。称取小鼠，在进针处用医用酒精消毒3遍后，按9.5μl麻药：1g体重比例将麻药注入腹腔。待2分钟后，老鼠处于麻醉状态；在注射荧光素酶底物约10-15分钟、麻醉约5分钟左右，利用小鼠活体成像系统(FX Pro,Bruker,美国)进行拍摄。
材料荧光生物成像：在完成上述活体成像后，利用小鼠活体成像系统(FX Pro,Bruker,美国)针对Cy7荧光通道直接成像，可得到成像图如图4(c-d)所示。
结果如图4(c)所示，在给药3小时后，带有叶酸靶向材料组AuNPP-FA-Cy7在肿瘤部位蓄积明确，且明显优于AuNPP-Cy7组。同时，随着时间的推移，AuNPP-FA-Cy7组乳腺肿瘤局部仍可检测到更多的荧光信号，提示其靶向性更优且能更长时间积聚于肿瘤局部而发挥功能。与体内实验一致，给药3小时后将小鼠器官进行成像后，AuNPP-FA-Cy7组的肿瘤组织有更多的材料蓄积(参见图4(d))。此外材料在肾脏、肝脏均有蓄积，且在肾脏蓄积程度最高，表明肾脏代谢很有可能是该材料的主要代谢途径，这也和体内实验检测到的膀胱区域荧光强度高的结果符合。
综上实施实验证明，本发明成功制备的AuNPP-FA具有良好的稳定性，在体内外能够有效地靶向肿瘤细胞。同时在体内主要通过肾脏代谢途径代谢。
实施例四：本发明所述的叶酸-嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)的体内外抗肿瘤作用实验
(1)平板克隆实验证明AuNPP-FA对肿瘤细胞增殖的影响
取生长状态良好的鼠源性乳腺癌细胞株4T1、人源性胃癌细胞株BGC823(融合度在80％-90％时)，经过胰酶消化、完全培养基终止消化，800转/分钟离心5分钟，1.5mL完全培养基重悬后行细胞计数；4T1细胞株，铺1500个/孔至6孔板中；BGC823细胞株，铺200/孔至24孔板中。分别每孔加入2mL、1mL的完全培养基。其中，实验组加入40μg/mL AuNPP-FA，对照组加入等量高压灭菌过的PBS。每3-4天换液1次。连续培养10-12天可见细胞集落形成；吸去培养上清用4％多聚甲醛固定20分钟。后再用PBS洗1-2遍；用1％的结晶紫染液染色30分钟，用PBS轻轻洗涤染色液。后在空气中干燥平板并拍照。在显微镜下测量并计算含有超过50个细胞的细胞集落数。集落形成率(％)＝集落数/细胞量×100％。结果如图5(a)所示，无论是4T1还是BGC823细胞株，与PBS对照组比较，AuNPP-FA(40μg/mL)实验组克隆形成率明显下降。
(2)乳腺癌荷瘤小鼠模型验证AuNPP-FA的抗肿瘤作用
小鼠造模过程同实施例三所述，当肿瘤体积达到100mm3以上时，开始腹腔注射药物并维持2周(对照组小鼠100μl/day PBS，实验组小鼠20mg/kg·dayAuNPP-FA/AuNPP)。当肿瘤体积达到1000mm3以上时，对小鼠进行安乐死，收集各脏器、肿瘤组织、固定并保存观察。
结果如图5(b)所示，与对照组相比，AuNPP-FA组原位肿瘤体积明显减小，同时肺转移受到明显抑制(图5(b)右)。在给药25天后，取出原位肿瘤并称重，AuNPP-FA组肿瘤重量较较对照组显著减轻(图5(c)和(d))；将小鼠肺脏取出、固定观察，可见AuNPP-FA组肺转移数量显著减少(图5(e))，行HE染色结果可见AuNPP-FA组肺转移灶较对照组明显减少，在PBS组可见数量多结节大的肺转移癌灶(图5(f))。证实AuNPP-FA在体内可降低肺转移的发生率。
以上结果表明，AuNPP-FA在体外能有效抑制肿瘤增殖，体内不仅能够抑制肿瘤增殖，还具有抑制肿瘤转移的作用。
实施例五：本发明所述的叶酸-嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)的生物安全性实验
(1)各主要脏器HE染色及小鼠体重变化情况
为评估AuNPP-FA是否存在体内毒性，同时观察了不同条件处理(PBS、AuNPP-FA，浓度剂量同前)下的荷瘤小鼠/健康小鼠的的体重变化及给药14后各器官的病理改变。主要器官(心、肝、脾、肺、肾、小肠、卵巢)的石蜡切片HE染色也提示腹腔注射AuNPP-FA的实验组没有可观察的器官损害或组织变性(图6(a))。在体重方面附图6(b)所示，对健康小鼠来说，PBS和AuNPP-FA的处理对其体重无明显影响；而在第40天，4T1+PBS处理的4T1荷瘤小鼠出现与肿瘤相关的体重下降，而4T1+AuNPP-FA处理的4T1荷瘤小鼠的体重在治疗过程中没有明显变化。(荷瘤小鼠模型为乳腺癌原位小鼠模型，构建过程同前)
(2)小鼠血生化指标及便常规检测
血生化指标检测：用一只手固定小鼠，压迫小鼠颈部两侧，造成眶后静脉丛充血和眼球外翻。另一只手持长约3cm，内径0.9～1.1mm的玻璃毛细管，以与鼠面成45°穿刺入内眦静脉。血液流动后，在含EDTA-2K的采血管中，每只小鼠采血约100μl；1小时内在Mindray兽医全自动血液分析仪或全自动生化分析仪上进行检测。
结果：肝功能的结果提示：丙氨酸转氨酶(ALT)在健康小鼠在注射AuNPP-FA后第3天可观察到一定水平的升高，但停药两周后ALT可恢复至与Healthy+PBS组相似水平(图6(c))；在荷瘤小鼠中AuNPP-FA组出现类似趋势，但无统计学差异。总胆红素(T-Bil)在第7天时AuNPP-FA组有所升高，但停药两周后可恢复正常(图6(e))；谷氨酸转氨酶(AST)无明显变化(图6(d))，证实AuNPP-FA可能引起一过性肝功能损害，但停药后可自行恢复。肾功能的结果提示：无论是肌酐、尿素氮还是尿RT(结果未展示)均无明显变化，组间无统计学差异。粪便涂片也未发现AuNPP-FA组存在血便或脓性大便等异常(结果未展示)。
综合以上结果表明AuNPP-FA的动物体内应用是相对安全的，无明显毒副作用。
实施例六：本发明所述的叶酸-嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)促肿瘤血管正常化证明实验
(1)AuNPP-FA促肿瘤血管结构正常化验证
将实施例四中经PBS或AuNPP-FA治疗14天后的小鼠原位肿瘤组织取出，经过规范化的扫描电镜观察标本制备过程，检测肿瘤组织血管形态。如图7(a)结果所示，无论是乳腺原位癌还是胃癌皮下瘤，相比于PBS对照组，AuNPP-FA处理后，肿瘤血管管腔更规整，管腔内血管内皮连接更紧密，间隙减少。经过规范的组织切片制备过程，如图7(b)所示，通过周细胞标志蛋白(α-SMA)和CD31的免疫荧光双染，评估肿瘤血管结构。结果示：AuNPP-FA组血管周围覆盖的周细胞数量增多。表明肿瘤血管结构形态更规则，并趋向成熟、正常的血管。
(2)AuNPP-FA促进肿瘤血管功能正常化验证
1)肿瘤血管灌注实验：用小鼠固定器固定荷瘤小鼠，将其尾巴暴露，用医用酒精擦涂尾部血管3遍后，待酒精挥发，可见暴露较好的充盈血管。用胰岛素针吸取0.05mg荧光素标记的番茄凝集素(Lectin)从小鼠尾静脉内注射，10分钟后处死小鼠并剥离肿瘤团块。行冰冻切片制备后行组织免疫荧光检测(CD31：红，Lectin：绿)。最后在荧光显微镜下观察拍摄切片并比较血管灌注情况。
2)肿瘤血管渗漏实验：用小鼠固定器固定荷瘤小鼠，将其尾巴暴露，用医用酒精擦涂尾部血管3遍后，待酒精挥发，可见暴露较好的充盈血管。用胰岛素针吸取0.25mg FITC-缀合的葡聚糖40kDa(Dextran)从小鼠尾静脉内注射，15分钟后处死小鼠并剥离肿瘤团块。将肿瘤组织制成冷冻切片后行组织免疫荧光检测(CD31：红，Dextran：绿)。最后在荧光显微镜下拍摄切片并比较血管渗漏情况。
3)肿瘤组织缺氧检测实验：用小鼠固定器固定荷瘤小鼠，将其尾巴暴露，用医用酒精擦涂尾部血管3遍后，待酒精挥发，可见暴露较好的充盈血管。用胰岛素针吸取适量的盐酸哌莫硝唑从小鼠尾静脉内注射。(注入量为：60mg/Kg，如小鼠25g，注入盐酸哌莫硝唑的量为1.5mg)；1小时后处死小鼠并剥离肿瘤团块，行规范化冰冻切片制备后行组织免疫荧光检测(PIMO：绿)用于评估组织缺氧检测；
结果如图7(c-d)所示，与PBS对照组相比，AuNPP-FA组肿瘤血管中带有绿色荧光的植物凝集素(Lectin)更多，表明血管灌注增多。而PBS组则在肿瘤血管周围、肿瘤组织中，观察到更多的带有绿色荧光的葡聚糖渗出，表明AuNPP-FA组血管渗出较PBS组减少。最后，进行肿瘤组织缺氧情况检测(PIMO)，AuNPP-FA组缺氧情况得到明显改善。
综上实验结果证实，本发明所构建的AuNPP-FA在体内能有效促进肿瘤血管的形态和功能的正常化，表现为血管更规则、血管周细胞覆盖增加，血管灌注增加、渗出减少和组织缺氧得到改善。
实施例七：本发明所述的叶酸-嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)促进肿瘤血管正常化后提高免疫治疗疗效的证明实验
(1)AuNPP-FA促进效应性毒性T淋巴细胞的浸润
肿瘤血管的正常化可以促进细胞毒性T淋巴细胞等免疫细胞的浸润，通过免疫的调控控制肿瘤的进展。为明确AuNPP-FA促使肿瘤血管正常化后能否进一步促进细胞毒性T淋巴细胞的浸润，因此我们采用实施例四中的小鼠检测CD3+CD8+T淋巴细胞在乳腺原位癌小鼠模型中的浸润情况。根据免疫荧光结果，如图8(a)所示，在AuNPP-FA处理组，小鼠乳腺原位肿瘤组织中CD3+CD8+T淋巴细胞浸润明显增加。
(2)AuNPP-FA促进肿瘤血管正常化后可提高免疫治疗疗效
临床研究证实，抗PD-L1(阿特珠单抗)联合紫杉醇可延长转移性三阴性乳腺癌患者的无进展生存期，尤其是在PD-L1阳性的患者中更是如此。本发明所构建的AuNPP-FA联合化疗及免疫治疗是否获得更好的治疗效果，故进行联合用药的实验证明：
乳腺原位癌小鼠模型构建具体方法同实施例三所述。当肿瘤体积达到100mm3以上时，开始腹腔注射药物(Day7)。小鼠分组为5组，分组情况为Control组(PBS)；抗PD-L1单抗联合紫杉醇(Paclitaxe)用药组；抗PD-L1单抗联合紫杉醇、AuNPP-FA；单纯AuNPP-FA组；抗PD-L1单抗联合紫杉醇、VEGF单抗(B20)用药组。在种植后第31天，取小鼠肿瘤组织进行评估。
用药方案为：
紫杉醇：8mg/Kg，在第7,14,21天，每周1次给药；
鼠源性抗PD-L1单抗：12.5mg/Kg，在第9,12,16,19,23,26天给药；
B20(鼠源性anti-VEGF)：5mg/Kg，在第7,10,14,17,21,24天给药；
AuNPP-FA：20mg/Kg，在第7-14天，21-28天，隔周连续使用1周。
结果：与对照组相比，抗PD-L1联合化疗药紫杉醇等治疗组均能够显著缩小乳腺原位瘤的大小(图8(b-c))。其中，联用AuNPP-FA组治疗效果最佳，能显著抑制肿瘤的生长，肿瘤体积和重量得到显著减少(图8(b-c))。此外，联合AuNPP-FA的综合给药组，肺转移结节受到显著抑制(图8(d))。
上述结果证明，本发明所构建的AuNPP-FA在促进肿瘤血管正常化过程中，能促进细胞毒性T淋巴细胞的浸润，从而提高抗PD-L1联合抗肿瘤治疗疗效。

Claims (10)

1.一种叶酸修饰嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒，其特征在于：所述金纳米颗粒是聚乙二醇-b-聚丙烯酸二乙氨基乙酯二嵌段共聚物(PEG-PDEAEA)与带有氨基的叶酸分子(FA-NH2)这两个功能单体通过酰胺化反应组装成外壳聚合物(PEG-PDEAEA-FA)，再与四氯金酸(HAuCl4)混合后通过硼氢化钠(NaBH4)还原法合成的叶酸修饰嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒(AuNPP-FA)。
2.如权利要求1所述的叶酸修饰嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A：聚乙二醇(PEG)的合成：将PEG-丙烯酸酯、偶氮二异丁腈(AIBN)和RAFT-COOH加入圆底烧瓶中，用橡胶隔膜帽密封烧瓶并通过氮气脱气20分钟，然后在60℃下搅拌20小时。通过在冷乙醚中终止反应并沉淀，最后在真空烘箱中干燥，得到含有12个重复单元分子量达5760Da的黄色油状PEG材料；
步骤B：PEG-PDEAEA两亲性嵌段共聚物的合成：在锥形瓶中将PEG溶解进2-(二乙氨基)丙烯酸乙酯(DEAEA)单体中，再加入AIBN并用橡胶隔膜帽封闭。通过氮气脱气20分钟，然后在60℃下搅拌24小时，通过在冷乙醚中终止反应并沉淀，最后在真空烘箱中干燥，获得粘液状的黄色油性物PEG-PDEAEA两亲性嵌段共聚物；
步骤C：FA-NH2的合成：将叶酸、二环己基碳二亚胺(DCC)和二甲基氨基吡啶(DMAP)分别加入封闭的圆底烧瓶并混合。然后将无水二甲基亚砜(DMSO)和无水吡啶加入烧瓶中并充分混合，再向烧瓶中加入乙二胺(DMSO:无水吡啶:乙二胺＝96:54:5)，溶液立即变浑浊。室温搅拌过夜，得到澄清的黄色溶液。将溶液以8000rpm离心，离心后用乙醚获得沉淀。并用乙醚洗3遍后，用四氢呋喃洗涤3遍。在真空烘箱中干燥最终获得FA-NH2黄色粉末；
步骤D：PEG-PDEAEA-FA的合成：将PEG-PDEAEA、FA-NH2、DCC和、DMAP加入密封的单颈圆瓶烧瓶中。将烧瓶用氮气脱气20分钟，然后在氮气条件下将无水DMSO和无水吡啶加入烧瓶中。将混合物在室温下搅拌反应3天后，在减压条件下除去吡啶，产物从石油醚中沉淀并用石油醚洗涤多次。利用四氢呋喃将产物重新溶解并用8000rpm离心以除去未反应的FA-NH2。通过旋转蒸发剩余的溶剂，并在真空环境下收集PEG-PDEAEA-FA黄色粘稠固体；
步骤E：AuNPP-FA的合成：预先制备50mM(20mg/mL)HAuCl4的储存溶液(在氮气保护下处理干燥的HAuCl4)。将NaBH4溶解在NaOH溶液(16.7mM)中制备50mM NaBH4/NaOH溶液，并且在制备后30分钟内使用。在常规的反应中，在离心管中将PEG-PDEAEA-FA溶于去离子水中形成混浊溶液，然后加入HAuCl4储备溶液。混合均匀后，将NaBH4/NaOH溶液倒入管中，立即振荡3分钟。溶液的颜色从黄色变为红色，表明AuNPP-FA的形成。将制备的AuNPP/AuNPP-FA溶液用透析管(MWCO＝3500Da)在4℃下透析12小时，并且每3小时更换一次水。然后将样品冻干，得到最终紫色固体产物。
3.根据权利要求2所述的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的步骤A中，所加入的PEG-丙烯酸酯、偶氮二异丁腈(AIBN)和RAFT-COOH的比例为6:0.0342:0.375。
4.根据权利要求2所述的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的步骤B中，所加入的PEG、DEAEA和AIBN的比例为5:50:0.082。
5.根据权利要求2所述的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的步骤C中，所加入的叶酸、DCC和DMAP的比例为24.15:40:8。
6.根据权利要求2所述的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的步骤D中，所加入的PEG-PDEAEA、FA-NH2、DCC和DMAP的比例为250:25:15:3。
7.根据权利要求2所述的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的步骤D中，所加入的无水DMSO与无水吡啶的比例为2:1。
8.根据权利要求2所述的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的步骤E中，NaBH4与NaOH溶液的质量体积比为189mg:10mL。
9.根据权利要求2所述的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的步骤E中，PEG-PDEAEA-FA、去离子水和HAuCl4储备溶液的质量体积比为100mg:6mL:1mL。
10.如权利要求1所述的叶酸修饰嵌段共聚物包裹的金纳米颗粒用于制备靶向肿瘤细胞并杀伤肿瘤的药物的用途。
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