CN102861344A

CN102861344A - 叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备

Info

Publication number: CN102861344A
Application number: CN2012103352963A
Authority: CN
Inventors: 史向阳; 彭琛
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2012-09-11
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2032-09-11
Also published as: CN102861344B

Abstract

本发明涉及一种叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备方法，包括：（1）制备叶酸修饰的聚乙二醇固体产物FA-PEG-COOH；（2）依次用FA-PEG-COOH、mPEG-COOH修饰G5.NH₂，得固体G5.NH₂-(PEG-FA)-mPEG；（3）将步骤（2）所得固体G5.NH₂-(PEG-FA)-mPEG溶解后，加入氯金酸溶液，搅拌后加入NaBH₄溶液，反应后加入三乙胺、乙酸酐，反应结束后将反应产物透析，最后冷冻干燥即可。本发明的方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景；本发明得到的金纳米颗粒具有较好的水溶性、稳定性及水分散性，具有应用于肿瘤的早期检测领域的前景。

Description

叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备

技术领域

本发明属于具有肿瘤靶向的金纳米粒子的制备领域，特别涉及一种叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备方法。

背景技术

癌症已经成为危害全世界人类健康的主要杀手之一，但是如果癌症可以在早期被检测出来，则其被治愈的可能性就越高。因此发展癌症的早期检测技术已经成为亟待解决的难题。CT成像是目前临床上用于诊断癌症的常用手段之一，具有较高的空间和密度分辨率，因此受到了广泛的研究。为了实施对癌细胞的精确诊断，发展合适的CT造影剂是必不可少的。

贵重金属纳米粒子(NPs)，如Au NPs和Ag NPs由于其独特的光学、电子和量子尺寸相关的性能，在医学领域的应用引起了相当大的科学和技术上的关注，尤其是在生物传感、疾病的诊断、光热疗法以及药物和基因传递领域。在众多的以聚合物辅助合成的Au NPs的实例中，以树状大分子为模板或稳定剂合成的纳米粒子已经引起人们大量的关注。这主要是由于这种新型的、高度支化的和单分散的合成性树状大分子的独特结构和性能。树状大分子可定制的表面化学性能，容许研究者轻松地在其表面修饰用于不同生物医学领域的生物功能团。例如，端基为氨基的树状大分子包裹的金纳米颗粒（Au DENPs）可以进一步用染料(如荧光素染料)和靶向配体分子(如叶酸、RGD多肽)官能化，用于特异性地检测癌细胞（Shi et al.,Small 2007,3,1245-1252）。一般情况下，以树状大分子为模板或稳定剂功能化金或银纳米颗粒往往涉及两个步骤：1）功能化树状大分子；2）合成金属纳米颗粒。这两个步骤的顺序可以根据与胶体颗粒稳定性和复合物的最终应用有关的技术过程颠倒过来。在某些特殊情况下，颗粒的功能化和合成可通过一个步骤同时实现。

目前，Au纳米颗粒由于具有良好的生物相容性、表面易于修饰、对X射线有较高的吸收等性质，已经被广泛的研究以用于癌症的早期检测。利用树状大分子包裹/稳定的金纳米颗粒不仅可以提高金纳米颗粒的稳定性，而且可以用于CT成像（Wang et al.,Biomaterials2011,11 2979-2988）。史向阳等的工作表明，利用聚乙二醇修饰的树状大分子包裹纳米金颗粒，不仅可以大大提高纳米金的包裹量进而提高CT诊断的灵敏度，提高其生物相容性，而且可以进一步延长材料在血液中的循环周期进而延长成像时间（Peng et al.,Biomaterials2012,4,1107-1119；专利公开号：CN102153871A，公开日2011年8月17日）。因此聚酰胺-胺树状大分子作为CT成像纳米造影剂的载体，使开发出具有靶向的、具有较高生物相容性的CT成像造影剂成为可能，从而为癌症的早期诊断带来了新的曙光。

查找相关的专利和文献发现，目前还未见使用基于叶酸修饰的聚乙二醇化的树状大分子包裹的金纳米颗粒用于靶向诊断肿瘤的CT成像造影剂的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备方法，该方法制备的金纳米颗粒不仅提高了金纳米颗粒的稳定性，而且可以用于CT成像来靶向诊断小鼠的肿瘤部位，较好的降低了材料对正常组织的损伤，该制备工艺简单，反应条件温和，具有产业化实施的前景。

本发明一种叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备方法，包括：

（1）制备叶酸的二甲基亚砜溶液，然后用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）活化2-5h，然后边搅拌边逐滴滴加聚乙二醇的二甲基亚砜溶液，反应70~80h后，将反应产物透析，最后冷冻干燥得到叶酸修饰的聚乙二醇固体产物FA-PEG-COOH；

（2）用二甲基亚砜溶解端基为氨基的树状大分子（G5.NH₂），得到树状大分子溶液；将步骤（1）中所得的固体产物FA-PEG-COOH溶解在二甲基亚砜溶液中，并经EDC·HCl活化后逐滴加入上述树状大分子溶液中，反应60-80h后再加入使用EDC·HCl活化后的一端是羧基的聚乙二醇单甲醚（mPEG-COOH），反应60-80h后将反应产物透析，最后冷冻干燥得到固体G5.NH₂-(PEG-FA)-mPEG；

（3）将步骤（2）所得固体G5.NH₂-(PEG-FA)-mPEG用二甲基亚砜或水溶解后，再加入氯金酸溶液，然后在室温下搅拌20～40min，随后加入NaBH₄溶液，在室温下搅拌反应1.5～2.5h后加入三乙胺，搅拌混合20～40min后，再加入乙酸酐，在室温下搅拌反应20～28h，随后将反应产物透析，最后冷冻干燥得到叶酸修饰的聚乙二醇化的树状大分子包裹的金纳米颗粒（{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs）。

步骤（1）中所述的叶酸的二甲基亚砜溶液中叶酸与二甲基亚砜的用量比为20~30mg：20mL；所述的叶酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）的用量比为20~30mg：8.69~13.03mg。

步骤（1）中所述的聚乙二醇一端是羧基另一端是氨基，即为NH₂-PEG-COOH；所述的聚乙二醇的二甲基亚砜溶液中聚乙二醇NH₂-PEG-COOH（干重）与二甲基亚砜的用量比为45.31~67.97mg：1mL；EDC·HCl活化的叶酸与的聚乙二醇NH₂-PEG-COOH的摩尔比为2:1。

步骤（2）中所述的树状大分子溶液中端基为氨基的树状大分子（干重）与二甲基亚砜的用量比为20~30mg：15mL。

步骤（2）中所述的固体产物FA-PEG-COOH与二甲基亚砜的用量比为14.99~22.49mg：5mL。

步骤（2）中所述的树状大分子（干重）、固体产物FA-PEG-COOH与使用EDC·HCl活化后的一端是羧基的聚乙二醇单甲醚（mPEG-COOH）的用量比为20~30mg：14.99~22.49mg：23.19~34.80mg。

步骤（2）中所述的树状大分子为第5代聚酰胺-胺型树状大分子；固体产物FA-PEG-COOH、使用EDC·HCl活化后的一端是羧基的聚乙二醇单甲醚与树状大分子的摩尔比为5:15:1。

步骤（3）中所述的氯金酸溶液为10mg/mL的HAuCl₄甲醇溶液或10mg/mL的HAuCl₄水溶液。

步骤（3）中所述的NaBH₄溶液中NaBH₄与树状大分子的用量比为29.25~43.88mg：20~30mg；NaBH₄溶液为NaBH₄的H₂O/CH₃OH溶液，H₂O与CH₃OH的体积比为2:1。

步骤（3）中所加入的氯金酸与树状大分子的摩尔比为300:1；所加入的NaBH₄溶液中NaBH₄与金元素的摩尔比为5:1。

步骤（3）中所加入的三乙胺与树状大分子的摩尔比为550:1，所加入的乙酸酐与树状大分子的摩尔比为600:1。

步骤（1）、（2）和（3）中所述的透析具体为将反应产物用透析膜在磷酸盐缓冲液中透析24h，然后再用超纯水透析48h；所述的透析膜为纤维素透析膜，分子量截留为1000。

本发明得到的基于叶酸修饰的聚乙二醇化的树状大分子包裹的金纳米颗粒用于制备靶向诊断肿瘤的CT成像造影剂。

本发明使用核磁共振谱（¹H NMR）、紫外－可见分光光度计（UV-Vis）、透射电子显微镜（TEM）、CT成像等方法表征本发明制备的叶酸修饰的聚乙二醇化的树状大分子包裹的金纳米颗粒，同时用Micro-CT测试来检验叶酸修饰的聚乙二醇化的树状大分子包裹的金纳米颗粒对小鼠活体肿瘤的靶向CT成像效果，具体测试结果如下：

（1）¹H NMR谱

核磁共振氢谱结果证实了{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs的结构正确，见附图1。

（2）紫外－可见光分光光度计的测试结果

在水溶液中合成的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs在280nm和510nm左右都有一个特征吸收峰，这是分别是叶酸分子的紫外吸收峰和金纳米颗粒的表面等离子体共振峰，参见附图2；叶酸修饰的聚乙二醇化的树状大分子包裹的金纳米颗粒在水中具有良好的胶体稳定性，即使树状大分子表面多余的氨基被乙酰化修饰之后，材料在不同的pH值（pH=5.0-9.0）和不同温度（4℃-50℃）范围内均具有良好的胶体稳定性，这说明合成的金纳米颗粒在水溶液中具有良好的稳定性，参见附图3；

（4）透射电子显微镜测量

在水中合成的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs的TEM图片和粒径分布直方图（参见附图4），表明了合成的金纳米颗粒的粒径分布均匀，平均粒径约为4.10±0.99nm。

{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs的高分辨TEM图片（见附图4c）和选区电子衍射图（见附图4d）表明所合成的金纳米颗粒晶化程度比较高。（111）、（200）、（220）和（311）环说明所合成的金纳米颗粒呈面心立方（fcc）晶体结构。

（5）体外材料的X-射线吸收性

将合成的材料{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs配制成一系列的浓度，通过CT测量计算材料的X-射线吸收性。结果发现，在Au和I相同摩尔浓度时，{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs较临床常用造影剂Omnipaque具有更高的X-射线吸收性（见附图5）。

（6）MTT材料毒性检测

将不同浓度的材料与细胞共培养，通过MTT毒性检测，可以看到在金纳米颗粒的浓度高达300μM时也未见较为明显的毒性（见图6），同时通过细胞形貌HE染色也可以看到细胞形貌也没有明显的变化（见图7）。

（7）银染分析材料对KB细胞靶向吞噬作用

将高受体KB细胞（HFKB）和低受体KB细胞（LFKB）分别与{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs（金的浓度分别为100、300μM）共培养24h后，通过银染检测HFKB和LFKB细胞对金纳米颗粒的吞噬量，结果发现高受体的KB细胞对材料的吞噬量要大于低叶酸受体KB细胞对材料的吞噬量，从而证明了已经合成的材料{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs对高受体的KB细胞具有特异性靶向作用（见图8）。

（8）小鼠活体肿瘤成像

将100μL的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs（[Au]=0.1mol/L）尾部静脉注射进体重为18g的小鼠体内，分别通过Micro-CT扫描诊断小鼠的肿瘤部位所得的图片（图9），从CT成像图片中均能够看到小鼠的肿瘤部位的相对信号强度较高，且小鼠未发现死亡，证明本方法合成的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs具有较低的生物毒性和较好的CT成像靶向诊断小鼠肿瘤的效果。

本发明的方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景；本发明提高了金和树状大分子之间的摩尔比，降低了材料的成本，同时提高了金纳米粒子的稳定性，叶酸的修饰使得材料对肿瘤组织具有良好的靶向成像效果。

有益效果

（1）本发明的制备工艺简单，反应条件温和，具有产业化实施的前景；

（2）本发明设计合成的基于叶酸修饰的聚乙二醇化的树状大分子包裹的金纳米颗粒具有较好的水溶性、稳定性及水分散性，同时具有较低的细胞毒性，较高的X-射线衰减系数；

（3）本发明的基于叶酸修饰的聚乙二醇化的树状大分子包裹的金纳米颗粒对叶酸受体过表达的肿瘤细胞具有较好的靶向性，同时可以用于CT成像，可以靶向诊断小鼠活体的肿瘤部位，因此使它们具有了应用于肿瘤的早期检测领域的前景。

附图说明

图1为本发明制备的G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG（a）和{(Au⁰)₃₀₀–G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs（b）的核磁共振氢谱图；

图2为本发明制备的G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG和{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs在25℃、pH=7.0的紫外吸收光谱图；

图3为本发明制备的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs在不同温度（a）和不同pH值（b）下的紫外吸收光谱图；

图4为本发明制备的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs的（a）TEM图片；（b）粒径分布图；（c）高分辨TEM图片；（d）选区电子衍射；

图5为本发明制备的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs材料在体外的X-射线吸收强度图；

图6为本发明制备的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs材料在金的浓度为0-400μM与KB细胞共培养24h后的MTT的检测结果；

图7为本发明制备的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs材料在金的浓度为100μM（b）300μM（c）与KB细胞共培养24h后的HE染色后的细胞形貌，a为空白对照；

图8为本发明制备的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs材料在金的浓度为0、100、300μM分别与高受体KB细胞（HFKB）和低受体KB细胞（LFKB）共培养24h，随后对细胞进行银染后的效果图；

图9为本发明制备的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs 材料和{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs（[Au]均为0.1mol/L，0.5μL）经由两种不同方式（分别为尾部静脉注射和腹腔注射）注射入接种了KB肿瘤模型的小鼠体内，不同时间下Micro-CT 扫描成像诊断小鼠的肿瘤部位所得的图片（a）（{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)₄-PEG₁₁}DENPs静脉注射（1）和腹腔注射（2），肿瘤部位叶酸阻断后{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)₄-PEG₁₁}DENPs静脉注射（3）和腹腔注射（4）、{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs静脉注射（5）和腹腔注射（6））和肿瘤部位的CT信号值（b）；

图10为本发明制备的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs材料和{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs（[Au]均为0.1mol/L，0.5μL）经由两种不同方式（分别为尾部静脉注射和腹腔注射）注射入接种了KB肿瘤模型的小鼠体内，注射6h后小鼠的肿瘤部位的组织切片图（{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)₄-PEG₁₁}DENPs静脉注射（a）和腹腔注射（b），肿瘤部位叶酸阻断后{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)₄-PEG₁₁}DENPs静脉注射（c）和腹腔注射（d）、{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs静脉注射（e）和腹腔注射（f），g为空白对照）。

图11为本发明的制备的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs的简易流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

（1）用20mL的二甲基亚砜溶液稀释20mg的叶酸，使用8.69mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）活化3h，然后边搅拌边逐滴滴加溶于1mL二甲基亚砜的干重为45.31mg的聚乙二醇（NH₂-PEG-COOH），反应70~80h后，将反应产物用透析膜在缓冲液中透析24h，然后在用超纯水透析48h，最后将纯化的产物冷冻干燥得到叶酸修饰的聚乙二醇固体产物（FA-PEG-COOH）。

（2）用15mL的二甲基亚砜溶液溶解干重为30mg的树状大分子，然后取（1）中所得的固体22.49mg，溶解在5mL二甲基亚砜溶液并使用EDC.HCl活化过后逐滴加入树状大分子溶液，反应72h后再加入干重为34.80mg的用EDC.HCl活化的一端是羧基的聚乙二醇单甲醚（mPEG-COOH），反应72h后反应产物用透析膜在缓冲液中透析24h，随后用超纯水透析48h，最后将纯化的产物冷冻干燥得固体G5.NH₂-(PEG-FA)-mPEG。

合成过程中对树状大分子表面修饰用核磁进行表征，对各个峰进行积分计算可知：树状大分子载体表面修饰了4个PEG-FA和12个mPEG分子（附图1a）。对得到的产品G5.N_H2-(PEG-FA)-mPEG进行紫外吸收表征（附图2，曲线1），FA中苯环的吸收峰在290nm，证明了FA已经被成功地修饰在树状大分子表面。这些测试结果表明已成功制备了设计合成的功能化的树状大分子G5.NH₂-(PEG-FA)-mPEG。

实施例2

（1）用20mL的二甲基亚砜溶液稀释30mg的叶酸，使用13.03mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）活化3h，然后边搅拌边逐滴滴加溶于1mL二甲基亚砜的干重为67.97mg的聚乙二醇（NH₂-PEG-COOH），反应70~80h后，将反应产物用透析膜在缓冲液中透析24h，然后在用超纯水透析48h，最后将纯化的产物冷冻干燥得到叶酸修饰的聚乙二醇固体产物（FA-PEG-COOH）。

（2）用15mL的二甲基亚砜溶液溶解干重为20mg的树状大分子，然后取（1）中所得的固体14.99mg，溶解在5mL二甲基亚砜溶液并使用EDC·HCl活化过后逐滴加入树状大分子溶液，反应72h后再加入干重为23.19mg的用EDC·HCl活化的一端是羧基的聚乙二醇单甲醚（mPEG-COOH），反应72h后反应产物用透析膜在缓冲液中透析24h，随后用超纯水透析48h，最后将纯化的产物冷冻干燥得固体G5.NH₂-(PEG-FA)-mPEG。

实施例3

取的实施例1制备的G5.NH₂-(PEG-FA)-mPEG，用20mL甲醇或水将其溶解后，再加入氯金酸溶液（10mg/mL），在室温下搅拌30min后加入冰的NaBH₄溶液（43.88mg，CH₃OH:H₂O（体积比）=2:1），在室温下搅拌反应2h，向反应体系加入88.9μL三乙胺，搅拌混合30min后，再向反应液中加入72.4μL乙酸酐，在室温下搅拌反应24h，随后将反应产物用透析膜在PBS缓冲溶液和超纯水中透析，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到叶酸修饰的聚乙二醇化的树状大分子包裹的金纳米颗粒（{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs）。

所述的氯金酸溶液为10mg/mL的HAuCl₄甲醇溶液或10mg/mL的HAuCl₄水溶液；所述的NaBH₄溶液为NaBH₄的H₂O/CH₃OH溶液，H₂O与CH₃OH体积比的为2:1；所加入的氯金酸与树状大分子的摩尔比为300:1；所加入的NaBH₄溶液中NaBH₄与金元素的摩尔比为5:1；所加入的三乙胺与树状大分子的摩尔比为550:1，所加入的乙酸酐与树状大分子的摩尔比为600:1。

合成过程中对所形成的Au DENPs用紫外吸收光谱（附图2，曲线2）和TEM（附图3）进行了表征。附图2中，Au DENPs的表面等离子体共振（SPR）峰在520nm，证明了Au DENPs已经被成功地制备。TEM图片（附图4）表明金纳米颗粒直径约3.10nm，尺寸分布较窄，具有良好的形貌。这些测试结果表明已成功制备了设计合成的功能化的树状大分子包裹的纳米金颗粒{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs。

实施例4

以体外CT测试的亨氏单位（HU）值来检验实施例3合成的材料{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs与传统造影剂欧乃派克（Omnipaque）的CT值。取实施例3样品8.55mg溶解在200μL的PBS缓冲液中配制金浓度为0.1M的溶液，再分别稀释到金浓度为0.06M，0.02M，0.01M，0.005M的溶液各100μL。取欧乃派克42.3mL（碘的浓度为300mg/mL）稀释至1mL配置成碘浓度为0.1M的溶液，再分别稀释到碘浓度为0.06M，0.02M，0.01M，0.005M的溶液各100μL。用CT测试仪测试各个样品的HU值并得出X-射线衰减与金或碘浓度的线性关系。附图5为{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs与欧乃派克在相同金或碘浓度下的X-射线衰减的线性关系图。从图5中可以看出在金和碘浓度相同的条件下，{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs比欧乃派克的HU值大，证明本方法合成的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs较单一的碘造影剂具有更好的X-射线衰减强度。

实施例5

以人口腔上皮癌细胞（KB）为模型细胞，通过MTT法考察其与不同金浓度的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs共培养后的细胞活力（附图7）。取实施例3样品8.55mg溶解在200μL的PBS缓冲液中配制金浓度为0.1M的溶液，再分别稀释到金浓度为100μM，200μM，300μM，400μM的溶液各1.0mL。随后将配置好的溶液与KB细胞共培养24h后，利用HE染色（图7）观察细胞形貌，并用MTT（附图6）法检测细胞活力。结果表明{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs在金浓度达到300μM时对细胞形貌和细胞活力仍无明显的影响。因此，本研究设计合成的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs具有良好的生物相容性。

实施例6

以人口腔上皮癌细胞（KB）为模型细胞，通过银染检测叶酸阻断实验中不同金浓度的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs分别与高、低叶酸受体表达的KB细胞共培养24h后的吞噬效果（附图8）。取实施例3样品8.55mg溶解在200μL的PBS缓冲液中配制金浓度为0.11M的溶液，再分别稀释到金浓度为100μM，200μM，300μM，400μM的溶液各1.0mL。随后将配置好的溶液分别与高、低叶酸受体表达的KB细胞共培养24h后，利用银染色（图8）观察细胞形貌。结果表明随着金浓度的增加，KB细胞对{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs的吞噬量逐渐增多（细胞银染效果更黑），且相较于低叶酸受体表达的KB细胞而言，在相同金浓度情况下，高叶酸受体表达的KB细胞对{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs具有更强的吞噬能力。因此，本研究设计合成的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs对高叶酸受体表达的KB细胞具有良好的靶向性。

实施例7

将100μL实施例3中得到的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs（[Au]=0.1mol/L）分别经尾部静脉注射、腹腔注射进体重为18-20g的构建了高、低叶酸受体表达的肿瘤模型的小鼠体内，同时将{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs（[Au]=0.1mol/L）分别经尾部静脉注射、腹腔注射进体重为18-20g的肿瘤模型的小鼠体内，分别于用药后2h、4h、6h和24h通过Micro CT扫描小鼠肿瘤部位的CT图片（附图9）。从图中可以明显观察到小鼠的肿瘤部位在不同注射方式注射后6h内，肿瘤部位的CT信号均有所增强，但是通过尾静脉注射的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs在小鼠高叶酸受体表达的肿瘤部位具有更高的CT信号，对肿瘤部位组织用药6h后切片银染处理的结果（图10）也证实了图9的结论，图10中通过尾静脉注射的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs在小鼠高叶酸受体表达的肿瘤部位具有更多的金纳米颗粒（图中黑色部分）。图9和图10均说明本发明制备的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs对高叶酸受体表达的肿瘤部位具有更好的靶向聚集效果。

Claims

1.一种叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备方法，包括：

（1）制备叶酸的二甲基亚砜溶液，然后用EDC·HCl活化2-5h，然后边搅拌边逐滴滴加聚乙二醇的二甲基亚砜溶液，反应70~80h后，将反应产物透析，最后冷冻干燥得到叶酸修饰的聚乙二醇固体产物FA-PEG-COOH；

（2）用二甲基亚砜溶解端基为氨基的树状大分子，得到树状大分子溶液；将步骤（1）中所得的固体产物FA-PEG-COOH溶解在二甲基亚砜溶液中，并经EDC·HCl活化后逐滴加入上述树状大分子溶液中，反应60-80h后再加入使用EDC·HCl活化后的一端是羧基的聚乙二醇单甲醚，反应60-80h后将反应产物透析，最后冷冻干燥得到固体G5.NH₂-(PEG-FA)-mPEG；

（3）将步骤（2）所得固体G5.NH₂-(PEG-FA)-mPEG用二甲基亚砜或水溶解后，再加入氯金酸溶液，然后在室温下搅拌20～40min，随后加入NaBH₄溶液，在室温下搅拌反应1.5～2.5h后加入三乙胺，搅拌混合20～40min后，再加入乙酸酐，在室温下搅拌反应20～28h，随后将反应产物透析，最后冷冻干燥得到叶酸修饰的聚乙二醇化的树状大分子包裹的金纳米颗粒{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-(PEG-FA)-mPEG}DENPs。

2.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的叶酸的二甲基亚砜溶液中叶酸与二甲基亚砜的用量比为20~30mg：20mL；所述的叶酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的用量比为20~30mg：8.69~13.03mg。

3.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的聚乙二醇一端是羧基另一端是氨基，即为NH₂-PEG-COOH；所述的聚乙二醇的二甲基亚砜溶液中聚乙二醇NH₂-PEG-COOH与二甲基亚砜的用量比为45.31~67.97mg：1mL；EDC·HCl活化的叶酸与的聚乙二醇NH₂-PEG-COOH的摩尔比为2:1。

4.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的树状大分子为第5代聚酰胺-胺型树状大分子；步骤（2）中所述的树状大分子溶液中端基为氨基的树状大分子与二甲基亚砜的用量比为20~30mg：15mL；步骤（2）中所述的固体产物FA-PEG-COOH与二甲基亚砜的用量比为14.99~22.49mg：5mL。

5.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的树状大分子、固体产物FA-PEG-COOH与使用EDC·HCl活化后的一端是羧基的聚乙二醇单甲醚的用量比为20~30mg：14.99~22.49mg：23.19~34.80mg。

6.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的固体产物FA-PEG-COOH、使用EDC·HCl活化后的一端是羧基的聚乙二醇单甲醚与树状大分子的摩尔比为5:15:1。

7.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的氯金酸溶液为10mg/mL的HAuCl₄甲醇溶液或10mg/mL的HAuCl₄水溶液；所述的NaBH₄溶液中NaBH₄与树状大分子的用量比为29.25~43.88mg：20~30mg；NaBH₄溶液为NaBH₄的H₂O/CH₃OH溶液，H₂O与CH₃OH的体积比为2:1。

8.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所加入的氯金酸与树状大分子的摩尔比为300:1；所加入的NaBH₄溶液中NaBH₄与金元素的摩尔比为5:1。

9.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所加入的三乙胺与树状大分子的摩尔比为550:1，所加入的乙酸酐与树状大分子的摩尔比为600:1。

10.根据权利要求1所述的一种叶酸修饰聚乙二醇化树状大分子包裹的金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（1）、（2）和（3）中所述的透析具体为将用透析膜在磷酸盐缓冲液中透析24h，然后再用超纯水透析48h；所述的透析膜为纤维素透析膜，分子量截留为1000。