CN110201192B - 一种树状大分子包裹纳米金颗粒探针及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种树状大分子包裹纳米金颗粒探针及其制备和应用。该制备方法包括:G5.NH2‑PEG‑OH制备,{(Au0)25‑G5.NH2‑(PEG‑OH)14}DENPs制备,{(Au0)25‑G5.NHAc‑(PEG‑OH)14}DENPs制备,{(Au0)25‑G5.NHAc‑(PEG)14‑(Fluo‑4)2}DENPs制备。该方法简单,易于操作分离,原料来源商品化,具有良好的发展前景;得到的树状大分子包裹纳米金颗粒探针具有良好的水溶性和稳定性,在对T细胞进行状态监测的同时可以通过CT成像对T细胞进行追踪,具有双模态成像效果。
Description
技术领域
本发明属于功能性纳米颗粒及其制备和应用领域,特别涉及一种树状大分子包裹纳米金颗粒探针及其制备和应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗近年来受到了极大的关注,它主要依靠激活生物体自身的免疫系统最终达到T细胞对肿瘤的杀伤目的。因此,对T细胞的监测可为肿瘤免疫治疗的疗效评估提供重要依据。经研究,钙离子信号可以描述包括T淋巴细胞在内的生物体细胞的不同生理状态,Fluo-4作为一种新型钙离子荧光探针具有荧光明亮、反应灵敏的优点,已有文献报道了一种上转换纳米颗粒表面标记了Fluo-4探针用于监测活细胞不同水平的钙信号以及用于小鼠肝组织的Ca2+成像(Li et al.Journal of America Chemistry Society,2015,137(9):3421-3427)。通过钙离子探针对T淋巴细胞进行钙信号监测可以有效对其功能状态进行评估。
树状大分子(dendrimer)的大小尺寸可以通过代数控制,表面丰富的官能团可被修饰及功能化,树状大分子不仅可以提高材料的溶解性,而且可以将不同的小分子化合物修饰在树状大分子表面使其发挥诊断和治疗的作用,可以用作纳米载体或支架,为多种抗肿瘤药物的传递及生物活性化合物的设计提供了可能。随着纳米技术和纳米医学的不断发展,树状大分子纳米材料在生物医学领域的各个方面表现出极大的应用潜力。已有文献报道一种树状大分子经聚乙二醇化修饰后包裹金纳米颗粒得到的纳米体系,可通过静脉注射对小鼠和大鼠进行X射线CT血池成像,也可以对裸鼠肿瘤模型进行CT成像(Peng etal.Biomaterials,2012,33(4):1107-1119)以及以G5PAMAM树状大分子为核心标记了Cy5的细胞穿透肽(ACPP)和钆离子用于MR成像和荧光成像,可监测小至200μm的肿瘤残留和转移,也可以在荧光指导下进行切除并用荧光显微镜对其进行组织病理学分析观察(Olson E Set al.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,2010,107(9):4311-4316)。通过功能化树状大分子和金属颗粒或者小分子探针复合形成的纳米成像材料不仅表现出功能化树状大分子的特性,同时也可以集合不同成像方法的优势,通过双模态成像为诊断和效果评估提供重要依据。
检索国内外文献尚没有发现关于利用功能化树状大分子包裹纳米金颗粒同时复合钙离子探针用于T细胞CT/荧光双模态成像的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种树状大分子包裹纳米金颗粒探针及其制备和应用,填补功能化树状大分子包裹纳米金颗粒同时复合钙离子探针的技术空白。
本发明提供一种树状大分子包裹纳米金颗粒探针的制备方法,包括:
(1)将一端为马来酰亚胺一端为羟基的聚乙二醇MAL-PEG-OH溶于超纯水中,得到浓度为8-12mg/mL的MAL-PEG-OH溶液,逐滴加入末端为氨基的第5代聚酰胺胺树状大分子G5.NH2水溶液中反应,透析纯化,冷冻干燥,得到聚乙二醇化的树状大分子G5.NH2-PEG-OH,其中G5.NH2和MAL-PEG-OH的摩尔比为1:20;
(2)将步骤(1)中G5.NH2-PEG-OH溶解于超纯水中,得到浓度为8-12mg/mL的G5.NH2-PEG-OH溶液,滴加氯金酸水溶液,搅拌均匀,然后加入硼氢化钠水溶液,还原反应(充分还原),透析纯化,冷冻干燥,得到树状大分子包裹纳米金颗粒{(Au0)25-G5.NH2-(PEG-OH)14}DENPs,其中G5.NH2-PEG-OH、氯金酸与硼氢化钠的摩尔比为1:25:122-128;
(3)将步骤(2)中{(Au0)25-G5.NH2-(PEG-OH)14}DENPs溶解于超纯水中,得到浓度为8-12mg/mL的DENPs溶液,加入三乙胺溶液,搅拌均匀,然后滴加乙酸酐溶液,搅拌过夜,透析纯化,冻干燥,得到乙酰化树状大分子包裹纳米金颗粒{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}
DENPs,其中{(Au0)25-G5.NH2-(PEG-OH)14}DENPs、三乙胺和乙酸酐的摩尔比为1:100:100~1:120:100;
(4)将Fluo-4(pentasodium salt,Fluo-4的五钠盐)溶解在溶剂中,得到浓度为0.8-1.2mg/mL的Fluo-4溶液,经EDC避光活化,加入步骤(3)中{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs的溶液,搅拌均匀,加入DMAP溶液(DMAP用于催化酯化反应),酯化反应,透析纯化,冷冻干燥,得到树状大分子包裹纳米金颗粒探针{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs,其中{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs、Fluo-4、EDC和DMAP的摩尔比为1:3.5:7-10:0.7-1.2。
所述步骤(1)中反应为室温反应过夜。
所述步骤(1)中G5.NH2水溶液的浓度为8-13mg/mL。
所述步骤(2)中氯金酸水溶液浓度为28-32mg/mL;硼氢化钠水溶液浓度为8-12mg/mL。
所述步骤(2)中还原反应温度为室温,还原反应时间为3-5h。
所述步骤(4)中溶剂为DMSO;{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs的溶液的溶剂为DMSO,浓度为8-12mg/mL。
所述步骤(4)中活化时间为0.3-0.6h;酯化反应温度为室温,酯化反应时间为70-75h。
所述步骤(1)、(2)、(3)与(4)中透析为:用截留分子量为8000-14000的纤维素透析膜在超纯水2L×3中透析3天。
本发明还提供一种由上述方法制备得到的树状大分子包裹纳米金颗粒探针。
本发明还提供一种由上述方法制备得到的树状大分子包裹纳米金颗粒探针在制备T细胞追踪和状态评估的制剂中的应用。
所述在制备T细胞追踪和状态评估的制剂中的应用包括:
利用纳米材料({(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs)与T淋巴细胞进行共孵育,可监测T淋巴细胞的胞质钙离子浓度变化;
或者利用纳米材料({(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs)与T淋巴细胞进行共孵育,将T淋巴细胞通过对小鼠皮下注射可进行CT成像对T细胞进行追踪。
本发明中树状大分子包裹纳米金颗粒探针具有可对T细胞同时进行CT成像和荧光成像的双模态成像性能,可用于制备T细胞追踪和功能状态监测为肿瘤免疫治疗进行评估的制剂。
本发明利用树状大分子作为模板,通过硼氢化钠还原法在树状大分子空腔包裹合成金纳米颗粒,得到树状大分子包裹纳米金颗粒;将树状大分子包裹纳米金颗粒表面剩余氨基全部乙酰化处理得到{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs;将Fluo-4的羧基与{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs的羟基反应形成酯键,得到探针{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs。
本发明使用核磁共振氢谱(1H NMR)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、Zeta电势及动态光散射分析(DLS)等手段表征制备的纳米材料({(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs)。然后利用CCK-8法评价纳米材料({(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs)细胞毒性。通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜分别定量和定性观察荧光来评价纳米材料({(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs)在体外对T细胞状态的监测效果。最后通过对裸鼠皮下注射进行CT成像和荧光成像考察纳米材料在体内对T细胞的追踪和状态监测效果,说明书附图1为本发明制备的杂化纳米材料合成及应用示意图。具体测试结果如下:
(1)1H NMR测试结果
参见说明书附图2,图2(a)中,2.3-3.4ppm处的多个峰为G5.NH2的亚甲基特征峰,3.7ppm处的单峰为PEG的亚甲基特征峰。根据积分面积之比计算,每个G5.NH2上连接了13.6个MAL-PEG-OH(其中G5.NH2和MAL-PEG-OH的摩尔投料比为1:20)。图2(b)中,乙酰化反应后,在1.88ppm处出现了乙酰基的甲基特征峰,根据积分面积之比计算,每个G5.NH2表面有68个乙酰基。图2(c)中,6-8ppm范围出现了Fluo-4的芳香环的质子峰,根据积分面积之比计算,表明每个G5.NH2上连接了2.4个Fluo-4。
(2)UV-Vis光谱测试结果
参见说明书附图3,{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs和{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs均在520nm处有金纳米颗粒的表面等离子体共振吸收峰,表明了金纳米颗粒在树状大分子空腔的成功包裹。根据ICP结果计算可知,每个G5.NH2上有25个金原子。根据Free Fluo-4和Fluo-4,AM(商品化Fluo-4探针,Fluo-4的乙酰甲酯衍生物)的紫外吸收光谱对比,{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}在350nm-550nm区间内的吸收值高于{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs的吸收值,可以侧面证明Fluo-4在G5.NH2上的成功连接。
(3)场发射透射电镜(TEM)及Zeta电势和水动力学直径测试结果
参见附图4(a、b、c),TEM测试结果表明,制备的纳米材料中的金纳米颗粒大小在2.0nm左右,大小分布相对集中。Zeta电势测定结果,见表1,G5.NH2-PEG-OH表面电势为+34.7mV,包裹金纳米颗粒后电势为+40.3mV,乙酰化后表面电势降为+6.9mV,酯键共价连接Fluo-4后表面电势为+4.2mV。G5.NH2-PEG-OH、{(Au0)25-G5.NH2-(PEG-OH)14}DENPs、{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs的水合粒径差别不大,分别为205.3、207.1和203.1nm,通过酯键共价连接Fluo-4后水合粒径下降至154.9nm。
(4)X-射线衰减系数测试
参见说明书附图5,分别配置Au浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08M的{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs水溶液,进行CT扫描,见附图5(a),随着浓度增加,CT信号逐渐明亮,将不同浓度的CT数值进行作图,见附图5(b),X-射线衰减系数与其浓度呈线性关系。
(5)细胞毒性实验
说明书附图6显示与不同浓度纳米材料共培养后,当材料浓度达到5μM时,细胞活力仍处于90%以上,说明纳米材料在给定浓度范围内毒性小,细胞相容性良好。
(6)流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测细胞荧光
见说明书附图7和附图8,使用流式细胞术检测活化时间分别为0、4、18h的分别负载{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs和Fluo-4,AM的T细胞的荧光强度,同时使用激光共聚焦显微镜观察上述处理的T细胞的荧光,发现随着活化时间增长,细胞荧光逐渐增强,说明材料可以通过监测钙离子浓度指示出T细胞的活化情况。由附图7(b)可知,负载{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs和负载Fluo-4,AM的T细胞荧光没有显著性差异,说明Fluo-4通过酯键共价键合到树状大分子上后没有影响探针自身的荧光性能,可以用于对T细胞进行状态评估。
(7)体内皮下CT成像和荧光成像结果
将负载{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs的T细胞在裸鼠背部进行皮下注射,进行CT扫描,评价其成像效果,见说明书附图9。在注射5min时,注射部位CT值达到最高,随着T细胞扩散,CT值随之下降。将装有活化0、4、18h的T细胞的EP管直接置于超高分辨率小动物实时成像系统下进行荧光成像,同时将活化18h的负载{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs的T细胞在裸鼠背部进行皮下注射,评价其成像效果,见附图10。活化0、4、18h的T细胞荧光逐渐增强,小鼠注射T细胞后,注射部位的荧光强度也出现了增强,以上结果说明{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs可以通过负载在T细胞上对T细胞进行CT成像和荧光成像,为评估T细胞分布和肿瘤免疫治疗疗效评估提供依据。
有益效果
(1)本发明简单,易于操作分离,原料来源商品化,具有良好的发展前景;
(2)本发明制备得到的树状大分子包裹纳米金颗粒探针,具有良好的水溶性和稳定性,在对T细胞进行状态监测的同时可以通过CT成像对T细胞进行追踪,具有双模态成像效果。
附图说明
图1为本发明制备的纳米材料{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs合成及应用示意图;
图2为实施例1制备的纳米材料(a)G5.NH2-PEG-OH、(b){(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs和(c){(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs的核磁共振氢谱图;
图3为实施例1制备的纳米材料{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs、{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs以及Free Fluo-4、Fluo-4,AM的UV-Vis图谱;
图4为实施例1制备的纳米材料{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs的TEM图(a)(b)和粒径分布直方图(c);
图5为实施例3中不同金浓度的纳米材料{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs的CT成像(a)及不同浓度材料对应的CT值作图(b);
图6为实施例4经不同浓度纳米材料共培养24h后T细胞的细胞活力;
图7为实施例5和对比例1中分别负载了{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs和Fluo-4,AM的不同活化时间的T细胞的流式荧光检测分析图;
图8为实施例5和对比例1中分别负载了{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs(a)和Fluo-4,AM(b)的不同活化时间的T细胞的激光共聚焦显微镜图片;
图9为实施例6中对小鼠皮下注射T细胞后的CT图像(a)和不同时间注射部位对应CT值(b);
图10为实施例6中超高分辨率小动物实时成像系统下对小鼠皮下注射T细胞后的荧光图像(a),活化0、4、18h的T细胞荧光成像(b)和小鼠注射部位不同时间对应相对荧光值(c);
图11为对比例2中Hela细胞的上转换发光成像,(a)用EGTA处理10分钟,然后与SWUCNPs-Fluo-4温育标记的HeLa细胞;(b)SWUCNPs-Fluo-4直接标记的HeLa细胞;(c)用SWUCNPs-Fluo-4孵育1.5小时,然后用ATP处理的HeLa细胞;(d)用毒胡萝卜素预处理10分钟,然后与SWUCNPs-Fluo-4和ATP孵育的HeLa细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。主要试剂来源说明:
实施例1
(1)将22.7mg端基分别为马来酰亚胺和羟基的聚乙二醇(MAL-PEG-OH)溶于2mL超纯水中,逐滴加入末端为氨基的第5代聚酰胺胺树状大分子(G5.NH2)水溶液(12.3mg G5.NH2溶解在1mL超纯水中)水溶液中,反应过夜,透析纯化,将反应液冷冻干燥,即可得到干燥的聚乙二醇化的树状大分子(G5.NH2-PEG-OH)粉末;
(2)取步骤(1)中制备的G5.NH2-PEG-OH 10.0mg溶解于1mL超纯水中,向其中逐滴滴加66.3μL氯金酸(HAuCl4)水溶液(浓度为30mg/mL),搅拌均匀,然后快速加入92.0μL硼氢化钠(NaBH4)水溶液(浓度为10mg/mL),充分还原3h。透析纯化,将反应液冷冻干燥,即可得到干燥的树状大分子包裹纳米金颗粒({(Au0)25-G5.NH2-(PEG-OH)14}DENPs)粉末;
(3)取步骤(2)中制备的{(Au0)25-G5.NH2-(PEG-OH)14}DENPs粉末21.3mg溶解于2mL超纯水中,向其中加入25μL三乙胺(20℃密度为0.726-0.729g/mL)搅拌均匀,然后向反应液中逐滴滴加31.8μL乙酸酐(密度为1.080g/mL),剧烈搅拌过夜。透析纯化,将反应液冷冻干燥,得到乙酰化树状大分子包裹纳米金颗粒({(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs)粉末;
(4)取1.0mg Fluo-4溶解在1mL DMSO中,避光,向其中逐滴滴加1.3mL 1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的DMSO溶液(浓度为1mg/mL)活化30min,将步骤(3)中制得的20.5mg{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs样品粉末充分溶解在2mL DMSO中,逐滴加入含有活化的Fluo-4的反应瓶中,搅拌混合均匀,向其中逐滴滴加100μL 4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶液(浓度为0.41mg/mL)催化酯化反应,剧烈搅拌3天。透析纯化,将反应液冷冻干燥,得到树状大分子包裹纳米金颗粒探针({(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs)粉末。
实施例2
取实施例1制备的G5.NH2-PEG-OH、{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs和{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs溶于氘代水中,使用Bruker400MHz核磁共振仪进行氢谱测试,表征结果见说明书附图2,图2(a)中,2.3-3.4ppm处出现G5.NH2的亚甲基特征峰,3.7ppm处出现PEG的亚甲基特征峰;图2(b)中,乙酰化反应后,在1.88ppm处出现了乙酰基的甲基特征峰;图2(c)中,6-8ppm范围出现了Fluo-4的芳香环的质子峰,根据积分面积之比计算,每个G5.NH2上连接了13.6个MAL-PEG-OH,修饰了68个乙酰基,连接了2.4个Fluo-4探针。取相同浓度的{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs和{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs和相同浓度的Free Fluo-4和Fluo-4,AM进行200-800nm处的全波长UV-Vis扫描,结果见说明书附图3,{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs和{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs均在520nm处有金纳米颗粒的表面等离子体共振吸收峰,表明了金纳米颗粒在树状大分子空腔的成功包裹,根据Free Fluo-4和Fluo-4,AM的紫外吸收光谱对比,{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}在350nm-550nm区间内的吸收值高于{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs的吸收值,可以侧面证明Fluo-4在G5.NH2上的成功连接。分别取1.0mg G5.NH2-PEG-OH、{(Au0)25-G5.NH2-(PEG-OH)14}DENPs、{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs和{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs溶于1mL中测表面电势和水合直径,测试结果见表1。将{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs水溶液直接进行TEM送样测试。TEM表征结果见说明书附图4,TEM测试结果(图4a、b、c)表明,制备的纳米材料中的金纳米颗粒大小在2.0nm左右,大小分布相对集中。
取1.07mg{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs溶于1mL王水中消化2h,然后加入2mL超纯水稀释,使用原子发射光谱(ICP)测试样品的金浓度,根据结果计算,每个G5.NH2上有25个金原子。
表1
表面电势和水合直径测试(表1)结果表明,G5.NH2-PEG-OH表面电势为+34.7mV,包裹金纳米颗粒后电势为+40.3mV,乙酰化后表面电势降为+6.9mV,酯键共价连接Fluo-4后表面电势为+4.2mV;材料G5.NH2-PEG-OH、{(Au0)25-G5.NH2-(PEG-OH)14}DENPs、{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs的水合粒径差别不大,分别为205.3、207.1和203.1nm,通过酯键共价连接Fluo-4后水合粒径下降至154.9nm。
实施例3
取实施例1制备的{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs,配置金浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08M的{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs水溶液进行CT扫描。结果见说明书附图5,图5(a)中,随着浓度增加,CT信号逐渐明亮,将不同浓度的CT数值进行作图,见附图5(b),X-射线衰减系数与其浓度呈线性关系。
实施例4
提取小鼠脾脏的T淋巴细胞,按照50000个细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上,置于5%CO2,37℃条件下孵育过夜。弃掉培养基后,每孔更换90μL无血清RPMI 1640培养基,并添加10μL含不同浓度的材料(最终材料浓度为0.1、0.5、1、2.5、5、10、25μM)和PBS(对照组)。之后将细胞培养板继续放置在5%CO2、37℃继续孵育24小时。随后弃掉原培养基,加入含100μL含有10%CCK-8的新鲜培养基溶液,继续培养4h后,放置在多功能酶标仪中于450nm下测试吸光值,结果如说明书附图6所示,当材料浓度达到5μM时,细胞活力仍处于90%以上,说明纳米材料在给定浓度范围内毒性小,细胞相容性良好。
实施例5
提取小鼠脾脏的T淋巴细胞,按照2×105个细胞每孔的密度接种在48孔细胞培养板上,在正常细胞培养条件(5%CO2、37℃)下,将T细胞分为对照组和活化组,对照组不作处理,活化组的T细胞分别使用佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯(PMA)/离子霉素(Ionomycin)联合刺激0、4、18个小时,在刺激的最后4h添加材料{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs(材料终浓度为2.5μM),收集细胞,使用PBS清洗3遍,部分重悬于冰冷的PBS中于流式细胞仪中上样检测相对荧光强度,剩余部分置于激光共聚焦显微镜下观察荧光。
实施例6
将T细胞与含有2.5μM的{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs的RPMI 1640培养基共孵育4h,收集细胞至1.5mL EP管中,对裸鼠进行背部皮下注射(注射T细胞的数量为5×106个,重悬在100μL生理盐水中),放入CT成像系统中进行扫描。将T细胞使用PMA/Iono活化0、4、18h,在活化的最后4h添加材料{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs(材料终浓度为2.5μM),将细胞收集至1.5mL EP管中。将负载了纳米探针的活化18h的T细胞通过皮下注射到裸鼠背部(注射T细胞的数量为5×106个,重悬在100μL生理盐水中),使用超高分辨率小动物实时成像系统对小鼠进行荧光成像,同时将装有活化不同时间的T细胞的EP管直接置于成像系统下进行荧光成像。CT成像结果见说明书附图9,在注射5min时,注射部位CT值达到最高,随着T细胞扩散,CT值随之下降。荧光成像结果见说明书附图10,活化0、4、18h的T细胞荧光逐渐增强,小鼠注射T细胞后,注射部位的荧光强度也有所增加,以上结果说明{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs可以通过负载在T细胞上对T细胞进行CT成像和荧光成像,为评估T细胞分布和肿瘤免疫治疗疗效评估提供依据。
对比例1
提取小鼠脾脏的T淋巴细胞,按照2×105个细胞每孔的密度接种在48孔细胞培养板上,在正常细胞培养条件(5%CO2、37℃)下,将T细胞分为对照组和活化组,对照组不作处理,活化组的T细胞分别使用佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯(PMA)/离子霉素(Ionomycin)联合刺激0、4、18个小时,在刺激的最后1h添加商品化探针Fluo-4,AM探针(终浓度为6μM),收集细胞,使用PBS清洗3遍,部分重悬于冰冷的PBS中于流式细胞仪中上样检测相对荧光强度,剩余部分置于激光共聚焦显微镜下观察荧光。流式细胞术结果和激光共聚焦观察结果分别见说明书附图7和图8,图7(a)和图8中,随着活化时间增长,负载{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs和Fluo-4,AM的T细胞的荧光逐渐增强,说明材料可以通过监测钙离子浓度指示出T细胞的活化情况;同时由图7(b)可知,负载{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs和负载Fluo-4,AM的T细胞荧光没有显著性差异,说明Fluo-4通过酯键共价键合到树状大分子上后没有影响探针自身的荧光性能,可以用于对T细胞进行状态评估。
对比例2
Li等人(Li Z,Lv S,Wang Y,et al.Journal of America Chemistry Society,2015,137(9):3421-3427)设计了一种夹层结构上转换纳米颗粒SWUCNPs-Fluo-4,该纳米颗粒中将Fluo-4直接标记在SWUCNP的裸露表面上,为Ca2+检测提供了超高灵敏度,构建的纳米探针结构稳定,生物相容性良好,可用于监测小鼠肝细胞的Ca2+并进行成像。但该纳米颗粒的用途与本发明中树状大分子包裹纳米金颗粒探针有显著不同,SWUCNPs-Fluo-4纳米颗粒上标记Fluo-4的目的是为了提高上转换纳米颗粒的发光共振能量转移(LRET)和检测灵敏度,最终应用于细胞和组织成像(见说明书附图11),而本发明材料的优势在于将纳米材料应用于T细胞荧光成像,并可以同时进行CT成像实现双模态成像,为肿瘤免疫治疗效果评估提供重要依据。
Claims (10)
1.一种树状大分子包裹纳米金颗粒探针的制备方法,包括:
(1)将MAL-PEG-OH溶于超纯水中,得到浓度为8-12mg/mL的MAL-PEG-OH溶液,逐滴加入G5.NH2水溶液中反应,透析纯化,冷冻干燥,得到聚乙二醇化的树状大分子G5.NH2-PEG-OH,其中G5.NH2和MAL-PEG-OH的摩尔比为1:20;
(2)将步骤(1)中G5.NH2-PEG-OH溶解于超纯水中,得到浓度为8-12mg/mL的G5.NH2-PEG-OH溶液,滴加氯金酸水溶液,搅拌均匀,加入硼氢化钠水溶液,还原反应,透析纯化,冷冻干燥,得到树状大分子包裹纳米金颗粒{(Au0)25-G5.NH2-(PEG-OH)14}DENPs,其中G5.NH2-PEG-OH、氯金酸与硼氢化钠的摩尔比为1:25:122-128;
(3)将步骤(2)中{(Au0)25-G5.NH2-(PEG-OH)14}DENPs溶解于超纯水中,得到浓度为8-12mg/mL的DENPs溶液,加入三乙胺溶液,搅拌均匀,然后滴加乙酸酐溶液,搅拌过夜,透析纯化,冻干燥,得到乙酰化树状大分子包裹纳米金颗粒{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs,其中{(Au0)25-G5.NH2-(PEG-OH)14}DENPs、三乙胺和乙酸酐的摩尔比为1:100:100~1:120:100;
(4)将Fluo-4溶解在溶剂中,得到浓度为0.8-1.2mg/mL的Fluo-4溶液,避光,经EDC活化,加入步骤(3)中{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs的溶液,搅拌均匀,加入DMAP溶液,酯化反应,透析纯化,冷冻干燥,得到树状大分子包裹纳米金颗粒探针{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2}DENPs,其中{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs、Fluo-4、EDC和DMAP的摩尔比为1:3.5:7-10:0.7-1.2。
2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述步骤(1)中反应为室温反应过夜。
3.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述步骤(1)中G5.NH2水溶液的浓度为8-13mg/mL。
4.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述步骤(2)中氯金酸水溶液浓度为28-32mg/mL;硼氢化钠水溶液浓度为8-12mg/mL。
5.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述步骤(2)中还原反应温度为室温,还原反应时间为3-5h。
6.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述步骤(4)中溶剂为DMSO;{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG-OH)14}DENPs的溶液的溶剂为DMSO,浓度为8-12mg/mL。
7.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述步骤(4)中活化时间为0.3-0.6h;酯化反应温度为室温,酯化反应时间为70-75h。
8.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述步骤(1)、(2)、(3)、(4)中透析为:用截留分子量为8000-14000的纤维素透析膜在超纯水2L×3中透析3天。
9.一种如权利要求1所述方法制备得到的树状大分子包裹纳米金颗粒探针。
10.一种如权利要求1所述方法制备得到的树状大分子包裹纳米金颗粒探针在制备T细胞追踪和状态评估的制剂中的应用。
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