CN102153871A

CN102153871A - mPEG修饰的树状大分子/金纳米粒子的制备方法

Info

Publication number: CN102153871A
Application number: CN 201110046612
Authority: CN
Inventors: 史向阳; 彭琛
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2011-02-25
Filing date: 2011-02-25
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2031-02-25
Also published as: CN102153871B

Abstract

本发明涉及一种mPEG修饰的树状大分子/金纳米粒子的制备方法，包括：(1)用mPEG-MAL修饰树状大分子，透析，冷冻干燥得固体；(2)取上述固体，用甲醇或水将其溶解，再加入氯金酸溶液，搅拌后加入NaBH₄溶液，室温反应；再加入三乙胺，乙酸酐，反应结束后，将反应产物透析，冷冻即得。本发明提高了金和树状大分子之间的摩尔比，降低了材料的成本，同时提高了金纳米粒子的稳定性，并成功地应用于小鼠的活体成像；本发明的方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。

Description

mPEG修饰的树状大分子/金纳米粒子的制备方法

技术领域

本发明属金纳米粒子的制备领域，特别是涉及一种mPEG修饰的树状大分子/金纳米粒子的制备方法。

背景技术

贵重金属纳米粒子(NPs)，如Au NPs和Ag NPs由于其独特的光学、电子和量子尺寸相关的性能，在医学领域的应用引起了相当大的科学和技术上的关注，尤其是在生物传感、疾病的诊断、光热疗法以及药物和基因传递领域。在众多的以聚合物辅助合成的Au DENPs的实例中，以树状大分子为模板或稳定剂合成的纳米粒子已经引起人们大量的关注。这主要是由于这种新型的、高度支化的和单分散的合成性树状大分子的独特结构和性能。树状大分子可定制的表面化学性能，容许研究者轻松地在其表面修饰用于不同生物医学领域的生物功能团。例如，端基为氨基的树状大分子包裹的金纳米颗粒(Au DENPs)可以进一步用染料(如荧光素染料)和靶向配体分子(如叶酸、RGD多肽)官能化，用于特异性地检测癌细胞(Shi et al.，Small 2007，3，1245-1252)。一股情况下，以树状大分子为模板或稳定剂功能化金或银纳米颗粒往往涉及两个步骤：1)功能化树状大分子；2)合成金属纳米颗粒。这两个步骤的顺序可以根据与颗粒胶体稳定性和复合物的最终应用有关的技术过程颠倒过来。在某些特殊情况下，颗粒的功能化和合成可通过一个步骤同时实现。

据了解，预先功能化的树状大分子可以用来作为模板来包裹金纳米颗粒(Au DENPs)(Shukla et al.，Soft Matter 2008，4，2160-2163)。对于聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子作为模板形成的Au DENPs来说，由于PAMAM末端的大量氨基的存在使得材料带有正电性，具有一定的生物毒性。最近的报导表明，乙酰化的Au DENPs可以作为医用造影剂用于活体成像，但是，乙酰化在消除PAMAM材料正电性的同时降低了PAMAM对Au的稳定作用，使得Au DENPs在Au/PAMAM＞50时，稳定性大幅下降，需要加入额外的保护剂才能很好的存储，在一定程度上限制了Au DENPs的应用。这意味着，如何通过适当地修饰树状大分子表面，使其对Au NPs达到很好的模板和稳定作用，从而提高材料的稳定性，降低成本和生物毒性是目前需要解决的关键问题。

PEG(聚乙二醇)由于其独特的物理化学性质受到了人们广泛的关注。近年来，PEG系列产品被广泛应用于药剂的制备中，其中相对分子量较低的聚乙二醇可用作溶剂、助溶剂、o/w型乳化剂和稳定剂，用于制作水悬剂、乳剂、注射剂等，也用作水溶性软膏基质和栓剂基质，相对分子量高的固体蜡状聚乙二醇常用于增加低分子量液体的粘度和成固性。对于水中不易溶解的药物，由于PEG具有很好的水溶性，也能溶于多种有机溶剂，可被用作增溶剂。同时，PEG可作固体分散剂的载体，以达到固体分散目的。在细胞工程中普遍认为PEG分子能改变各类细胞的生物膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，在近代微生物细胞融合技术中常被用作细胞融合剂。

目前mPEG(聚乙二醇单甲醚)修饰的不同摩尔配比的聚酰胺-胺树状大分子包裹的金纳米粒子的制备方法还未见相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种mPEG修饰的树状大分子/金纳米粒子的制备方法，该方法提高了金和树状大分子之间的摩尔比，降低了材料的成本，同时提高了金纳米粒子的稳定性，并成功地应用于小鼠的活体成像；本发明的方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。

本发明的一种mPEG修饰的树状大分子/金纳米粒子的制备方法，包括：

(1)用10mL的二甲亚砜溶液溶解干重为20～30mg的树状大分子，然后边搅拌边滴加溶于5mL二甲亚砜溶液的干重为30.94～46.41mg的mPEG-MAL，反应60～80h，随后将反应产物用透析膜在缓冲溶液和超纯水中透析，最后将纯化后的产物冷冻干燥得固体；

(2)取步骤(1)所得固体，用甲醇或水将其溶解后，再加入氯金酸溶液，然后在室温下搅拌20～40min，加入NaBH₄溶液，在室温下搅拌反应1.5～2.5h；接着再加入三乙胺，搅拌混合20～40min后向反应液中加入乙酸酐，在室温下搅拌反应20～28h，随后将反应产物用透析膜在缓冲溶液和超纯水中透析，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到mPEG修饰的树状大分子/金纳米粒子。

所述步骤(1)中的mPEG-MAL为一端被马来酰亚胺活化的聚乙二醇单甲醚；树状大分子为第5代聚酰胺-胺型PAMAM树状大分子(Dendritech Inc.，Midland，MI，USA)；mPEG-MAL/树状大分子(摩尔比)＝20∶1；透析膜为纤维素透析膜(MWCO＝10000)；缓冲溶液为PBS(磷酸盐)缓冲溶液。

所述步骤(1)或(2)中透析的过程为逐次在PBS缓冲溶液4L中透析2～4次和超纯水4L中透析2～4次，每次6-10h，透析3天。

所述步骤(2)中的氯金酸溶液为10mg/mL的HAuCl₄甲醇溶液或10mg/mL的HAuCl₄水溶液。

所述步骤(2)中加入的NaBH₄溶液中NaBH₄的摩尔量与金的摩尔量之比为5/1，NaBH₄溶液为NaBH₄的H₂O/CH₃OH溶液，H₂O与CH₃OH体积比的为2∶1；所加入的三乙胺与树状大分子的摩尔比为550∶1，所加入的乙酸酐与树状大分子的摩尔比为550∶1。

所述步骤(2)中的透析膜为纤维素透析膜(MWCO＝10000)，缓冲溶液为PBS缓冲溶液。

所述步骤(2)得到mPEG修饰的树状大分子/金纳米粒子为{(Au⁰)_n-G5.NHAc-PEG}DENPs，其中n选自50～400的整数。

所述步骤(2)得到mPEG修饰的树状大分子/金纳米粒子为{(Au⁰)_n-G5.NHAc-PEG}DENPs，其中n为50、100、150、200、250、300、350或400。

本发明的一种mPEG修饰的树状大分子/金纳米粒子用于CT成像。

本发明使用介质辅助的激光脱附离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF)、核磁共振谱(NMR)、紫外-可见分光光度计(UV-Vis)、透射电子显微镜(TEM)测量等方法表征本发明制备的树状大分子或纳米颗粒，同时用Micro-CT测试来检验PEG修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹的金纳米粒子的小鼠活体成像效果，具体测试结果如下：

(1)介质辅助的激光脱附离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF)

通过MALDI-TOF分析，发现mPEG修饰的第5代聚酰胺-胺树状大分子(G5.NH₂-mPEG)的分子量为58650，和原材料G5.NH₂的分子量(25860)相比，每个树状大分子表面取代了16.4个PEG。见附图1。

(2)NMR谱

核磁共振氢谱结果证实了{(Au⁰)_n-G5.NHAc-mPEG}DENPs的结构正确，见附图2。

(3)紫外-可见光分光光度计的测试结果

在水溶液中合成的{(Au⁰)_n-G5.NHAc-mPEG}DENPs在510nm左右都有一个特征吸收峰，这是由于金纳米颗粒的表面等离子体共振峰，参见附图3；mPEG修饰的树状大分子包裹的Au NPs能稳定分散在水中，即使在乙酰化修饰后，材料在不同的pH值(pH＝5.0-8.0)和不同温度(4℃-50℃)范围内均具有非常好的稳定性，说明mPEG修饰的PAMAM不仅允许我们大大提高了Au/PAMAM的摩尔比，还对生成的AuNPs起到了非常好的稳定作用，参见附图4和附图5；

(4)透射电子显微镜测量

在水中合成的{(Au⁰)_n-G5.NHAc-mPEG}DENPs的TEM图片和粒度分布直方图(参见附图6)，表明形成的{(Au⁰)_n-G5.NHAc-mPEG}DENPs纳米颗粒相当均匀，粒径分布在较窄的范围内(2-4nm)。同时也表明金纳米颗粒尺寸大小可通过改变树状大分子/Au摩尔比来控制。

{(Au⁰)₁₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs的高分辨TEM图片(见附图7b)和选区电子衍射图(SAED模式)表明{(Au⁰)₁₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs金纳米颗粒高度晶化。(111)、(200)、(220)和(311)环说明{(Au⁰)₁₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs金纳米颗粒呈面心立方(FCC)晶体结构(见附图7c)。{(Au⁰)₁₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs的EDS谱则证实金元素的存在；见附图7d。

(5)小鼠活体血管成像

将500μL的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs([Au]＝0.5mol/L)尾部静脉注射进体重为30g的小鼠体内，通过Micro-CT扫描检测得到的图片(图8)，从图中能够清楚地看到小鼠的下腔静脉和肾静脉，且小鼠未发现死亡，证明本方法合成的{(Au⁰)_n-G5.NHAc-mPEG}DENPs具有较低的生物毒性和较好的CT成像效果。

通过用mPEG修饰第5代的树状大分子(G5 PAMAM)和氯金酸混合后，可在室温下经原位还原合成金纳米颗粒，且乙酰化修饰降低材料生物毒性的同时未对材料的稳定性产生明显影响，同时，生成的Au NPs尺寸分布较窄，形态均一，具有良好的稳定性和CT成像效果，这一点对于用于不同医学领域所需要的可定制的金属纳米颗粒表面功能化非常重要。

有益效果

(1)本发明方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景；

(2)本发明设计合成的mPEG协助树状大分子包裹稳定化的金纳米颗粒的材料，很大程度上提高了金和树状大分子之间的摩尔比，降低了材料的成本，同时提高了金纳米粒子的稳定性，并成功地应用于小鼠的活体成像。

(3)本发明的树状大分子/金纳米粒子能够长时间地分散在溶液中，没有团聚现象发生，所合成的纳米颗粒的尺寸大小可控制，且具有较低的生物毒性、较高的X-射线衰减强度和较好的CT成像效果，使它们具有了应用于各种生物医学领域的前景。

附图说明

图1为本发明制备的G5.NHAc-mPEG树状大分子的MALDI-TOF谱图。

图2为本发明制备的G5.NH₂-mPEG树状大分子(a)和{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs(b)的核磁共振氢谱图。

图3为本发明制备的{(Au⁰)_n-G5.NHAc-mPEG}DENPs(n＝50、100、150、200、250、300、350、400)在25℃、pH＝6.0时的紫外吸收光谱图。

图4为本发明制备的{(Au⁰)_n-G5.NHAc-mPEG}DENPs(n＝50(1)，100(2)，150(3)，200(4)，250(5)，300(6)，350(7)，400(8))在不同pH值时的紫外吸收光谱图(a)pH＝5.0；(b)pH＝7.0；(c)pH＝8.0。

图5为本发明制备的{(Au⁰)_n-G5.NHAc-mPEG}DENPs(n＝50(1)，100(2)，150(3)，200(4)，250(5)，300(6)，350(7)，400(8))在不同温度时的紫外吸收光谱图(a)4℃；(b)37℃；(c)50℃。

图6为本发明制备的{(Au⁰)_n-G5.NHAc-mPEG}DENPs(n＝100(a)、200(c)、300(e)、400(g))的TEM图片和粒径分布直方图(n＝100(b)、200(d)、300(f)、400(h))。

图7为本发明制备的{(Au⁰)₁₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs的(a)TEM图片(b)高分辨率TEM图片；(c)选区电子衍射图；(d)能量分散(EDS)谱。

图8.500μL的{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs([Au]＝0.1mol/L)尾部静脉注射进小鼠体内，通过Micro-CT扫描检测得到的CT图片

图9本发明反应方程式简图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)用10mL的DMSO溶液溶解干重为30.00mg的G5PAMAM树状大分子，边搅拌边滴加溶于5mLDMSO溶液的干重为46.41mg的mPEG-MAL，其中mPEG-MAL/树状大分子(摩尔比)＝20∶1，反应72小时，随后将反应产物用纤维素透析膜(MWCO＝10000)逐次在PBS缓冲溶液4L中，透析3次和超纯水4L中，透析3次，每次6h，最后将纯化后的产物冷冻干燥得G5.NH₂-mPEG；

(2)取步骤(1)干燥后固体5.00mg溶于甲醇中，取0.176mL的10mg/mL的HAuCl₄甲醇溶液混合，在室温下搅拌20min，溶液变成浅黄色，随后加入0.807mL的1mg/mL的NaBH₄溶液(H₂O∶CH₃OH(体积比)＝2∶1)，溶液瞬间变成深红色，在室温下搅拌反应2h；向步骤(2)的反应液中加入7.53μL三乙胺，搅拌反应20min后向反应液中加入4.92μL乙酸酐，在室温下搅拌反应20h，随后将反应产物用纤维素透析膜(MWCO＝10000)逐次在PBS缓冲溶液4L中，透析3次和超纯水4L中透析3次，每次8h，透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到mPEG修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹的金纳米粒子{(Au⁰)₅₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs。

实施例2

(1)用10mL的DMSO溶液溶解干重为20.00mg的G5PAMAM树状大分子，边搅拌边滴加溶于5mLDMSO溶液的干重为30.94mg的mPEG-MAL，其中mPEG-MAL/树状大分子(摩尔比)＝20∶1，反应72小时，随后将反应产物用纤维素透析膜(MWCO＝10000)逐次在PBS缓冲溶液4L中，透析4次和超纯水4L中，透析2次，每次8h，最后将纯化后的产物冷冻干燥得G5.NH₂-mPEG；

(2)取步骤(1)干燥后固体5.00mg溶于水中，取0.351mL的10mg/mL的HAuCl₄水溶液混合，在室温下强力搅拌30min，溶液变成浅黄色，随后加入1.613mL的1mg/mL的NaBH₄溶液(H₂O∶CH₃OH(体积比)＝2∶1)，溶液瞬间变成深红色，在室温下强力搅拌反应2h；向步骤(2)的反应液中加入7.53μL三乙胺，搅拌反应30min后向反应液中加入4.92μL乙酸酐，在室温下强力搅拌反应24h，随后将反应产物用纤维素透析膜(MWCO＝10000)逐次在PBS缓冲溶液4L中透析2次和超纯水4L中透析4次，每次6h，透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到mPEG修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹的金纳米粒子{(Au⁰)₁₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs。

实施例3

(1)用10mL的DMSO溶液溶解干重为20.00mg的树状大分子，边搅拌边滴加溶于5mLDMSO溶液的干重为30.94mg的mPEG-MAL，其中mPEG-MAL/树状大分子(摩尔比)＝20∶1，反应60小时，随后将反应产物用纤维素透析膜(MWCO＝10000)逐次在PBS缓冲溶液4L中，透析3次和超纯水4L中，透析3次，每次10h，最后将纯化后的产物冷冻干燥得G5.NH₂-mPEG；

(2)取步骤(1)干燥后固体5.00mg溶于甲醇中，取0.702mL的10mg/mL的HAuCl₄水溶液混合，在室温下强力搅拌30min，溶液变成浅黄色，随后加入3.235mL的1mg/mL的NaBH₄溶液(H₂O∶CH₃OH(体积比)＝2∶1)，溶液瞬间变成深红色，在室温下强力搅拌反应2h；向步骤(2)的反应液中加入7.53μL三乙胺，搅拌反应30min后向反应液中加入4.92μL乙酸酐，在室温下强力搅拌反应24h，随后将反应产物用纤维素透析膜(MWCO＝10000)逐次在PBS缓冲溶液4L中透析3次和超纯水4L中透析3次，每次8h，透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到mPEG修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹的金纳米粒子{(Au⁰)₂₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs。

实施例4

(1)用10mL的DMSO溶液溶解干重为20.00mg的树状大分子，边搅拌边滴加溶于5mLDMSO溶液的干重为30.94mg的mPEG-MAL，其中mPEG-MAL/树状大分子(摩尔比)＝20∶1，反应78小时，随后将反应产物用纤维素透析膜(MWCO＝10000)逐次在PBS缓冲溶液4L中，透析2次和超纯水4L中，透析4次，每次8h，最后将纯化后的产物冷冻干燥得G5.NH₂-mPEG；

(2)取步骤(1)干燥后固体5.00mg溶于水中，取1.053mL的10mg/mL的HAuCl₄甲醇溶液混合，在室温下搅拌30min，溶液变成浅黄色，随后加入0.484mL的10mg/mL的NaBH₄溶液(H₂O∶CH₃OH(体积比)＝2∶1)，溶液瞬间变成深红色，在室温下搅拌反应2h；向步骤(2)的反应液中加入7.53μL三乙胺，搅拌反应30min后向反应液中加入4.92μL乙酸酐，在室温下搅拌反应24h，随后将反应产物用纤维素透析膜(MWCO＝10000)逐次在PBS缓冲溶液4中透析3次和超纯水4L中透析3次，每次6h，透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到mPEG修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹的金纳米粒子{(Au⁰)₃₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs。

实施例5

(1)用10mL的DMSO溶液溶解干重为20.00mg的树状大分子，边搅拌边滴加溶于5mLDMSO溶液的干重为30.94mg的mPEG-MAL，其中mPEG-MAL/树状大分子(摩尔比)＝20∶1，反应80小时，随后将反应产物用纤维素透析膜(MWCO＝10000)逐次在PBS缓冲溶液4L中，透析3次和超纯水4L中，透析3次，共透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得G5.NH₂-mPEG；

(2)取步骤(1)干燥后固体5.00mg溶于甲醇中，取1.404mL的10mg/mL的HAuCl₄甲醇溶液混合，在室温下搅拌40min，溶液变成浅黄色，随后加入0.645mL的10mg/mL的NaBH₄溶液(H₂O∶CH₃OH(体积比)＝2∶1)，溶液瞬间变成深红色，在室温下搅拌反应2h；向步骤(2)的反应液中加入7.53μL三乙胺，搅拌反应40min后向反应液中加入4.92μL乙酸酐，在室温下搅拌反应28h，随后将反应产物用纤维素透析膜(MWCO＝10000)逐次在PBS缓冲溶液4L中透析2次和超纯水4L中透析4次，每次10h，透析3天，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到mPEG修饰的聚酰胺-胺树状大分子包裹的金纳米粒子{(Au⁰)₄₀₀-G5.NHAc-mPEG}DENPs。

Claims

1.一种聚乙二醇单甲醚修饰的树状大分子/金纳米粒子的制备方法，包括：

(1)用10mL的二甲亚砜溶液溶解干重为20～30mg的树状大分子，然后边搅拌边滴加溶于5mL二甲亚砜溶液的干重为30.94～46.41mg的一端被马来酰亚胺活化的聚乙二醇单甲醚，反应60～80h，随后将反应产物用透析膜在缓冲溶液和超纯水中透析，最后将纯化后的产物冷冻干燥得固体；

(2)取步骤(1)所得固体，用甲醇或水将其溶解后，再加入氯金酸溶液，然后在室温下搅拌20～40min，加入NaBH₄溶液，在室温下搅拌反应1.5～2.5h；接着再加入三乙胺，搅拌混合20～40min后向反应液中加入乙酸酐，在室温下搅拌反应20～28h，随后将反应产物用透析膜在缓冲溶液和超纯水中透析，最后将纯化后的产物冷冻干燥得到聚乙二醇单甲醚修饰的树状大分子/金纳米粒子。

2.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇单甲醚修饰的树状大分子/金纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的树状大分子为第5代聚酰胺-胺型树状大分子；一端被马来酰亚胺活化的聚乙二醇单甲醚与树状大分子的摩尔比为20∶1；透析膜为纤维素透析膜MWCO＝10000；缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。

3.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇单甲醚修饰的树状大分子/金纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的氯金酸溶液为10mg/mL的HAuCl₄甲醇溶液或10mg/mL的HAuCl₄水溶液。

4.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇单甲醚修饰的树状大分子/金纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中加入的NaBH₄溶液中NaBH₄的摩尔量与金的摩尔量之比为5/1，NaBH₄溶液为NaBH₄的H₂O/CH₃OH溶液，H₂O与CH₃OH体积比的为2∶1；所加入的三乙胺与树状大分子的摩尔比为550∶1，所加入的乙酸酐与树状大分子的摩尔比为550∶1。

5.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇单甲醚修饰的树状大分子/金纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的透析膜为纤维素透析膜MWCO＝10000，缓冲溶液为PBS磷酸盐缓冲溶液。

6.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇单甲醚修饰的树状大分子/金纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)得到聚乙二醇单甲醚修饰的树状大分子/金纳米粒子为{(Au⁰)_n-G5.NHAc-PEG}DENPs，其中n选自50～400的整数。

7.根据权利要求1或7所述的一种聚乙二醇单甲醚修饰的树状大分子/金纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)得到聚乙二醇单甲醚修饰的树状大分子/金纳米粒子为{(Au⁰)_n-G5.NHAc-PEG}DENPs，其中n为50、100、15.、200、250、300、350或400。