CN104258425B - 一种rgd修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法，以乙酰丙酮铁为反应原料和前驱物，油胺为表面活性剂和还原剂，二苄醚为溶剂制备超小磁性氧化铁纳米颗粒；利用多巴胺化的HOOC‑PEG‑COOH对纳米颗粒表面包裹的油胺分子进行替换，实现纳米颗粒表面的PEG化修饰；最后通过PEG末端的游离羧基化学偶联RGD环肽，得到RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒。本发明中合成超小磁性氧化铁纳米颗粒的方法具有工艺简单，原料转化率高、可重复性强等特点，合成出的磁性氧化铁纳米颗粒具有形貌规则、尺寸超小、稳定性好、单分散性良好、生物相容性高、具有肿瘤特异性靶向等特点，可用作具有肿瘤主动靶向功能的T₁加权成像高性能磁共振造影剂。

Description

一种RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法及其 应用

技术领域

本发明涉及生物医用纳米材料技术领域，具体涉及一种RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法。

背景技术

磁性氧化铁纳米颗粒在生物医药领域有着极为重要的影响，尤其是在磁共振造影及分子影像技术方面存在着巨大的潜在应用价值。众所周知，肿瘤的临床诊疗需要建立微小肿瘤的早期诊断手段，而发展获取分子及生理层面个体化信息的相关技术方法成为解决此问题的关键。就目前看，肿瘤分子影像技术的发展仍然强烈地取决于分子影像探针技术的发展，磁性氧化铁纳米颗粒以其独特的物理性质及良好的生物安全性，不仅可以用作灵敏度更高的磁共振造影剂，还为多功能、智能化肿瘤磁共振分子影像探针的构建提供了一个良好的材料平台。近些年一些研究表明，在肿瘤的发生发展的各个阶段，肿瘤细胞或其周围新生血管内皮细胞膜表面常常会高度表达某些特征分子，其中一些特征分子已经被证明可以作为标志物用于肿瘤的早期诊断。因此，将医学影像学技术与探测肿瘤细胞表面的特异性分子标志物相结合，会推动形成了具备更高特异性的肿瘤分子影像诊断技术。而针对肿瘤细胞表面的肿瘤相关标志物的检测，以磁性纳米颗粒为核心构建相关分子影像探针还需要磁性氧化铁纳米颗粒表面具有可反应官能基团。通过这些可反应官能基团将肿瘤靶向分子通过共价键偶联于纳米颗粒表面，进而获得可通过靶向分子与靶点间特异性识别作用进行肿瘤成像的分子影像探针。与被动靶向模式相比，基于主动靶向模式的肿瘤分子影像技术在肿瘤早期诊断与鉴别诊断方面表现出更大的技术优势。随着纳米颗粒制备技术的飞速发展，围绕磁性氧化铁纳米颗粒构建的肿瘤分子影像探针及相关肿瘤成像技术已经成为针对肿瘤分子影像研究的重要热点。

恶性肿瘤的早期诊断是提高患者生存率、改善生活质量的关键，是恶性肿瘤研究面临的最基本的科学问题，同时也是肿瘤临床诊疗所面临的最重要的难题。发展具有先进功能的磁性纳米颗粒影像探针，以安全无创和原位实时的方式建立针对肿瘤早期诊断的分子影像技术，发展与恶性肿瘤转移预警及疗效预测相关的动态可视化方法，符合肿瘤个体化治疗这一肿瘤诊疗的终极目标，也将是肿瘤临床诊断的必然发展趋势。

在制备高性能磁性氧化铁纳米颗粒的技术中，高温热分解法是一类可以得到良好单分散性和稳定性纳米颗粒的常用方法。从化学合成原理上讲，高温热分解法摒弃了铁离子的水解反应，转而通过于高沸点非极性或弱极性溶剂的反应介质中，以有机铁盐或有机铁配合物为反应前驱物来实现磁性纳米颗粒的制备。尽管铁前驱体的热分解反应非常复杂，但更高的反应温度有利于大大提高产物的结晶度，从而进一步提高了磁性氧化铁纳米颗粒的磁响应特性。而无水参与的热解反应不仅有利于实现纳米颗粒表面修饰的多样性，同时也有利于获得窄粒度分布的磁性纳米颗粒。总而言之，相对于在水体系中制备的纳米颗粒，通过热分解反应在非水体系中制备得到的磁性氧化铁纳米颗粒具有更好的磁响应特性、更均一的形貌以及更好的单分散性。在高温热解法制备磁性氧化铁纳米颗粒的方法中，常使用的反应前驱物主要有三种：五羰基铁(Fe(CO)₅)，油酸铁(Fe(oleate)₃)和乙酰丙酮铁(Fe(acac)₃)。其中，以五羰基铁为前驱体制备得到的磁性氧化铁纳米颗粒具有较好的单分散性，磁学性质也较为优越，但原料毒性较大，不适用于较大规模的生产；而以油酸铁为前驱物制备得到的磁性氧化铁纳米颗粒单分散性也较良好，但由于油酸铁性状为粘稠半固体，使得其合成、保存及称量都较为繁琐。而以乙酰丙酮铁为前驱物制备磁性氧化铁纳米颗粒的方法中，原料乙酰丙酮铁的毒性较低，而且通过调节反应过程中纳米颗粒的生长时间，可以制备得到单分散性良好、粒径可控的磁性氧化铁纳米颗粒。总之，利用高温热分解方法所制备得到的磁性氧化铁纳米颗粒，较采用传统水解方法得到的纳米颗粒表现出如下优势：(1)结晶度更高、磁响应性更强；(2)纳米颗粒的单分散性更好；(3)颗粒形态更为规则。因此，高温热分解法以其生产优势正在掀起磁性氧化铁纳米颗粒在生物医学材料学领域中应用的新一轮研究热潮。

尽管高温热分解法在单分散磁性氧化铁纳米颗粒的可控制备中占据了极大优势，但也存在其局限性。通过这种方法制备得到的纳米颗粒表面均修饰有疏水性配体，如:油酸、油胺等，因此只能分散于非极性有机溶剂中，从而大大限制了其在生物医学领域中的应用。为了拓宽其在生物医学领域的应用范围，在后续反应中需要对纳米颗粒进行水溶性的表面修饰，因此表面配体置换方法及相转移方法被分别应用于实现上述磁性纳米颗粒的水溶性。

表面配体置换方法需要应用与铁离子具有更强配位能力的水溶性配体来置换纳米颗粒表面修饰的疏水性配体，进而实现纳米颗粒的水溶性。例如，采用2，3-二巯基丁二酸(DMSA)交换纳米颗粒表面的疏水性配体可以制备出在水中及PBS中溶解并稳定分散的Fe₃O₄纳米颗粒。配体置换法的主要特点是得到的纳米颗粒水动力尺寸相对较小，但对配体置换效率及程度的控制较为困难。相较于表面配体置换方法，相转移方法是相转移剂利用其一端的疏水链与颗粒表面修饰的疏水性配体间的疏水相互作用而结合，通过其另一端的亲水链来实现油溶性纳米颗粒向水介质中的转移。PEG磷脂衍生物(DSPE-mPEG 2000)是一种常见的相转移剂，常利用其将油溶性Fe₃O₄纳米颗粒转移到水相。尽管采用大分子表面活性剂通过相转移方法得到的水溶性纳米颗粒能够在水介质中表现出很好的胶体稳定性，然而，磁性氧化铁纳米颗粒在MRI成像中的对比度增强作用是通过改变氢质子弛豫过程来实现的，而上述作用强烈地依赖于氢质子与磁性纳米颗粒间的距离。鉴于磁偶极耦合常数与距离的三次方成反比，相转移方法在颗粒周围引入的疏水层无疑增加了纳米颗粒与氢质子间的距离，降低了磁性纳米颗粒的MRI造影增强效果，阳性对比功能将大大降低。此外，相转移方法还将无谓地增加纳米颗粒的水动力尺寸，使得其易被生物体内的网状内皮系统所截留，进而影响磁性纳米颗粒在体内的分布行为及血液循环行为。

近些年来，随着磁共振成像技术的不断深入发展，人们发现其具有空间分辨率高、软组织对比度明显、无电离辐射损害和可进行功能成像等优点，是临床疾病诊断的最有效措施之一。但常规MRI成像灵敏度较低，往往需要造影剂进行辅助诊断。MRI造影剂通过缩短弛豫时间、增加弛豫速率，提升了成像对比度，从而可以有效提高MRI诊断的灵敏性。因此，开发安全、高效MRI造影剂已成为核磁共振成像领域亟待解决的一个问题。

目前，常见的磁共振造影剂主要分为两类，即超顺磁性造影剂和顺性造影剂。超顺磁性造影剂有很好的T₂加权成像的对比增强效果，因此超顺磁性造影剂又被称为T₂造影剂。目前的T₂造影剂主要以磁性氧化铁纳米颗粒为主，该类造影剂利用纳米粒子的强磁矩引起MR中局部磁场的不均匀性，从而缩短该区域的横向弛豫时间(T₂)，使得该区域MRI图像信号变暗。同时，以磁性氧化铁纳米颗粒为核心的T₂造影剂的检测灵敏度可高达10^-9mol·L^-1。因此，磁性氧化铁纳米颗粒以其优异的体内安全性、肿瘤组织特异性及高磁敏感性，已经成为构建新型磁共振造影剂的首选材料。

与超顺磁性造影剂不同，顺磁性造影剂利用水质子与造影剂离子中的电子自旋相互作用，可有效缩短该区域的纵向弛豫时间(T₁)，从而实现T₁加权像的对比增强(MRI图像信号变亮)，因此又被成为T₁造影剂。相比T₂造影剂，T₁造影剂在成像方式上有其特有的优点：首先，在进行MRI T₂加权成像时，MRI中的暗信号会使得病变组织与某些正常组织难以分辨(体内血液、钙化灶、金属沉积物等正常组织的MRI T₂加权信号很弱)，易造成假阳性的诊断结果，而在T₁加权像中，正常组织与富集了T₁造影剂的病变组织间的MRI T₁加权信号的对比则表现得相当明显，使得疾病的误诊率大大下降；其次，在MRI T₂加权像中，由于磁性纳米颗粒能够显著影响局部磁场强度，因此富集T₂造影剂的区域往往会出现一种“重染效果”，出现这种现象的后果是扩大T₂加权图像中病变组织的实际范围，导致诊断图像变得模糊不清，从而给某些疾病的精确诊断带来不便。T₁造影剂主要采用顺磁类金属离子，如Gd(III)、Mn(II)和Fe(III)等，但临床应用最为广泛的是Gd(钆)的有机金属配合物，如Gd-DTPA(二乙基三胺五乙酸，DTPA)在临床上被广泛用于血管造影，因此又被称为血池造影剂。正常情况下，Gd配合物造影剂不能通过血脑屏障(blood-brain-barrier，BBB)，但是由于肿瘤血管通透性增加，因此Gd配合物造影剂可以用于脑肿瘤造影。Gd-DTPA的临床注射计量为0.1～0.3mmol·kg^-1BW(body weight，体重)，血液半衰期为90min左右，24h的体内清除率在90％以上，主要清除途径是肾脏。溶液中自由的Gd离子具有非常高的毒性，但与有机配体结合后，其毒性大大降低。但最近美国FDA已发布关于含Gd类造影剂的公共卫生警告，警告Gd类造影剂可能导致肾源性纤维化(nephrogenic systemicfibrosis)疾病。因此，开发新一代低毒性T₁造影剂成为近些年来研究的热点。

超小磁性氧化铁纳米颗粒亦为超顺磁性的，但由于具有更小的尺寸和更大的比表面积以及极好的水溶性和单分散性，使得其T₂造影效果减弱。但是能够在磁共振过程中较大程度地改变纳米颗粒周围水质子的纵向弛豫过程，有效缩短该区域的纵向弛豫时间(T₁)，具备了T₁造影剂的相关功能，并已在小鼠肿瘤模型的磁共振造影上取得了良好的结果。相比于Gd(III)，Fe(III)具有更好的生物安全性，且能够在生物体内达到更长时间的循环，实现高分辨率MRI诊断图像的构建等等，这些优点都为T₁造影剂的研究发展提供了新的材料基础。

高性能超小磁性氧化铁纳米颗粒作为T₁造影剂一般要求具有高的纵向弛豫率(r₁)和低的横向弛豫率(r₂)以及低的r₂/r₁比值(≤5)，其可以作为一种性质优良的具备T₁加权成像对比功能的磁共振阳性造影剂，能够进一步提高软组织的分辨率，也使一些微小病灶显影更加清晰，极大推动了肿瘤定位和精确控制等方向的发展。

在纳米颗粒表面偶联肿瘤特异性识别分子，实现对肿瘤的主动靶向会在很大程度上增加超小磁性氧化铁纳米颗粒在肿瘤部位的累积效率，从而进一步提升其在肿瘤部位的磁共振T₁加权成像效果，增强成像灵敏度，这将在肿瘤发生发展早期对微小病灶的诊断方面表现出更大的技术优势。因此，具有靶向功能的高性能超小磁性氧化铁纳米颗粒在肿瘤的磁共振分子影像诊断技术中拥有巨大的发展应用前景。

在以往的研究中，高温热分解法制备磁性氧化铁纳米颗粒的反应往往会在以油酸与油胺作为表面活性剂，1,2-十六烷二醇或1,2-十二烷二醇作为还原剂的复杂反应体系中进行，但这些还原剂价格较为昂贵，成本较高，不便于批量生产。同时，油胺与油酸同时作为表面活性剂会使得纳米颗粒的表面修饰比较复杂，不利于后续纳米颗粒表面配体置换反应的进行。

发明内容

本发明目的是提供一种RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法，以解决上述问题。本发明还提供了该纳米颗粒作为靶向新生血管的磁共振T₁造影剂的应用。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

一种RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、超小磁性氧化铁纳米颗粒的制备

将二苄醚和油胺按体积比1：9～9：1混合，氮气气氛下，再加入乙酰丙酮铁，以2～6℃/min加热至190～230℃，保持0.5～1.5h；之后以2～6℃/min加热至290℃，保持15～45min；冷却至室温，洗涤，得到超小磁性氧化铁纳米颗粒，保存于异辛烷中备用；其中，乙酰丙酮铁在反应溶液体系中浓度为0.125～0.175mol/L；

步骤二、超小磁性氧化铁纳米颗粒表面进行PEG修饰

以多巴胺盐酸盐(DPA盐酸盐)、α,ω-双{2-[(3-羧基-1-氧丙基)氨基]乙基}聚乙二醇(HOOC-PEG-COOH)为反应原料，以N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)为偶联剂，在三氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合溶剂中进行化学偶联，制备多巴胺化的HOOC-PEG-COOH；将步骤一分散于异辛烷的超小磁性氧化铁纳米颗粒滴加到多巴胺化的HOOC-PEG-COOH中，在200～800rpm下反应6～18h，洗涤，超声分散于去离子水中，调节pH至6～9，透析、过滤，低温保存备用；

步骤三、超小磁性氧化铁纳米颗粒表面进行RGD修饰

以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、NHS为偶联剂，在pH4.5～6.5的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液中对步骤二得到的超小磁性氧化铁纳米颗粒表面修饰的PEG分子末端游离羧基进行活化，之后超滤离心，洗涤，得到活化后的超小磁性氧化铁纳米颗粒；将RGD环肽溶解于pH7～9的硼砂盐缓冲溶液中，再加入活化后的超小磁性氧化铁纳米颗粒，振荡反应12～24h，透析、过滤，得到所述RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒。

上述制备得到的RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒表面PEG化密度≥1个/nm²，RGD偶联密度≥0.5个/nm²；颗粒粒径≤6nm，平均水动力尺寸≤25nm，饱和磁化强度20～60emu/g，纵向弛豫率r₁为3～10mM^-1s^-1，横向弛豫率r₂与纵向弛豫率r₁比值r₂/r₁≤3。

上述制备的RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒作为靶向新生血管的磁共振T₁造影剂的应用。

本发明的有益效果：

本发明仅以乙酰丙酮铁作为反应原料和前驱物，以油胺作为表面活性剂和还原剂，二苄醚作为溶剂，制备得到了形态规则、单分散性良好、表面修饰油胺的超小磁性氧化铁纳米颗粒，简化了合成步骤，同时节约生产成本。并且，相比之下，油胺在高温下具有更强的还原特性，可以使得制备出的超小磁性氧化铁纳米颗粒具有更高的结晶度，在同等粒径下的磁性氧化铁纳米颗粒中拥有更强的饱和磁化强度，提升其磁学性能。同时，利用油胺分子与氧化铁纳米颗粒的结合力相对较弱的特性，也有利于后续纳米颗粒表面配体置换反应的进行，从而获得高密度的PEG和RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒，并且具有优良的T₁造影能力。

在制备流程方面，通过化学偶联方法所得到的HOOC-PEG-DPA可在其原制备体系中直接应用于纳米颗粒表面的配体置换反应，免去除杂步骤，节省制备时间，简化制备方法，为油溶性纳米颗粒的大规模表面配体置换反应提供良好的技术基础。

此外，本发明中采用配体置换的方法，利用多巴胺化的HOOC-PEG-COOH对油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒表面包裹的油胺分子进行替换，实现了纳米颗粒的水溶性。这种配体置换方法所得到的纳米颗粒拥有超小的水动力尺寸以及富集在颗粒表面的水化层，这一方面可以实现其磁共振T₁加权成像造影功能；另一方面，纳米颗粒超小的尺寸以及其外层包覆的PEG分子使其拥有良好的生物安全性，并且可有效避免其在机体内被巨噬细胞所吞噬，实现其在生物体内的长循环。在纳米颗粒表面修饰RGD能够实现纳米颗粒针对肿瘤组织的主动靶向，这种主动靶向的造影模式有助于提升肿瘤部位的成像效率，在磁共振T₁加权诊断中提供更高分辨率的肿瘤图像。

综上，本发明中合成超小磁性氧化铁纳米颗粒的方法具有工艺简单，原料转化率高、可重复性强等特点，合成出的磁性氧化铁纳米颗粒具有形貌规则、尺寸超小、稳定性好、单分散性良好、生物相容性高、具有肿瘤特异性靶向等特点，可用作具有肿瘤主动靶向功能的T₁加权成像高性能磁共振造影剂。

附图说明

图1是改进后的高温热分解法制备油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒的装置图。

图2是油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒的制备流程示意图。

图3(A)是生长时间为45min时油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒的透射电镜表征图。

图3(B)是生长时间为35min时油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒的透射电镜表征图。

图3(C)是生长时间为15min时油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒的透射电镜表征图。

图3(D)是生长时间为45min时油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒的粒径分布统计图。

图3(E)是生长时间为35min时油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒的粒径分布统计图。

图3(F)是生长时间为15min时油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒的粒径分布统计图。

图4(A)是反应体系中存在2mL二苄醚和18mL油胺时超小磁性氧化铁纳米颗粒的透射电镜表征图。

图4(B)是反应体系中存在8mL二苄醚和12mL油胺时超小磁性氧化铁纳米颗粒的透射电镜表征图。

图4(C)是反应体系中存在18mL二苄醚和2mL油胺时超小磁性氧化铁纳米颗粒的透射电镜表征图。

图4(D)是反应体系中存在2mL二苄醚和18mL油胺时超小磁性氧化铁纳米颗粒的粒径分布统计图。

图4(E)是反应体系中存在8mL二苄醚和12mL油胺时超小磁性氧化铁纳米颗粒的粒径分布统计图。

图4(F)是反应体系中存在18mL二苄醚和2mL油胺时超小磁性氧化铁纳米颗粒的粒径分布统计图。

图5(a)是多巴胺化HOOC-PEG-COOH合成反应示意图。

图5(b)是油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒表面配体置换反应示意图。

图5(c)是PEG化超小磁性氧化铁纳米颗粒表面偶联RGD示意图。

图6(a)是RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的电镜表征图(放大倍数为4万倍)。

图6(b)是RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的电镜表征图(放大倍数为20万倍)。

图6(c)是RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的粒径分布统计直方图。

图7(a)是PEG修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的水动力尺寸分布图。

图7(b)是RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的水动力尺寸分布图

图8(a)是PEG修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒表面Zeta电位测量图。

图8(b)是RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒表面Zeta电位测量图。

图9是RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的磁滞回线。

图10(a)是PEG修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒与巨噬细胞共孵育24h后的结果(纳米颗粒浓度为100μg/mL，以Fe的质量计)。

图10(b)是RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒与巨噬细胞共孵育24h后的结果(纳米颗粒浓度为100μg/mL，以Fe的质量计)。

图10(c)为对照实验组(未加入纳米颗粒)。

图11(a)是PEG修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒与HUVEC共孵育24h后的结果(纳米颗粒浓度为200μg/mL，以Fe的质量计)。

图11(b)是RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒与HUVEC共孵育24h后的结果(纳米颗粒浓度为200μg/mL，以Fe的质量计)。

图11(c)为竞争实验组，将游离的RGD环肽分子与HUVEC先孵育9h，然后加入RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒与HUVEC共孵育24h后的结果(纳米颗粒浓度为200μg/mL，以Fe的质量计)。

图11(d)为对照实验组(未加入纳米颗粒)。

图12是不同浓度RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的细胞毒性体外评价。

图13是不同浓度RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的磁共振T₁加权成像表征结果。

图14是RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的R₁-C曲线图。

图15是RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的R₂-C曲线图。

图16是在注射前和注射PEG修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒和RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒后不同时间点的小鼠磁共振扫描图像(图中白色虚线圈内为肿瘤部位)。

图17是在注射PEG修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒和RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒后不同时间点肿瘤组织T₁加权信号值信噪比的相对变化图像。

图18是注射RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒后不同时间点的小鼠肿瘤组织和其它重要脏器组织的病理学检查结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

一种RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、超小磁性氧化铁纳米颗粒的制备

采用改进后的高温热解法制备，反应装置如图1所示，反应制备流程如图2所示，其中，乙酰丙酮铁为反应原料和前驱物，油胺为表面活性剂和还原剂，二苄醚为溶剂，具体制备过程如下：

将二苄醚和油胺按体积比1：9～9：1混合，持续通入氮气以除去体系中的氧气，再加入乙酰丙酮铁，乙酰丙酮铁在反应溶液体系中浓度为0.125～0.175mol/L，以2～6℃/min加热至190～230℃(该温度为纳米颗粒成核温度)，优选220℃，保持0.5～1.5h，此阶段为纳米颗粒的成核阶段，该过程中溶液由棕红色转变为光亮透泽的黑色。之后以2～6℃/min加热至290℃(该温度为二苄醚的沸点，也是纳米颗粒的生长温度)，保持15～45min，完成纳米颗粒的快速生长。冷却至室温，加入无水乙醇，磁分离洗涤3～4次，充分去除溶液中残留的油胺和二苄醚，得到超小磁性氧化铁纳米颗粒，保存于异辛烷中备用。

步骤二、超小磁性氧化铁纳米颗粒表面进行PEG修饰

利用多巴胺化的HOOC-PEG-COOH对纳米颗粒表面包裹的油胺分子进行替换，实现纳米颗粒表面的PEG化修饰，使其拥有良好的水溶性和生物相容性，具体制备过程如下：

称取3.9mg DPA盐酸盐、60mg HOOC-PEG-COOH、30mg无水碳酸钠，5～6mg NHS、6～9mg DCC置于100mL三颈瓶中，然后向其中加入6mL三氯甲烷和3mL DMF作为溶剂，室温下静置2h，之后于35℃水洗锅中搅拌反应3h，转速为450rpm，制备得到多巴胺化的HOOC-PEG-COOH。将15mg(以Fe的质量计)步骤一分散于异辛烷的超小磁性氧化铁纳米颗粒缓慢滴加到多巴胺化的HOOC-PEG-COOH中，在200～800rpm下反应6～18h。在纳米颗粒逐滴加入的过程中可以观察到，开始时混合溶液整体颜色为黑色，随着反应的进行，瓶底逐渐有黑色絮状颗粒析出，溶液上清颜色变淡。反应结束后，将反应物倒入烧杯中，加入正己烷洗涤，磁分离，溶液上清变为无色，底部为黑色颗粒状物质。弃上清，将底部黑色颗粒状物质超声(脉冲：2s/2s；750W，20kHz)5～10min后分散于去离子水中形成稳定的胶体溶液，调节胶体溶液pH至6～9，纳米颗粒不发生聚集。透析(截留分子量：14kDa)72h后用孔径为220nm的滤膜过滤去除较大尺寸的颗粒后，4℃保存备用。

步骤三、超小磁性氧化铁纳米颗粒表面进行RGD修饰

通过在纳米颗粒表面修饰肿瘤特异性识别分子RGD能够实现纳米颗粒针对肿瘤组织的主动靶向，有助于增加纳米颗粒在肿瘤组织累积量并提升磁共振成像诊断过程中肿瘤部位的成像效率，具体制备过程如下：

取步骤二PEG修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒15mg(以Fe的质量计)分散于20mLpH4.5～6.5的MES缓冲溶液中，再加入35mg EDC、20mgNHS，室温下摇床振荡反应20～25min，转速为120rpm，用以活性纳米颗粒表面PEG分子末端的游离羧基。将反应后的溶液超滤离心3次(超滤管截留分子量为30kDa，离心转速4000rm)，利用去离子水洗涤以除去活化反应中多余的EDC和NHS，得到活化后的超小磁性氧化铁纳米颗粒。将8mgRGD环肽溶解于20mL pH7～9的硼砂盐缓冲溶液中，再快速加入活化后的超小磁性氧化铁纳米颗粒，于摇床上振荡反应12～24h，转速是120rpm。透析(截留分子量14kDa)72h后用孔径为220nm的滤膜过滤去除较大尺寸的颗粒后，得到所述RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒，置于4℃下保存。

本发明RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的制备，从合成工艺上进行了改进和优化，以晶体的成核和生长的机制理论为基础，为纳米颗粒的超小尺寸可控制备和规模化生产提供了前提条件。此外，本发明采用配体置换的方法，利用多巴胺化的HOOC-PEG-COOH对油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒表面包裹的油胺分子进行替换，实现了纳米颗粒表面的PEG化修饰。这种配体置换方法所得到的纳米颗粒拥有超小的水动力尺寸以及富集在颗粒表面的水化层。这一方面可以实现其磁共振T₁加权成像功能，另一方面，纳米颗粒超小的尺寸以及其外层包覆的PEG分子使其拥有良好的生物安全性，并且能够有效防止血清蛋白的吸附及有效避免其在机体内被巨噬细胞所吞噬，实现其在生物体内的长循环。纳米颗粒表面修饰的RGD能够特异性识别肿瘤新生血管内皮细胞表面过表达的α_vβ₃整合素并与之结合，从而实现纳米颗粒针对肿瘤组织的主动靶向，这种主动靶向的造影模式有助于提升肿瘤部位的成像效率，提供更高分辨率的磁共振诊断图像，因此这种RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒在临床医学诊断方面拥有极高的研究应用价值。

本发明制备得到的RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒表面PEG化密度≥1个/nm²，RGD偶联密度≥0.5个/nm²。纳米颗粒粒径≤6nm，能够于pH3～11的水溶液中稳定分散，维持良好的单分散性。水动力尺寸≤25nm，具有极好的水溶性和稳定性。具有良好的超顺磁性，饱和磁化强度约为20～60emu/g Fe，拥有较强的抗氧化能力。纳米颗粒水溶液拥有良好的磁共振弛豫特性，纵向弛豫率(r₁)为3～10mM^-1s^-1，横向弛豫率(r₂)与纵向弛豫率比值r₂/r₁≤3，能够有效增强MRI中T₁加权对比信号，使图像变亮，拥有优良的磁共振成像(MRI)T₁加权造影能力。纳米颗粒拥有良好的生物安全性并能有效躲避巨噬细胞的非特异性吞噬。这种RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒可用作新一代磁共振阳性(T₁加权造影)造影剂，实现对肿瘤组织的主动靶向造影，从而克服磁共振阴性造影剂(尺寸较大的氧化铁纳米颗粒)以及传统阳性造影剂(钆剂)的缺点和不足，因此在临床磁共振造影成像诊断中具有极高的研究及应用价值。

以下实施例涉及的实验方法说明：

在超小磁性氧化铁纳米颗粒的磁学性能测试方面，利用振动样品磁强计(Vibrating Sample Magnetometer,VSM,Lakeshore 7407,美国Lakeshore公司)直接测定RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒样品的磁滞回线。首先统一样品浓度为1mg[Fe]/mL，然后分别移取80μL置于振动样品磁强计的液相样品槽内，测定样品在一定磁场强度(-20000～20000Oe)下的磁滞回线。

在磁共振造影成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)及弛豫率测量方面，对于RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒水相样品，分别通过二次水稀释的方法得到如下的浓度梯度：20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1562μg[Fe]/mL。样品各取5mL置于罗口菌种瓶内，然后将其按顺序固定于多功能试管架中，使用磁共振成像仪(Verio,3T,德国Siemens公司)扫描得到样品的T₁、T₂加权图像。测量T₁时所使用线圈为头颈部线圈，层厚为5mm，扫描序列为MOLLI sequence，其中各参数设置如下：TR(重复时间)＝2.8ms、TE(回波时间)＝1.16ms、TI(反转回复时间)＝116～5116ms；测量T₂时所使用线圈为头颈部线圈，层厚为5mm，扫描序列为TrueFISP sequence，其中各参数设置如下：TR＝11000ms、TE＝0～100ms，共10个回波。在完成扫描后，针对每个扫描序列，选择样品扫描后得到的伪彩图，此图即为样品T₁、T₂加权图像综合后得到的结果。在图中每个样品的加权图像中划定感兴趣区，面积为0.3cm²，读取相应的T₁、T₂值，之后在Origin软件下根据对应样品的浓度作R₁-C(R₁＝1/T₁，C为磁性氧化铁纳米颗粒中铁的浓度)和R₂-C(R₂＝1/T₂，C为磁性氧化铁纳米颗粒中铁的浓度)曲线，经过线性拟合后，得到的两条直线的斜率分别对应于样品的纵向弛豫率和横向弛豫率。

利用透射电子显微镜(JEM-200CX，日本JEOL公司)对油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒的内核尺寸进行测量，经观察发现其平均粒径≤8nm，具有良好的单分散性。对RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒进行形貌观察及尺寸分布统计时发现，油溶性纳米颗粒表面经PEG进行配体置换并修饰RGD分子后，仍能够保持良好的单分散性，颗粒形貌规则，尺寸均一，粒径尺寸分布统计结果表明，样品平均粒径≤6nm。

利用粒径分析仪(Brookhaven-Zetaplus，美国Brookhaven公司)对经PEG修饰和RGD修饰后的超小磁性氧化铁纳米颗粒分别进行水动力尺寸表征和Zeta电位表征，结果显示PEG修饰的纳米颗粒的平均水动力尺寸位于10nm左右；经RGD修饰后，纳米颗粒的平均水动力尺寸增加至15nm左右。样品的水动力尺寸较其透射电镜表征尺寸偏大，这是由于在水溶液状态下颗粒表面的水化层所致，在PEG修饰的纳米颗粒表面修饰RGD分子后同样会使其水动力尺寸稍有增加。在pH为7的水溶液中，PEG修饰的纳米颗粒表面Zeta电位为-41mV，这是由于颗粒表面修饰配体DPA-PEG-COOH中另一端的羧基发生电离的结果，而修饰RGD后的纳米颗粒表面Zeta电位变化为-11mV，这是由于颗粒表面修饰的RGD分子的等电点所致。

通过普鲁士蓝染色对经PEG修饰和经RGD修饰后的超小磁性氧化铁纳米颗粒在RAW-264.7(小鼠巨噬细胞)中的吞噬效果进行观察，验证其躲避巨噬细胞非特异性吞噬的能力。细胞普鲁士蓝染色的基本原理如下：细胞内氧化铁与酸性染液中的[Fe(CN)₆]^4-反应生成普鲁士蓝，表现为显微镜下细胞内可见的蓝色斑点。在实验过程中，超小磁性氧化铁纳米颗粒水溶液(浓度为100μg/mL，以Fe的质量计)与细胞共孵育24h后，进行普鲁士蓝染色，并于显微镜下进行观测。

通过普鲁士蓝染色对经PEG修饰和经RGD修饰后的超小磁性氧化铁纳米颗粒在HUVEC(人脐静脉内皮细胞)中的吞噬效果进行观察。由于HUVEC表面同样能够过表达整合素α_vβ₃(肿瘤新生血管内皮细胞表面过表达整合素α_vβ₃)，可以验证经RGD修饰后的纳米颗粒在体外环境下特异性靶向至肿瘤组织的能力。在实验过程中，两种超小磁性氧化铁纳米颗粒水溶液(浓度为200μg/mL，以Fe的质量计)与细胞共孵育24h后，进行普鲁士蓝染色，并于显微镜下进行观测。(另设一组实验，将游离的RGD分子与HUVEC先孵育9h后加入RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒，以此对比验证RGD修饰的纳米颗粒针对HUVEC的靶向性位点为整合素α_vβ₃)

通过三种细胞RAW-264.7(小鼠巨噬细胞)、4T1(小鼠乳腺癌肿瘤细胞)以及H1975(人非小细胞肺癌细胞)的MTT试验，验证RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的生物安全性。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用全自动酶标仪在490nm波长处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与活细胞数成正比。细胞增殖越多越快，则吸光度越高；反之若细胞毒性越大，则吸光度越低。在验证过程中，用9组不同浓度的超小磁性氧化铁纳米颗粒水溶液进行MTT实验，探讨其生物安全性。

准备两只载有4T1皮下移植肿瘤的小鼠模型，肿瘤体积为50～100mm³。在这两只小鼠体内分别注射PEG修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒和RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒以验证两者在小鼠体内针对肿瘤部位的磁共振T₁加权靶向造影效果。用水合氯醛(浓度为10％)麻醉剂对小鼠进行腹腔注射，注射剂量控制在0.004mL/g体重。待小鼠麻醉后，将其固定置于7T核磁共振扫描仪(BRUKER)上进行平扫，平扫过后通过小鼠尾静脉分别将PEG修饰的磁性氧化铁纳米颗粒和RGD修饰的磁性氧化铁纳米颗粒水溶液注入两只小鼠体内(注射剂量：5mg/kg体重，以Fe质量计)，在注射后15min、30min、60min、120min、240min五个不同的时间点分别进行扫描成像(扫描序列设定为MSME_T1)，观察小鼠肿瘤部位的磁共振T1加权造影效果，同时在注射纳米颗粒后不同时间的磁共振扫描T₁加权图像中的肿瘤部位划定面积为0.2cm²的感兴趣区，读取该区域的T₁加权信号值并与背景T₁加权信号值相比，得到肿瘤部位信噪比随注射时间延长的变化趋势。

准备五只载有4T1皮下移植肿瘤的小鼠模型，肿瘤体积为50～100mm³。将RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒经尾静脉注入小鼠体内，(注射剂量：5mg/kg体重，以Fe质量计)在注射完成后10min、30min、60min、120min、240min时分别处死小鼠，取出各小鼠肿瘤组织和其它重要脏器组织(心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺)，切取每种组织少量，用4％甲醛溶液固定，经普鲁士蓝和核固红染色后置于显微镜下观察，用以确定RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒经不同的体内循环时间后在小鼠体内的主要分布以及在肿瘤组织的累计情况。

以下实施例涉及的RGD环肽购于吉尔生化(上海)有限公司，型号为LotNo.P090615-ZG141076。HOOC-PEG-COOH购于西格玛奥德里奇(中国)公司，型号为MDLNo.MFCD00286222。

实施例1

不同生长时间下超小磁性氧化铁纳米颗粒的制备。

在3个100mL的三颈烧瓶中各加入8mL二苄醚和12mL油胺，持续通入氮气以去除体系中的氧气，然后各加入3mmol的乙酰丙酮铁，通过程序控温装置以3.3℃/min加热速率加热各反应体系到220℃(成核温度)，保持该温度1h，此阶段即为磁性氧化铁纳米颗粒的成核阶段，该过程中溶液由棕红色转变为光亮透泽的黑色。接着，以3.3℃/min加热速率加热各反应体系到290℃(生长温度)，于该温度下各反应体系分别维持45min、35min以及15min，以实现不同生长时间的纳米颗粒的制备。反应结束后，移去热源，待反应物自然冷却至室温后转移至烧杯中，加入无水乙醇，磁分离进行洗涤3～4次，充分去除溶液中残留的油胺、二苄醚，最后将磁性氧化铁纳米颗粒于异辛烷中保存。

实施例2

不同体积比例的反应原料下超小磁性氧化铁纳米颗粒的制备。

在3个100mL的三颈烧瓶中分别加入2mL二苄醚和18mL油胺、8mL二苄醚和12mL油胺、18mL二苄醚和2mL油胺，持续通入氮气以去除体系中的氧气，然后各加入3mmol的乙酰丙酮铁，通过程序控温装置以3.3℃/min加热速率加热各反应体系到220℃(成核温度)，保持该温度1h，此阶段即为磁性氧化铁纳米颗粒的成核阶段，该过程中溶液由棕红色转变为光亮透泽的黑色。接着，以3.3℃/min加热速率加热各反应体系到290℃(生长温度)，于该温度下各反应体系维持15min，以实现在不同体积比反应原料情况下纳米颗粒的制备。反应结束后，移去热源，待反应物自然冷却至室温后转移至烧杯中，加入无水乙醇，磁分离进行洗涤3～4次，充分去除溶液中残留的油胺、二苄醚，最后将磁性氧化铁纳米颗粒于异辛烷中保存。

实施例3

油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒表面修饰RGD。

将实施例2中反应原料为8mL二苄醚和12mL油胺的体系，生长时间为15min时制备得到的油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒表面进行RGD修饰。

称取3.9mgDPA盐酸盐、60mg HOOC-PEG-COOH固体粉末，30mg无水碳酸钠、6mg NHS、9mg DCC置于100mL三颈瓶中，然后向其中加入6mL三氯甲烷和3mL DMF作为溶剂，室温下静置2h，再于35℃水浴锅中搅拌反应3h，转速为450rpm，制备得到多巴胺化的HOOC-PEG-COOH，如图5(a)所示。取上述分散于异辛烷油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒15mg(以Fe的质量计)缓慢滴入已制备好的多巴胺化的HOOC-PEG-COOH中，同时控制搅拌转速于200rpm左右。在纳米颗粒逐滴加入的过程中可观察到，开始时混合反应溶液整体颜色为黑色，随着反应的进行，瓶底逐渐有黑色絮状颗粒析出，溶液上清颜色变淡，继续搅拌反应过夜。次日停止反应，将反应物倒入烧杯中，加入正己烷洗涤后进行磁分离，溶液上清变为无色，底部为黑色颗粒状物质。弃上清，下部磁性氧化铁纳米颗粒经超声(脉冲：2s/2s；750W，20kHz)作用5min后能分散于去离子水中形成稳定的胶体溶液，调节胶体溶液pH至7.7，纳米颗粒不发生聚集。至此为止，已成功完成油溶性纳米颗粒表面PEG化修饰，得到具有良好水溶性的超小磁性氧化铁纳米颗粒，如图5(b)所示。样品经透析(截留分子量：14kDa)72h后用孔径为220nm的滤膜过滤去除较大尺寸的颗粒后，置于4℃冰箱保存，以备后续反应进行。在下一步的反应中，取上述透析过滤后得到的PEG修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒15mg(以Fe的质量计)分散于20mL pH为5的MES缓冲液中，取EDC固体粉末35mg，NHS固体粉末20mg溶解于上述体系中，室温于摇床振荡反应20～25min，转速为120rpm，用以活化该纳米颗粒表面PEG分子末端的游离羧基。待上述反应结束后，取出反应后的溶液超滤离心3次(超滤管截留分子量：30kDa，离心转速：4000rpm)，利用去离子水洗涤处于活化态的纳米颗粒，以去除活化反应中多余的EDC和NHS。取RGD环肽8mg溶解于20mL pH为8的硼酸盐缓冲液中，在该缓冲液体系中快速加入上述洗涤后的纳米颗粒，于摇床上振荡反应24h，转速为120rpm，制备得到RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒，如图5(c)所示。样品经透析(截留分子量：14kDa)72h后用孔径为220nm的滤膜过滤去除较大尺寸颗粒后，置于4℃冰箱保存。

实施例2中反应原料为8mL二苄醚和12mL油胺的体系，生长时间为15min时制备得到的油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒的原料转化效率为80％；进行纳米颗粒的表面配体置换反应时，油溶性纳米颗粒转化为水溶性纳米颗粒的效率为86.7％。由此得出，从反应前驱物乙酰丙酮铁转化为水溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒的总体转化效率约为70％(所有转化效率均以Fe质量计算)。在PEG化超小磁性氧化铁纳米颗粒表面修饰RGD分子的过程中，RGD分子与纳米颗粒间的偶联效率为67％。

表征：实施例1在生长时间为45min、35min和15min时制备得到的油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒的透射电镜表征结果如图3(A)、图3(B)和图3(C)所示，粒径统计结果显示在不同生长时间下纳米颗粒的平均粒径分别为7.7nm、6.1nm和4.7nm，具有良好的单分散性。

实施例2当反应体系中分别加入2mL二苄醚和18mL油胺、8mL二苄醚和12mL油胺、18mL二苄醚和2mL油胺时制备得到的油溶性超小磁性氧化铁纳米颗粒的透射电镜表征结果如图4(A)、图4(B)和图4(C)所示，粒径统计结果显示在三种不同体积比反应原料的体系下制备得到的纳米颗粒平均粒径分别为5.7nm、4.7nm和5.1nm，颗粒尺寸均一、单分散性良好。

RGD修饰后的超小磁性氧化铁纳米颗粒透射电镜表征结果如图6(a)、6(b)所示，从表征结果可见，磁性氧化铁纳米颗粒表面修饰RGD分子后，仍能保持良好的单分散性，颗粒形貌规则，尺寸较为均一，粒径尺寸分布统计结果如图6(c)所示，样品平均粒径位于5.4nm。PEG修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒和RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒平均水动力尺寸和颗粒表面Zeta电位表征结果如图7、图8所示，图7(a)显示PEG修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的平均水动力尺寸位于10nm左右，经RGD修饰后，纳米颗粒的平均水动力尺寸增加至15nm左右，如图7(b)所示；在pH为7的水溶液中，PEG修饰的纳米颗粒表面Zeta电位为-41mV，如图8(a)所示，这是由于颗粒表面修饰配体DPA-PEG-COOH中另一端的羧基发生电离的结果，而修饰RGD后的纳米颗粒表面Zeta电位变化为-11mV，如图8(b)所示，这是由于颗粒表面修饰的RGD分子的等电点所致。图9为RGD化的超小磁性氧化铁纳米颗粒在室温下的磁滞回线，从样品的磁滞回线可以看出，经RGD修饰后的超小磁性氧化铁纳米颗粒呈现出良好的超顺磁性，矫顽力和剩磁均近似为零，其饱和磁化强度约为50emu/g Fe，对于平均粒径在5nm左右的磁性氧化铁纳米颗粒而言，已经达到了较高的水平。图10(a)是PEG修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒与巨噬细胞共孵育24h后的结果，图10(b)是RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒与巨噬细胞共孵育24h后的结果，图10(c)为对照实验组(未加入两种纳米颗粒)。从实验结果可以看出，与纳米颗粒共培养的巨噬细胞内均无明显的蓝色物质出现，证明经PEG和RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒不易被RAW-264.7细胞所摄取，且能够在较高浓度的下有效躲避巨噬细胞的吞噬。图11(a)是PEG修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒与HUVEC共孵育24h后的结果，图11(b)是RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒与HUVEC共孵育24h后的结果，图11(c)为竞争实验组，将游离的RGD环肽分子与HUVEC先孵育9h，然后加入RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒与HUVEC共孵育24h后的结果，图11(d)为对照实验组(未加入两种纳米颗粒)。从实验结果可以看出，图11(a)和图11(d)中无蓝色物质出现，图11(b)和图11(c)中均有蓝色物质出现，但图11(c)中蓝色物质明显少于图11(b)中的含量，这是由于游离的RGD环肽分子大量占据HUVEC表面的整合素α_vβ₃，使得RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒与HUVEC结合部位相对减少造成的结果。由此实验结果证明经RGD修饰的纳米颗粒能够与HUVEC发生特异性结合，并且该特异性结合位点为HUVEC表面所过表达的整合素α_vβ₃。RGD修饰后的超小磁性氧化铁纳米颗粒的细胞毒性评价如图12所示，从实验结果可以看出，当培养基中的纳米颗粒浓度高达100μg/mL时(以Fe的质量计)，RAW-264.7、4T1、H1975三种细胞的存活率仍维持在85％以上，细胞生存状态良好，以此证明经RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒拥有良好的生物安全性，可进一步应用于生物体内研究。

性能：如图13中RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的磁共振T₁加权成像结果所示，随着纳米颗粒浓度的升高，其在磁共振成像下的T₁加权信号明显增强(图像变亮)。相比于对照组(去离子水)，当水溶液中磁性氧化铁纳米颗粒的浓度达到0.36mM时(以Fe的质量计)，已经能够形成良好的T₁加权成像造影增强效果。进一步地，由图14所示的R₁-C曲线图可计算得出，RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的纵向弛豫率(r₁)为7.39mM^-1 _s ^-1；由图15所示的R₂-C曲线图可计算得出，PEG化超小磁性氧化铁纳米颗粒的横向弛豫率(r₂)为22.39mM^-1s^-1，由此可以计算得出r₂/r₁＝3，说明制备得到的RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒具有优良的磁共振T₁加权造影能力。小鼠磁共振扫描图像如图16所示，经尾静脉分别注射PEG修饰和RGD修饰的两种超小磁性氧化铁纳米颗粒后，磁共振T₁加权图像中两只小鼠的肿瘤部位图像亮度同时开始增强，说明两种纳米颗粒能够在肿瘤部位逐步开始累积，增强该部位的T₁加权信号值。相比于PEG修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒，RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒由于颗粒表面偶联有肿瘤特异性识别分子，能够主动靶向至肿瘤组织，因此其在注射进小鼠体内后表现出更加优秀的肿瘤组织磁共振T₁加权造影能力，能够在短时间内大幅提升肿瘤组织的磁共振T₁加权信号值，在磁共振T₁加权图像中使肿瘤组织变亮，从而在很大程度上增强小鼠肿瘤组织和正常组织间的对比度。图17显示的是在注射不同纳米颗粒后不同时间点肿瘤组织T₁加权信号值信噪比的相对变化，注射RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒后30min时，肿瘤组织的T₁加权信号值达到最高，信噪比约为注射前的3倍，高于注射PEG修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒后肿瘤组织的信噪比(最高为注射前2倍)，由此证明经RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒能够实现针对肿瘤组织的主动靶向，提升纳米颗粒在肿瘤组织的累积效率，并在磁共振T₁加权诊断中短时间内提供更高分辨率的肿瘤图像。图18是注射RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒后不同时间点小鼠肿瘤组织和各重要脏器组织的病理学检查结果。从图中可以发现，注射60min后仅在小鼠脾脏中出现少许纳米颗粒；除此之外，在注射纳米颗粒后的240min内，小鼠的心脏、肝脏、肺、肾脏等组织中没有发现纳米颗粒的截留。而随着注射时间的延长，纳米颗粒在肿瘤组织的累积逐渐增多，并从肿瘤周边逐步渗透至肿瘤内部。此病理学检查结果说明RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒在小鼠体内随血液循环的240min中，不易被肝脏、脾脏等巨噬细胞含量丰富的组织所截留，在体内长循环的过程中实现对肿瘤组织的主动靶向。

Claims (2)

1.一种RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、超小磁性氧化铁纳米颗粒的制备

将二苄醚和油胺按体积比1：9～9：1混合，氮气气氛下，再加入乙酰丙酮铁，以2～6℃/min加热至190～230℃，保持0.5～1.5h；之后以2～6℃/min加热至290℃，保持15～45min；冷却至室温，洗涤，得到超小磁性氧化铁纳米颗粒，保存于异辛烷中备用；其中，乙酰丙酮铁在反应溶液体系中浓度为0.125～0.175mol/L；

步骤二、超小磁性氧化铁纳米颗粒表面进行PEG修饰

以多巴胺盐酸盐、α,ω-双{2-[(3-羧基-1-氧丙基)氨基]乙基}聚乙二醇为反应原料，以N-羟基琥珀酰亚胺、N,N’-二环己基碳二亚胺为偶联剂，在三氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂中进行化学偶联，制备多巴胺化的α,ω-双{2-[(3-羧基-1-氧丙基)氨基]乙基}聚乙二醇；将步骤一分散于异辛烷的超小磁性氧化铁纳米颗粒滴加到多巴胺化的α,ω-双{2-[(3-羧基-1-氧丙基)氨基]乙基}聚乙二醇中，在200～800rpm下反应6～18h，洗涤，超声分散于去离子水中，调节pH至6～9，透析、过滤，低温保存备用；

步骤三、超小磁性氧化铁纳米颗粒表面进行RGD修饰

以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺为偶联剂，在pH4.5～6.5的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中对步骤二得到的超小磁性氧化铁纳米颗粒表面修饰的PEG分子末端游离羧基进行活化，之后超滤离心，洗涤，得到活化后的超小磁性氧化铁纳米颗粒；将RGD环肽溶解于pH7～9的硼砂盐缓冲溶液中，再加入活化后的超小磁性氧化铁纳米颗粒，振荡反应12～24h，透析、过滤，得到所述RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒；

制备得到的RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒表面PEG化密度≥1个/nm²，RGD偶联密度≥0.5个/nm²；颗粒粒径≤6nm，平均水动力尺寸≤25nm，饱和磁化强度20～60emu/g，纵向弛豫率r₁为3～10mM^-1s^-1，横向弛豫率r₂与纵向弛豫率r₁比值r₂/r₁≤3。

2.权利要求1制备的RGD修饰的超小磁性氧化铁纳米颗粒作为靶向新生血管的磁共振T₁造影剂的应用。