CN102657881B

CN102657881B - 一种Fe3O4纳米磁共振造影剂材料的制备方法

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Publication number: CN102657881B
Application number: CN2012101566012A
Authority: CN
Inventors: 杨仕平; 黄国胜; 胡鹤; 代安涛; 安璐; 张崇琨
Original assignee: Shanghai Normal University
Current assignee: Shanghai Normal University
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2032-05-16
Also published as: CN102657881A

Abstract

本发明公开了一种Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料及其制备方法，以水为溶剂，加入催化剂NaOH，以环氧氯丙烷为开环原料，经过环氧氯丙烷与Fe₃O₄纳米粒子表面羟基的开环聚合反应，在纳米粒子表面原位修饰活性官能团功能化的枝状聚合物，再接入氨基基团，并偶联靶向分子叶酸，使粒子具有靶向功能，可以用于疾病的靶向磁共振成像。这种Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料，形貌呈球形，粒径在200～300nm，分散性好、水溶性和稳定性好、生物兼容性好、饱和磁化率高、驰豫能力强。

Description

一种Fe3O4纳米磁共振造影剂材料的制备方法

技术领域

本发明涉及材料和医药生物领域，公开了纳米磁共振造影剂材料及其制备方法，具体涉及超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的表面修饰功能化研究。

背景技术

Fe₃O₄纳米粒子由于具有超顺磁性的特点，可以用于磁共振造影剂。超顺磁性造影剂在人体内分布具有特异性、使用剂量少、安全、毒副作用小以及用途广泛等优点。目前磁性纳米粒子的制备方法有液相法合成纳米粒子具有设备简单、原料易得、组成可控、纯度高、粒度均匀等特点。Fe₃O₄纳米粒子一般采用热解法、共沉淀法和水热法合成，而尺寸在100nm以上的Fe₃O₄纳米粒子多采用的是水热法合成。2009年，赵东元等利用柠檬酸钠作为稳定剂，乙二醇为溶剂，在200℃下以水热法合成了这种粒径为200-400nm的Fe₃O₄纳米簇。这种方法合成出来的纳米粒子一般具有良好的水溶性，而且方法简单，无毒害性，是一种具有广泛应用前景的方法。但是其存在的重要缺陷在于这种方法制备的Fe₃O₄纳米簇表面缺乏活性官能团，不能进一步修饰其他化合物，从而很大程度上限制了其应用。于是，在其基础上，我们利用一种新颖的方法在Fe₃O₄纳米簇表面上修饰上一种树枝状结构聚合物，大大改善了材料的生物相容性，并通过偶联叶酸靶向分子，制备成一种良好的磁共振造影剂。

早在20世纪40年代，人类就认识了核磁共振现象，为现代的磁共振成像技术建立了理论基础，但这一现象直到30年之后才得到了广泛应用。1971年纽约州立大学医生Raymond Damadian发现肿瘤组织的T1、T2时间延长。随后纽约州立大学化学教授Paul Lauterbur发表了两个充水试管的第一幅核磁共振图像，直到1974年做出了活鼠的核磁图像，自此之后磁共振成像技术得到了迅速的发展和广泛的应用。并由于磁共振成像有许多成像技术无法比拟的优点，比如它可获得丰富的诊断信息，与计算机断层照相术（computer assisted tomography，CT）及核素成像相比没有放射引起的电离损害，同时磁共振成像还具有高分辨率、多成像参数、可任意层面断层等优点，将医学成像技术推上了新的高峰，成为当今医学诊断最强有力的工具。

磁共振造影剂种类很多，通常可分为顺磁性造影剂、铁磁性造影剂和超顺磁性造影剂。超顺磁性造影剂由于其在人体内分布具有特异性、使用剂量少、安全、毒副作用小以及用途广泛等优点，已成为目前研发的热点。制备超顺磁性造影剂的关键在于如何制备出磁性能优异（高饱和磁化强度和初始磁化率）的超顺磁性材料，以及在此基础上对磁性纳米粒子表面进行修饰，形成具有核壳结构的磁性纳米粒子，以增强其稳定性、水溶性和生物相容性，并降低其毒性。目前，处于研究阶段的磁共振成像造影剂有很多，除目前已临床应用的磁共振成像造影剂高顺磁性金属元素与配体形成的螯合Gd-DTPA外，铁酸盐类的磁性纳米粒子在磁共振造影剂的研究中也广受欢迎。在生物应用中，磁性纳米粒子必须是单分散的、高晶的和水溶性的，才能在生物条件下有很好的重现性、很高的饱和磁化率和好的生物兼容性。

目前含顺磁物质的磁共振成像造影试剂是研究热点之一。这种顺磁性MRI造影剂进入人体内后，可以缩短局部组织质子的弛豫时间，增强磁共振信号强度及对比度，以确保临床诊断的准确性。据统计，在临床MRI应用中，有30%以上的诊断使用了造影剂来提高图像对比度，在上世纪末全球年消耗含Gd类造影剂已经达30t以上。但是现在临床上常用的造影剂如二乙三胺五乙酸（Gd-DTPA）,不具有组织或器官的选择性或靶向性。因此，设计并合成更为安全有效的造影剂也一直是MRI医学领域中的研究热点。现在磁性材料的应用主要集中在磁、光、治疗、药载、以及靶向治疗等多种功能的趋势上。但是，现阶段关于这种集多功能于一体并具有较好的生物相容性的纳米材料的研究是目前的问题和难点，还有待于进一步的开发和研究。

发明内容

本发明旨在提供一种Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料及其制备方法。

本发明公开了一种Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料，能解决磁性纳米材料生物相容性问题。

具体技术方案如下。

一种Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料的制备方法，步骤包括：

（1）将用水热法合成的具有水溶性和较高稳定性的Fe₃O₄磁性纳米粒子与NaOH溶液混合，搅拌1～4hr，在氮气保护下加入环氧氯丙烷，氮气保护下搅拌反应18～30hr；

Fe₃O₄磁性纳米粒子与环氧氯丙烷的用量比为1～2mg/mmol；

NaOH溶液浓度为2～8mol/L，Fe₃O₄磁性纳米粒子与NaOH溶液的用量比为3～10mg/mL；

（2）取沉淀洗涤后，将所得到的粒子溶解在水中，加入氨水，30～40℃下搅拌30～40hr，洗涤干燥得到氨基功能化的超顺磁Fe₃O₄磁性纳米粒子；

氨水中NH₃与Fe₃O₄磁性纳米粒子的用量比为2～4mmol/mg，氨水的质量百分比浓度（以NH₃计）为25wt%～28wt%。

（3）步骤（2）的氨基功能化的超顺磁Fe₃O₄磁性纳米粒子加入含有叶酸、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的有机溶剂中，氮气或惰性气体保护下反应8～24hr；

优选的，叶酸、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1～1.5：2～3；所述有机溶剂为二甲亚砜（DMSO）；

氨基功能化的超顺磁Fe₃O₄磁性纳米粒子与叶酸的质量比为12～20：1，优选为16：1。

步骤（1）中，用水热法合成Fe₃O₄磁性纳米粒子的步骤包括：

将可溶性三价铁盐溶解于含有柠檬酸钠的乙二醇中，再加入醋酸钠，溶解后在180～240℃下反应8～12hr，冷却后取沉淀洗涤干燥。Fe³⁺、柠檬酸钠和醋酸钠与乙二醇用量分别比为0.05～0.2mmol/mL、0.02～0.05mmol/mL、0.4～0.6mmol/mL。

利用乙二醇做溶剂，柠檬酸钠为表面活性剂，水热合成Fe₃O₄磁性纳米粒子，由于纳米粒子外部有大量的羟基基团，从而使其在水溶液中具有很好的分散性和稳定性。

在此试验中，醋酸钠为FeCl₃水解提供碱性环境，并在进一步生成Fe₃O₄ 纳米粒子的过程中起到还原剂的作用。

通过本发明所得到的Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料，形貌呈球形，粒径在200～300nm，以粒径200～300nm的Fe₃O₄磁性纳米粒子为核心，表面修饰环氧氯丙烷并偶联靶向分子叶酸。该材料表现出的是超顺磁性，且饱和磁化率较高，可达到80emu/g。

本发明通过以下方法对Fe₃O₄纳米粒子表面改性：以水为溶剂，加入催化剂NaOH，以环氧氯丙烷为开环原料，经过环氧氯丙烷与Fe₃O₄纳米粒子表面羟基的开环聚合反应，在纳米粒子表面原位修饰活性官能团功能化的枝状聚合物，然后再经过氨水的取代反应，使材料上面接入大量的氨基基团，再偶联靶向分子叶酸，使粒子具有靶向功能，可以用于疾病的靶向磁共振成像。最后经过HeLa细胞吞噬发现，该磁性纳米粒子可以进入细胞内部，并且可以很好地核磁共振成像。

本发明的Fe₃O₄纳米磁共振成像造影剂材料中，以Fe₃O₄磁性纳米粒子为核，因为Fe₃O₄纳米粒子表面有大量的羟基存在，从而使得本发明中的纳米粒子材料有良好的水溶性优点；另外经过环氧化合物的开环聚合反应，在纳米粒子表面原位修饰活性官能团功能化的枝状聚合物，并偶联靶向分子（叶酸），使之可以用于疾病的靶向磁共振成像。本发明的材料粒径均匀、分散性好、水溶性和稳定性好、生物兼容性好、饱和磁化率高、驰豫能力强。制备方法的反应时间短，所需原材料易得，价格低廉；操作过程方便，为纳米磁共振成像造影剂材料的合成制备提供了一种经济与使用的新方法，并为人体的临床实验提供参考价值。

附图说明

图1为实施例1所制备的Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料的核，即Fe₃O₄磁性纳米粒子的透射电镜图。

图2为实施例1所制备的Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料的核，即Fe₃O₄磁性纳米粒子的X-射线衍射（XRD）谱图，是由DMAX 2000 X-射线衍射仪测试得到，该衍射仪为Cu/Kα-辐射(λ＝0.15405nm)(40kV，40mA)。

图3为实施例3所制备的Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料的红外谱图。

图4为实施例3所制备的Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料在25℃的磁滞回线图，由该图可以看出该造影剂具有超顺磁性，饱和磁化率达到80emu/g。

图5为实施例3所制备的Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料的T₂加权成像图，该图是由0.5T的磁共振成像仪测试而得，具体参数为：TR/TE=4000/60ms，选层厚度为0.6mm，谱宽SW=50KHz，接收机增益RG=3。由该图可见：随着造影剂中Fe³⁺浓度的逐渐增加，MRI的T₂信号逐渐变暗。

造影材料按照铁的浓度梯度依次为0、10、30、50、100、150、200μg/mL。

图6为实施例3所制备的Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料在水溶液中的1/T₂相对于Fe³⁺浓度拟合的直线图，直线的斜率即为横向驰豫率R₂，由该图可见：该造影剂具有很强的驰豫能力，横向驰豫率R₂达到127.85Fe mM^-1s^-1。

图7为实施例3所制备的Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料在水溶液中的溶解性照片。

图8为实施例3所制备的Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料（0.03mg/mL的水溶液）的紫外吸收图谱，通过对比两条曲线，以及在280nm^-1处出现的峰，可以判断叶酸是成功接到纳米粒子表面的。

图9为实施例3所制备的Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料在海拉（Hela）细胞内部吞噬后的核磁共振成像图，从图中可以明显看出，随着加入造影剂浓度的增加，MRI的T₂信号逐渐变暗，从而说明该造影剂具有良好的靶向作用。

造影材料按照铁的浓度梯度依次为0、10、30、50、100、150μg/mL。

图10为实施例2和3中环氧氯丙烷修饰的树枝状结构以及氨基化后的树枝状结构示意图。因为纳米粒子表面存在的大量羟基，所以经过表面改性后，制备得到材料表面便修饰上大量的这种树枝状结构。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明：为了更好地理解发明的实质，下面通过实施例来详细说明发明的技术内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

称取柠檬酸钠(0.2g，0.68mmol)溶解在20ml乙二醇中，经超声搅拌溶解后加入无水FeCl₃（0.3244g，2.0mmol），超声溶解后加入1.20g CH₃COONa·3H₂O（9mmol），经超声溶解后搅拌30min，将溶液转移至50ml反应釜中，在200℃下反应10h。冷却后取沉淀用乙醇和去离子水各洗涤三次，冷冻干燥，即得超顺磁性的Fe₃O₄磁性纳米粒子，具有水溶性。粒径为200～300nm，透射电镜图如图1所示，XRD谱图如图2所示。

实施例2

配制10ml 5mol/L的NaOH溶液，并转移至100ml单颈圆底烧瓶中，加入60mg实施例1中干燥好的Fe₃O₄磁性纳米粒子，搅拌2h，在氮气保护下后逐滴加入6ml环氧氯丙烷（55mmol），在氮气保护下搅拌24h，取沉淀然后用去离子水洗涤三次。洗涤后将粒子重新溶解在25ml去离子水中，加入12ml氨水（浓度为25wt%～28wt%，约0.2mol），在37℃下搅拌36h。用乙醇和去离子水各洗涤三次，冷冻干燥，即得到氨基功能化的超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子Fe₃O₄NH₂。

实施例3

将叶酸（FA）（2.5mg，1.08×10^-5mol）溶解在20ml二甲亚砜（DMSO）中，然后加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，FA、EDC和NHS按照1：1：2.5的投料比（摩尔比）进行投入，在氮气保护下搅拌3h。然后将实施例2中氨基功能化干燥好的Fe₃O₄称取40mg溶解在10ml DMSO中，然后逐滴加入到上述溶液中，氮气保护下搅拌一个晚上，最后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，冷冻干燥，即得到接上靶向物质的超顺磁性Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料Fe₃O₄NH₂FA。

通过上述方法所得到的Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料，形貌呈球形，粒径在200～300nm，以粒径200～300nm的Fe₃O₄磁性纳米粒子为核心，表面修饰环氧氯丙烷，如附图10所示，并偶联靶向分子叶酸。

红外谱图如图3所示，从图上看，在3400cm^-1处，出现了一个宽峰，是未干燥完全的水分子的O-H伸缩振动；2900cm^-1和2800cm^-1左右分别是柠檬酸钠和叶酸烷基链上亚甲基的对称和非对称伸缩振动。在1637cm^-1处的强的吸收峰可以归属为羧基上的羰基的伸缩振动吸收峰。在1100cm^-1处的吸收峰对应于柠檬酸钠和叶酸的C-O伸缩振动。通过对Fe₃O₄纳米粒子、NH₂-EPI-grafted Fe₃O₄、FA-NH₂-EPI-grafted Fe₃O₄的红外光谱比较，可以证明Fe₃O₄表面嫁接上了具有靶向作用的叶酸。

25℃的磁滞回线图如图4所示，由该图可以看出该造影剂具有超顺磁性，饱和磁化率达到80emu/g。

T₂加权成像图如图5所示，该图是由0.5T的磁共振成像仪测试而得，具体参数为：TR/TE=4000/60ms，选层厚度为0.6mm，谱宽SW=50KHz，接收机增益RG=3。Fe³⁺浓度依次为0、10、30、50、100、150、200μg/mL，由该图可见：随着造影剂中Fe³⁺浓度的逐渐增加，MRI的T₂信号逐渐变暗。

在水溶液中的1/T₂相对于Fe³⁺浓度拟合的直线图如图6所示，直线的斜率即为横向驰豫率R₂，由该图可见：所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂具有很强的驰豫能力，横向驰豫率R₂达到127.85Fe mM^-1s^-1。

在水溶液中的溶解性照片如图7所示，可见这种Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料在水中分散性很好。

紫外吸收图谱如图8所示，通过对比两条曲线（0.03mg/mL的水溶液），以及在280nm^-1处出现的峰，可以判断叶酸是成功接到纳米粒子表面的。

海拉（Hela）细胞内部吞噬后的核磁共振成像图如图9所示，Fe³⁺浓度依次为0、10、30、50、100、150μg/mL，从图中可以明显看出，随着加入造影剂浓度的增加，MRI的T₂信号逐渐变暗，从而说明改造影剂具有良好的靶向作用。

Claims

1.一种Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料的制备方法，其特征在于，所述Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料粒径在200～300nm，以粒径200～300nm的Fe₃O₄磁性纳米粒子为核心，表面修饰环氧氯丙烷，并偶联靶向分子叶酸；包括以下步骤：

（1）将用水热法合成的粒径为200～300nm、水溶性的Fe₃O₄磁性纳米粒子与2～8mol/L NaOH溶液混合，搅拌1～4hr，抽真空后在氮气保护下加入环氧氯丙烷，氮气保护下搅拌反应18～30hr；Fe₃O₄磁性纳米粒子与NaOH溶液的用量比为3～10mg/mL；Fe₃O₄磁性纳米粒子与环氧氯丙烷用量比为1～2mg/mmol；

水热法合成Fe₃O₄磁性纳米粒子的步骤包括：

将可溶性三价铁盐溶解于含有柠檬酸钠的乙二醇中，再加入醋酸钠，溶解后在180～240℃下反应8～12hr，冷却后取沉淀洗涤干燥；

Fe³⁺、柠檬酸钠和醋酸钠与乙二醇用量分别比为0.05～0.2mmol/mL、0.02～0.05mmol/mL、0.4～0.6mmol/mL；

（2）取沉淀洗涤后，将所得到的粒子溶解在水中，加入氨水，30～40℃下搅拌30～40hr，洗涤干燥得到氨基功能化的超顺磁Fe₃O₄磁性纳米粒子；氨水中NH₃与Fe₃O₄磁性纳米粒子的用量比为2～4mmol/mg，氨水浓度为25%～28%

（3）步骤（2）的氨基功能化的超顺磁Fe₃O₄磁性纳米粒子加入含有叶酸、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的有机溶剂中，氮气或惰性气体保护下反应8～24hr；氨基功能化的Fe₃O₄磁性纳米粒子与叶酸的质量比为12：1～20：1。

2.权利要求1所述Fe₃O₄纳米磁共振造影剂材料的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，叶酸、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1～1.5：2～3；所述有机溶剂为二甲亚砜。