CN116535658A

CN116535658A - 一种富集陈皮酵素中黄酮类化合物的磁性材料及其制备方法和在分析中的应用

Info

Publication number: CN116535658A
Application number: CN202310398710.3A
Authority: CN
Inventors: 陈柏忠
Original assignee: Guangdong Xinbaotang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Xinbaotang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-04-14
Filing date: 2023-04-14
Publication date: 2023-08-04

Abstract

本发明公开了一种富集陈皮酵素中黄酮类化合物的磁性材料及其制备方法和在分析中的应用。本发明以双溶剂溶解铁盐，通过加入丙烯酸钠和乙酸钠反应，制备得到含羧基磁性纳米颗粒；以所述含羧基磁性纳米颗粒为内核，以1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1‑羟基苯并三唑为催化剂，通过与碱性氨基酸进行表面微聚合，制备得到磁性材料。本发明制得的磁性材料含有丰富的羧基键，具有良好的亲水性能和静电作用，工艺简单，成本低；该磁性材料应用于陈皮酵素中黄酮类化合物分析中，可提高黄酮化合物灵敏度，减少基体效应，可满足陈皮酵素中多种黄酮类化合物的同时检测，可直接、快速完成分析。

Description

一种富集陈皮酵素中黄酮类化合物的磁性材料及其制备方法和在分析中的应用

技术领域

本发明涉及食品成分提取和检测分析技术领域，特别是涉及一种富集陈皮酵素中黄酮类化合物的磁性材料及其制备方法和在分析中的应用。

背景技术

新会陈皮酵素中含有多种抗氧化作用的黄酮类物质，可有效清除体内的氧自由基，如川陈皮素具有抗炎、抗病毒、抗血栓、抗癫痫等作用；异橙黄酮具有抑制人类卵巢癌、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞的增生和小时IV-1蛋白酶活性的作用；维采宁-2对前列腺癌细胞有抗增殖、抗血管新生和促进凋亡的作用，对糖尿病并发症和动脉粥样硬化有显著疗效；夏佛塔苷可抑制黑色素生成，且有清热祛湿，利尿通淋的作用；橙皮苷具有抗炎、抗癌的作用，可抑制谷氨酸释放，对兴奋性毒性发挥神经保护作用；橙皮素具有抑制化学诱导的乳腺、膀胱、结肠癌变的作用等。

尽管目前分析手段层出不穷，但样品前处理一直是分析过程中的瓶颈环节。新会陈皮酵素是近年来新型的酵素类产品，本申请发明人团队发现，目前只有针对总黄酮含量的测定方法，针对各种黄酮化合物检测相对较少，由于基质比较复杂，单个黄酮化合物含量相对较低，检测难度大，使得新会陈皮酵素生产过程中有效成分质量无法有效控制。

此外，本申请发明人还发现，现有的食品类预处理方法，通常采用溶剂超声提取、回流、索氏提取等，有机溶剂消耗量大，前处理操作程序繁琐杂、耗时长，且存在重现性较差、灵敏度不够、准确度不高等缺陷。

因此，急需一种操作简单，成本低，且可实现对陈皮酵素中多种微量黄酮类化合物快速分析的工艺。

发明内容

根据本发明的一个实施方式，其目的在于提供一种富集陈皮酵素中黄酮类化合物的磁性材料及其制备方法和在分析中的应用。本发明制备得到的磁性材料具有丰富的羧基键，具有良好的亲水性能和静电作用，制备工艺简单，处理成本低。该磁性材料应用于陈皮酵素中黄酮类化合物分析中，可提高黄酮化合物灵敏度，能够减少基体效应，满足陈皮酵素复杂基体中多种黄酮类化合物的同时检测，可直接、快速完成陈皮酵素中黄酮类化合物的分析。

上述目的可以通过以下技术方案的实施方式实现：

根据本发明的一个方面，本发明提供的一种富集陈皮酵素中黄酮类化合物的磁性材料的制备方法，以双溶剂溶解铁盐，通过加入丙烯酸钠和乙酸钠反应，制备得到含羧基磁性纳米颗粒；以所述含羧基磁性纳米颗粒为内核，以EDCI和HOBt为催化剂，通过与碱性氨基酸进行表面微聚合，制备得到磁性材料。

可选地，所述双溶剂为二乙二醇和乙二醇。

可选地，所述碱性氨基酸，其结构通式可以为：

其中，R为C₄H₁₀N、C₄H₁₀N₃或C₄H₅N₂。

进一步地，所述碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸中的一种。

可选地，制备方法具体包括：将二乙二醇和乙二醇制备得到双溶剂，将铁盐溶解在双溶剂中，加入丙烯酸钠和乙酸钠，在65℃～75℃下搅拌0.5～1.5小时，移至反应釜于180℃～200℃反应10～20小时，洗涤，氮气氛围干燥，得到磁性纳米颗粒；将所述磁性纳米颗粒、EDCI、HOBt以及碱性氨基酸，加入到第二溶剂中混合均匀，搅拌反应1～2小时，清洗，干燥，得到所述磁性材料。

可选地，所述二乙二醇与乙二醇的体积比为(1.5～6)：1。

可选地，所述铁盐与双溶剂的质量体积比为1：(5～20)。

可选地，所述丙烯酸钠和乙酸钠的质量比为(0.5～2)：1。

可选地，所述铁盐与丙烯酸钠和乙酸钠二者之和的摩尔比为1：(10～40)。

可选地，所述磁性纳米颗粒与碱性氨基酸的摩尔比为1：1～5。

可选地，所述磁性纳米颗粒、EDCI、HOBt的摩尔比为1：(0.5～2)：(0.5～2)。

可选地，所述第二溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或无水甲苯或二氯甲烷中一种。

根据本发明的第二个方面，本发明提供的一种富集陈皮酵素中黄酮类化合物的磁性材料，所述磁性材料采用上述制备方法制备得到。

可选地，所述磁性材料含有羧酸COO-多电子共轭体系。

进一步地，所述磁性材料，由于含有羧酸COO-多电子共轭体系，两个C＝O振动偶合在红外图中出现强吸收，红外图中在1400～1600cm^-1有明显的-COO-的反对称和对称伸缩振动峰。

可选地，所述磁性材料的尺寸小于150nm。

根据本发明的第三个方面，本发明提供的一种磁性材料在分析陈皮酵素中黄酮类化合物中的应用。所述磁性材料为采用所述的富集陈皮酵素中黄酮类化合物的磁性材料的制备方法制备得到。

可选地，应用包括：采用磁性材料萃取陈皮酵素中黄酮类化合物；对萃取后的洗脱液进行色谱检测，获得检测结果；根据检测结果以及预先建立的标准线性方程，计算得到陈皮酵素中各黄酮类化合物的含量。

可选地，磁性材料加入量为每克陈皮酵素加入10mg～100mg磁性材料

可选地，所述黄酮类化合物为维采宁-2、夏佛塔苷、橙皮苷、橙皮素、异橙黄酮和川陈皮素中的一种或几种。

有益效果：根据本发明的一个实施方式，先利用双溶剂充分地分散铁盐，通过加入丙烯酸钠和乙酸钠热反应，制备得到了富含羧基的磁性纳米颗粒Fe₃O₄；然后以其作为Fe₃O₄磁性材料内核，以EDCI和HOBt为催化剂，与碱性氨基酸进行表面微聚合，制备得到了富集陈皮酵素中黄酮类化合物的C₂H₄O₂R@Fe₃O₄磁性材料，改善了常规磁性材料在水/有机溶剂中的分散性，该磁性材料含有羧酸COO-多电子共轭体系，具有丰富的羧基键，具有良好的亲水性能和静电作用；且制备工艺简单，操作便捷，处理成本低。

采用该磁性材料应用于陈皮酵素等复杂基体中黄酮类化合物分析中，可显著提高对黄酮类化合物的灵敏度，减少基体效应，从而可高选择富集陈皮酵素中的黄酮类化合物，可完成多种黄酮类化合物的同时检测。可直接、快速完成分析，为新会陈皮酵素食品的质量控制提供了科学依据。为复杂食品介质、及生物样品中痕量黄酮类化合物的快速、直接、灵敏分析夯实的基础。

附图说明

图1是本发明一实施例中磁性材料制备原理示意图；需要说明的是烧杯处各原料并非直接加入；

图2是本发明一实施例中磁性材料应用时操作流程示意图；

图3是本发明制备实施例1得到的磁性材料的扫描电镜图(SEM图谱)；

图4是本发明制备实施例1得到的磁性材料的X射线衍射图(XRD图谱)；

图5是本发明制备实施例1得到的磁性材料的红外图(IR图谱)；

图6是本发明应用实施例1萃取新会陈皮酵素样品后的色谱图；

图7为对照例未采用磁性材料萃取，直接进样的色谱图；

图8是六种1ng/L的黄酮物质的色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本申请提供的一种富集陈皮酵素中黄酮类化合物的磁性材料，是以双溶剂溶解铁盐，通过加入丙烯酸钠和乙酸钠热反应，制备得到含羧基磁性纳米颗粒；以所述含羧基磁性纳米颗粒为内核，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三唑(HOBt)作为催化剂，通过与碱性氨基酸进行表面微聚合，制备得到的。该富集陈皮酵素中黄酮类化合物的C₂H₄O₂R@Fe₃O₄磁性材料具有丰富的羧基键，丰富的羧基基团使得材料具有良好的亲水性能和静电作用。

下面结合一较优实施例对本发明磁性材料的制备方法做更进一步描述：

步骤S10，首先采用二乙二醇和乙二醇按比例制备得到双溶剂，将一定量的铁盐充分地溶解在双溶剂中，得到第一溶液；其次向该第一溶液中加入特定比例的丙烯酸钠和乙酸钠，在65℃～75℃下搅拌0.5～1.5小时，在高压反应釜内于180℃～200℃反应10～20小时，产物分别用乙醇和水洗涤多次，在氮气氛围下干燥，得到了富含羧基的磁性纳米颗粒Fe₃O₄。

该实施例中，采用二乙二醇和乙二醇双溶剂充分地溶解铁盐。一方面，二乙二醇和乙二醇是较强的还原剂，用于提供单分散精细的金属纳米颗粒；另一方面，二乙二醇作为聚合稀释剂，根据库仑定律，颗粒表面形成极性电荷，利用同极性电荷的相互排斥作用来阻止颗粒团聚，可以更高效地实现颗粒的均匀分散，从而降低了因乙二醇粘度高而导致颗粒团聚的影响，最大程度地防止了铁氧颗粒在液相形成过程中发生团聚现象。

此外，双溶剂中，二乙二醇与乙二醇体积比为(1.5～6)：1。例如1.5:1，2:1，3:1，4:1，5:1，6:1等。进一步地铁盐与双溶剂的质量体积比为1：(5～20)。通过控制双溶剂中二乙二醇和乙二醇的体积比，以及双溶剂与铁盐的比例，可以进一步地提高了颗粒分散性，避免了颗粒团聚。此外本申请发明人还发现，若双溶剂中二乙二醇和乙二醇体积比不在上述范围，或铁盐与双溶剂不在上述范围，会导致铁氧颗粒在液相形成过程中发生团聚现象，分散性差，单分散金属纳米颗粒数量大幅降低，颗粒大小不均匀等。

该实施例中，通过加入丙烯酸钠和乙酸钠来进行热反应。本申请创新地采用了丙烯酸钠(不同于高价金属盐制备金属纳米颗粒的还原剂和表面活性剂等)，丙烯酸钠每一份可提供一份羧基，通过加入丙烯酸钠进行热反应，使得反应更温和；而且，过量的丙烯酸钠还可作为反应分散剂，进一步地防止了团聚，使得磁性纳米颗粒的制备条件更优化；同时，丙烯酸钠与加入的辅助剂乙酸钠进行静电稳定，有助于乙二醇介导的FeCl₃还原。

此外，向第一溶液中加入的丙烯酸钠和乙酸钠的质量比为(0.5～2)：1。例如0.5:1，1:1，1.5:1，2:1等。进一步地，铁盐与丙烯酸钠和乙酸钠二者之和的摩尔比为1：(10～40)。本申请通过引入丙烯酸钠，在优化反应条件的情况下，将其与辅助剂乙酸钠相配合，同时对二者的质量比以及加入总量进行控制和优化，通过丙烯酸钠与辅助剂乙酸钠静电稳定，有助于乙二醇介导还原铁盐；此外，过量的丙烯酸钠还可作为反应分散剂，进一步防止团聚，进一步确保了Fe₃O₄纳米颗粒的分散性，避免了因材料堵塞活性吸附位点而影响其应用的问题。

步骤S20，按比例称取磁性纳米颗粒Fe₃O₄，催化剂EDCI和HOBt，以及碱性氨基酸，加入到第二溶剂中混合均匀，搅拌反应1～2小时后，依次用乙醇和水清洗，最后进行干燥，得到富集陈皮酵素中黄酮类化合物的磁性材料C₂H₄O₂R@Fe₃O₄。其中，第二溶剂采用N，N-二甲基甲酰胺或无水甲苯或二氯甲烷中一种，能与多数有机溶剂混合，对其中的多种有机化合物有良好的溶解能力。碱性氨基酸是氨基酸结构侧链中含有-NH₂、-CN₃H₄、-C₃H₃N₂中的一种碱性化学基团。

优选地，所述碱性氨基酸，其结构通式可以为：

其中，R为C₄H₁₀N、C₄H₁₀N₃或C₄H₅N₂，即所述碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸或组氨酸。同时磁性材料离子态可表示为：

其中，左侧为内核Fe₃O₄，右侧中R为或/>

以双溶剂热反应制得的含羧基磁性纳米颗粒为内核，通过采用碱性氨基酸对其进行包覆，直接利用碱性氨基酸在中性pH条件下具有的碱性基团，自带电荷，直接提供反应所需的离子，并通过改进和优化后所确定的EDCI和HOBt作为酸胺缩合剂，表面微聚合反应，碱性氨基酸的氨基与Fe₃O₄的羧基发生亲核、缩合反应形成酰胺键，以共价键的方式有效地改善了磁性材料在水/有机溶剂中的分散性，且氨基酸丰富的羧基基团使材料具有良好亲水性能和静电作用。经检测制备得到的磁性材料(C₂H₄O₂R@Fe₃O₄)该材料形貌均匀，呈现球状，尺寸约100nm左右；另外也解决了传统吸附剂与离子之间的相互作用力弱，吸附效率低的问题。

此外，磁性纳米颗粒与碱性氨基酸的摩尔比为1：1～5。例如可以为1:1，1:3，1:5等；进一步地，所述磁性纳米颗粒、EDCI、HOBt的摩尔比为1：(0.5～2)：(0.5～2)；例如可以为1:0.5:0.5，1:1:1，1:1.5:1.5，1:2:2等。通过控制磁性纳米颗粒、与催化剂和碱性氨基酸的摩尔比，可使得碱性氨基酸的氨基与磁性纳米颗粒Fe₃O₄所富含的羧基有效完成亲核、缩合反应形成酰胺键，同时碱性氨基酸丰富羧基基团使材料具有更优异的亲水性能和静电作用。

该实施例通过二乙二醇与乙二醇双溶剂溶解铁盐，并加入丙烯酸钠和乙酸钠进行热反应，有效改善了传统磁性材料在制备过程中Fe₃O₄分散性差、易团聚、易堵塞活性吸附位点的问题，拓宽了该磁性材料的使用范围，制备得到富含羧基的无机颗粒Fe₃O₄，该颗粒分散性较好，形貌均匀，球状，颗粒尺寸大纳米级别；在催化剂EDCI和HOBt作用下采用碱性氨基酸直接提供反应所需离子对其进行包裹，制备得到的磁性材料，其形貌均匀，呈球状，分散性良好，可达纳米级别，该磁性材料尺寸为100±30nm，比表面积较大；该磁性材料羧基键丰富，在1400～1600cm^-1出现-COO-的反对称和对称震动(属于两个C＝O振动耦合)，具有丰富的羧酸COO-多电子共轭体系，该材料具有良好的亲水性能和静电作用。而且，制备条件温和、操作简便，制备成本低，具有重现性和稳定性好的优点。

下面结合具体制备实施例对本申请做更详细的说明：

制备实施例1-4中试剂及其用量比如下表1所示。

表1制备实施例1-4中试剂及其用量比

	制备实施例1	制备实施例2	制备实施例3	制备实施例4
					二乙二醇与乙二醇体积比	3:1	3：1	1.5：1	6：1
丙烯酸钠和乙酸钠的质量比	1:1	1：1	0.5：1	2:1
					氨基酸种类	精氨酸	组氨酸	赖氨酸	组氨酸
磁性纳米颗粒、氨基酸的摩尔比	1：5	1：1	1：2	1：5
					磁性纳米颗粒、EDCI、HOBt摩尔比	1：1：1	1：1：1	1：0.5：0.5	1：2：2

制备实施例1

1)取90mL二乙二醇和30mL乙二醇形成双溶剂，称取3.24gFeCl₃·6H₂O加入到该双溶剂中，搅拌溶解。再称取9g丙烯酸钠和9g乙酸钠倒入上述溶液中，搅拌溶解后，70℃加热1小时，最后倒入高压反应釜在200℃反应10小时；反应产物分别用乙醇和水洗涤3次，最后在70℃氮气氛围下干燥2小时，获得羧基修饰的Fe₃O₄纳米颗粒。

2)取10mL DMF，加入231.5mg羧基修饰的Fe₃O₄，依次加入191.7mg EDCI、135.1mgHOBt、870mg精氨酸，搅拌2小时后，用乙醇、水分别洗涤3次，在70℃氮气氛围下干燥，即得磁性材料精氨酸@Fe₃O₄。

制备实施例2

1)取90mL二乙二醇(DEG)和30mL乙二醇(EG)形成双溶液；称取3.24g FeCl₃·6H₂O加入该双溶液中，搅拌溶解；再称取9g丙烯酸钠、9g乙酸钠(NaAc)倒入上述溶液中，搅拌溶解后，70℃加热1小时，最后倒入高压反应釜180℃反应20小时。产物分别用乙醇和水洗涤3次，最后在70℃氮气氛围下干燥2小时，获得羧基修饰的Fe₃O₄。

2)取10mL DMF，加入231.5mg羧基修饰的Fe₃O₄，依次加入191.7mg EDCI、135.1mgHOBt、155mg组氨酸，搅拌1小时后，用乙醇、水分别洗涤3次，在70℃氮气氛围下干燥，即得磁性材料组氨酸@Fe₃O₄。

制备实施例3

1)取45mL二乙二醇和30mL乙二醇形成双溶剂，称取3.24gFeCl₃·6H₂O加入到该双溶剂中，搅拌溶解。再称取4.5g丙烯酸钠和9g乙酸钠倒入上述溶液中，搅拌溶解后，70℃加热1小时，最后倒入高压反应釜在200℃反应10小时；反应产物分别用乙醇和水洗涤3次，最后在70℃氮气氛围下干燥2小时，获得羧基修饰的Fe₃O₄。

2)取10mL DMF，加入231.5mg羧基修饰的Fe₃O₄，依次加入95.9mg EDCI、67.6mgHOBt、292.4mg赖氨酸，搅拌2小时后，用乙醇、水分别洗涤3次，在70℃氮气氛围下干燥，即得磁性材料赖氨酸@Fe₃O₄。

制备实施例4

1)取180mL二乙二醇和30mL乙二醇形成双溶剂，称取3.24gFeCl₃·6H₂O加入到该双溶剂中，搅拌溶解。再称取18g丙烯酸钠和9g乙酸钠倒入上述溶液中，搅拌溶解后，70℃加热1小时，最后倒入高压反应釜在200℃反应10小时；反应产物分别用乙醇和水洗涤3次，最后在70℃氮气氛围下干燥2小时，获得羧基修饰的Fe₃O₄。

2)取10mL DMF，加入231.5mg羧基修饰的Fe₃O₄，依次加入95.9mg EDCI、270.2mgHOBt、775mg组氨酸，搅拌2小时后，用乙醇、水分别洗涤3次，在70℃氮气氛围下干燥，即得磁性材料组氨酸@Fe₃O₄。

上述制备实施例1-4获得的磁性材料，其尺寸100±30nm，呈球状，分散性良好；该磁性材料羧基键丰富，具有丰富的羧酸COO-多电子共轭体系，由于含有羧酸COO-多电子共轭体系，两个C＝O振动偶合在红外图中出现强吸收，其红外图1400～1600cm^-1有明显的-COO^-反对称和对称伸缩振动峰，使得该磁性材料具有更优异的亲水性能和静电作用。

图3至图5分别示出了制备实施例1得到的磁性材料的扫描电镜图(SEM)、X射线衍射图(XRD)、红外图(IR)；其他制备实施例2-4得到的磁性材料的图谱与其类似，在此不做赘述。

如图3的扫描电镜图(SEM)所示，可以看出：本申请磁性材料形貌均匀，呈现球状，分散性良好，尺寸约100nm，比表面积较大。

如图4的X射线衍射图(XRD)所示，可以看出：本申请磁性材料与Fe₃O₄标准图谱(PDFCard No.：01-079-0418)峰一致。图中均观察到Fe₃O₄的特征(220)峰(2θ＝30.07°)、(311)峰(2θ＝35.42°)、(331)峰(2θ＝47.13°)、(400)峰(2θ＝43.04°)、(333)峰(2θ＝56.92°)、(440)峰(2θ＝62.51°)，可见，本申请制备出了具有磁性的Fe₃O₄材料。

如图5的红外图(IR)所示，可以看出：本申请磁性材料在1051cm^-1出现-C-O键的伸缩振动，吸收峰属醇C-OH；1701cm^-1出现-C＝O键的弯曲振动；2923cm^-1出现C-H键的吸收；1400～1600cm^-1出现明显的-COO-的反对称和对称伸缩振动，偶极矩大，在1405cm^-1和1544cm^-1吸收峰属于两个C＝O振动耦合，红外图中出现强吸收，具有丰富的羧酸COO^-多电子共轭体系，丰富的羧基使该材料具有良好的亲水性能和静电作用。

对比例1

与制备实施例1主要区别在于：以乙二醇为单溶剂，以柠檬酸钠为分散剂，制备四氧化三铁；以中性氨基酸盐(如酪氨酸盐酸盐)为改性原料，制备磁性产品。该对比例磁性产品的红外图显示，1236cm^-1吸收峰属C-O-C，1624cm^-1吸收峰属酰胺的C＝O，其共轭为氮原子上未共用电子对与羰基的p-π共轭，无法达到本申请实施例1磁性材料所含有丰富的羧酸COO-多电子共轭体系，该产品无法满足本申请在复杂食品介质中痕量黄酮类化合物的检测分析要求，更无法实现成本较低的直接、快速测定。

此外，发明人还对不同种类氨基酸做了进一步研究和分析：通过直接利用碱性氨基酸在中性pH条件下具有的碱性基团，自带正电荷，直接提供反应所需的离子，在酸胺缩合剂条件下进行聚合，能够获得本申请上述磁性材料。而采用中性氨基酸，如不带电荷的酪氨酸，无法实现本申请；而若要应用酪氨酸的修饰改性特性，如对比例1所述的必需通过采用氨基酸盐酸盐作为反应物，利用氯离子较强的氢键结合能力使氨基酸带电荷进而实现其修饰改性功能，而酪氨酸盐酸盐成本价格较高，是同一纯度下酪氨酸价格的一千倍，增加了制备成本，工艺更复杂，可见，本申请还克服了目前氨基酸需进行功能化修饰改性才能应用的局限性。

对比例2

与制备实施例1主要区别在于：以氨基酸改性溶液为改性原料，与纤维素反应；反应产物与四氧化三铁，50-70℃反应4h，得到纤维素复合产品。该对比例需先对氨基酸改性和处理才能应用，成本较高，应用条件受限。

对比例3

与制备实施例1主要区别在于：采用常规共沉淀法和水解法制备得到二氧化硅包四氧化三铁粒子，以改性后的大分子聚氨基酸户进行改性，得到粒径约200nm的吸附产品。该对比例需先对氨基酸改性和处理，成本较高，应用条件受限，同样无法达到本申请磁性材料所述含有丰富的羧酸COO-多电子共轭体系。

对比例4

与制备实施例1主要区别在于：以聚乙二醇和乙二醇为双溶剂，乙酸钠为分散剂，得到四氧化三铁产品，不进行氨基酸性能修饰。该对比例4得到的产品尺寸较大，一般在200～800nm。

此外，发明人进一步研究和分析发现：聚乙二醇是一种高分子聚合物，其防团聚性能是利用在前驱体上吸附，通过空间位阻稳定机制进行作用来控制尺寸；而二乙二醇主要根据库仑定律，颗粒表面形成极性电荷，利用同极性电荷的相互排斥作用阻止颗粒团聚，从而实现颗粒均匀分散。聚乙二醇与二乙二醇的作用原理不同，所获得的产品尺寸有明显差异，本发明所获得的含羧基四氧化三铁尺寸可达纳米级别，而对比例4为200～800nm；且以二乙二醇和乙二醇形成双溶剂相比上述高分子聚合物与乙二醇双溶剂，防止团聚效果更好。

上述对比例1-4所获得的产品，均无法达到本申请磁性材料所述含有丰富的羧酸COO-多电子共轭体系；无法满足本申请在复杂食品介质中痕量黄酮类化合物的检测分析要求，更无法实现成本较低的直接、快速测定。

本申请一实施例中还提供了上述磁性材料在分析陈皮酵素中黄酮类化合物中的应用。

应用时，先采用磁性材料萃取陈皮酵素中黄酮类化合物，黄酮类目标物吸附在磁性材料表面后，通过外部磁力从样品溶液中分离出来，使用少量合适的溶液对磁性材料上的黄酮类目标物进行洗脱；然后，对萃取后的洗脱液进行色谱检测，获得检测结果；最后，根据检测结果以及预先建立的标准线性方程，计算得到陈皮酵素中各黄酮类化合物的含量。实现了固相微萃取和磁性分离的结合，使用有机溶剂少、基团特异性吸附能力强、可操作性强、检测快速，可对复杂食品酵素中的黄酮类化合物进行高效萃取富集，总前处理时长较短。为复杂食品介质、环境及生物样品中痕量黄酮类化合物的快速、直接、灵敏分析夯实的基础。

在一可选实施例中，应用时可参考图2所示流程进行：

1)向食品陈皮酵素中加入该磁性材料，振荡吸附，使目标物物质黄酮类化合物吸附在该磁性材料的表面。其中，磁性材料的加入量为每克陈皮酵素加入10mg～100mg，例如10mg，20mg，40mg，60mg，80mg，100mg等，优选地低于50mg，在该范围下吸附率较优且还避免了材料浪费。

2)通过外部磁力(可以设置在下方)进行磁性分离，去除上清液，从而将吸附了黄酮类化合物的磁性材料从溶液中分离出来。

3)加入洗脱液，对磁性材料表面的黄酮类目标物进行洗脱，得到上层洗脱液，进入高效液相色谱，进行色谱分析。

4)根据预先建立的各黄酮类化合物浓度与峰面积的标准线性方程，以及色谱分析中各黄酮类化合物的峰面积，直接计算得到该食品陈皮酵素中黄酮类化合物的浓度，实现了多黄酮类化合物的同时检测。

与现有磁性材料-COO-的强度不同，本发明制得的磁性材料具有丰富的羧酸COO-多电子共轭体系，丰富羧基键，材料具有良好的亲水性能和静电作用，采用该磁性材料进行萃取及分析，可更有效对对样品中黄酮类化合物进行吸附，提高陈皮酵素中黄酮化合物灵敏度，减少基体效应，满足陈皮酵素等复杂基体中多种黄酮类化合物的同时检测。本发明制备条件温和、操作简便，价格低廉、重现性和稳定性好，可直接、快速完成分析。

其中，所述黄酮类化合物为维采宁-2、夏佛塔苷、橙皮苷、橙皮素、异橙黄酮和川陈皮素中的一种或几种。该磁性材料应用于食品陈皮酵素中黄酮类化合物的检测分析中，以物理吸附为主，化学吸附为辅，应用过程中无需调节pH值。作为磁性材料，其具有高选择吸附性，吸附能力强，对复杂食品酵素中多种黄酮类化合物的萃取富集程度高，在有效富集陈皮酵素中黄酮类化合物的同时还实现了多种黄酮类化合物的同时检测分析，克服了目前只能对陈皮酵素黄酮总含量测定的缺陷，为新会陈皮酵素生产过程中有效成分质量的控制提供了科学依据。而且，整个处理时长较短，有机溶剂少，可操作性强，检测快速，为复杂食品介质中痕量黄酮类化合物的快速、直接、灵敏分析夯实的基础。

下面结合具体应用实施例对本申请做更详细的说明：

应用实施例1

操作步骤：先向1g新会陈皮酵素中加入10mL蒸馏水，然后加入30mg磁性材料振荡30min进行萃取；取出磁性材料后加入甲醇超声5min进行脱附，再将脱附液过0.45μm有机滤膜，进高效液相色谱进行检测。其中，色谱柱使用Agilent Poroshell 120SB-C18(3.0mm x150mm,2.7μm)，紫外检测器设置波长为330nm。流动相梯度洗脱程序如表2所示。

表2洗脱程序

时间(min)	A相(水，％)	B相(乙腈，％)
			0	95	5
0.5	95	5
			10	5	100

表3为标准样品实验结果。采用不同浓度的标准溶液检测的数据，通过已知标准溶液浓度和检测结果(峰面积)的关系建立了标准线性方程。

表3磁性材料应用在加标目标样品中的实验结果

图6为萃取新会陈皮酵素样品后的色谱图。如图6所示，出峰时间依次为5.709；5.919；6.722；8.470；8.814；9.630。

图7为对照例未萃取的色谱图。对照例：先向1g新会陈皮酵素样品中加入10mL蒸馏水，直接加入10mL水200rpm恒温振荡提取30min；将上层溶液过0.45μm有机滤膜，然后直接进质谱分析。

图8为1ng/L六种黄酮类化合物的色谱图。该图中，色谱峰从左往右依次是维采宁-2、夏佛塔苷、橙皮苷、橙皮素、异橙黄酮、川陈皮素。出峰时间分别为5.705；5.909；6.698；8.458；8.797；9.625。

可见，采用该磁性材料可以高选择性富集维采宁-2、夏佛塔苷、橙皮苷、橙皮素、异橙黄酮、川陈皮素多种微量黄酮类化合物，消除了背景的干扰，基线更平稳。

应用实施例2

采用制备实施例2的组氨酸@Fe₃O₄磁性材料进行萃取，且取出磁性材料后加入1mL水超声5min进行脱附，再将脱附液进高效液相色谱进行检测，其他与应用实施例1相同。经检测，所获得的图谱与应用实施例1基本一致。

应用实施例3

采用制备实施例3的赖氨酸@Fe₃O₄磁性材料进行萃取，其他与应用实施例1相同。经检测，所获得的图谱与应用实施例1也基本一致。

应用实施例4

采用了制备实施例4的组氨酸@Fe₃O₄磁性材料进行萃取，其他与应用实施例1相同。经检测，所获得的图谱与应用实施例1也基本一致。

产品A-E中各黄酮目标物含量测定：

采用应用实施例1对新会陈皮酵素A-E产品(每个黄酮目标物检测3次)进行萃取，检测和分析；根据检测结果和表3所建立的线性方程进行定量计算，便可快速计算得到A-E产品中各黄酮目标物含量，具体如表4所示。

表4A-E产品中各黄酮目标物的含量计算结果(μg/g)

本发明的描述是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显然的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。

Claims

1.一种富集陈皮酵素中黄酮类化合物的磁性材料的制备方法，其特征在于，以双溶剂溶解铁盐，通过加入丙烯酸钠和乙酸钠热反应，制备得到含羧基磁性纳米颗粒；以所述含羧基磁性纳米颗粒为内核，以EDCI和HOBt为催化剂，通过与碱性氨基酸进行表面微聚合，制备得到磁性材料。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述双溶剂为二乙二醇和乙二醇。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸中的一种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括：

将二乙二醇和乙二醇制备得到双溶剂，将铁盐溶解在双溶剂中，加入丙烯酸钠和乙酸钠，在65℃～75℃下搅拌0.5～1.5小时，移至反应釜于180℃～200℃反应10～20小时，洗涤，氮气氛围干燥，得到磁性纳米颗粒；

将所述磁性纳米颗粒、EDCI、HOBt以及碱性氨基酸，加入到第二溶剂中混合均匀，搅拌反应1～2小时，清洗，干燥，得到所述磁性材料。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，

所述二乙二醇与乙二醇的体积比为(1.5～6)：1；所述铁盐与双溶剂的质量体积比为1：(5～20)；

和/或，所述丙烯酸钠和乙酸钠的质量比为(0.5～2)：1；所述铁盐与丙烯酸钠和乙酸钠二者之和的摩尔比为1：(10～40)。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，

所述磁性纳米颗粒与碱性氨基酸的摩尔比为1：1～5；所述磁性纳米颗粒、EDCI、HOBt的摩尔比为1：(0.5～2)：(0.5～2)；

和/或，所述第二溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或无水甲苯或二氯甲烷中一种。

7.一种富集陈皮酵素中黄酮类化合物的磁性材料，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到。

8.根据权利要求7所述的磁性材料，其特征在于，

所述磁性材料含有羧酸COO^-多电子共轭体系；由于含有羧酸COO^-多电子共轭体系，两个C＝O振动偶合在红外图中出现强吸收，在1400～1600cm^-1有-COO^-反对称和对称伸缩振动峰；

和/或，所述磁性材料的尺寸小于150nm。

9.一种磁性材料在分析陈皮酵素中黄酮类化合物中的应用，其特征在于，所述磁性材料为采用权利要求1-6任一项所述的富集陈皮酵素中黄酮类化合物的磁性材料的制备方法制备得到。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括：

采用磁性材料萃取陈皮酵素中黄酮类化合物；

对萃取后的洗脱液进行色谱检测，获得检测结果；

根据检测结果以及预先建立的标准线性方程，计算得到陈皮酵素中各黄酮类化合物的含量；

其中，磁性材料加入量为每克陈皮酵素加入10mg～100mg磁性材料；所述黄酮类化合物为维采宁-2、夏佛塔苷、橙皮苷、橙皮素、异橙黄酮和川陈皮素中的一种或几种。